專利名稱：含小檗堿的黃檗愈傷組織培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)的植株再生，以及未分化的人類、動物或植物細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到高含量小檗堿的黃檗愈傷組織培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
黃檗(Phello dendron amurense Rupr.)又名關(guān)黃柏、黃波羅，為蕓香科(Rutaceae)黃柏屬(Phellodendron)多年生落葉高大喬木，主要分布在我國的黑龍江、吉林、遼寧、河北等省，具有重要的經(jīng)濟(jì)和藥用價值。其內(nèi)皮(韌皮部)入藥，稱為關(guān)黃柏(產(chǎn)于四川等地的黃皮樹的內(nèi)皮則稱為川黃柏)，是我國傳統(tǒng)中藥黃柏的重要來源植物之一。黃檗已經(jīng)被國家列為二級保護(hù)植物和重點(diǎn)的植物保護(hù)資源，中國植物紅皮書將其列為漸危種。傳統(tǒng)的黃檗藥用方法主要是采取將黃檗立木扒皮，而黃檗的主要藥用成分為小檗堿，其在植株中含量低，且黃檗生長緩慢，剝皮嚴(yán)重影響著植株的生長甚至導(dǎo)致死亡，而且消耗大而產(chǎn)出很少，不利于黃檗資源的有效利用。早在20世紀(jì)50年代，人們就發(fā)現(xiàn)離體培養(yǎng)的高等植物細(xì)胞具有合成并積累植物次生代謝產(chǎn)物的潛力，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，用組織培養(yǎng)生產(chǎn)有用的次生代謝產(chǎn)物已成為可能并且取得了相當(dāng)大的成績。目前已有80多種藥用植物可通過組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)其體內(nèi)含的藥用有效成分，有30多種藥用植物細(xì)胞培養(yǎng)物累積的有效成分等于或高于原植物的含量，如人參皂苷、迷迭香酸等。為了更有效地保護(hù)黃檗資源，利用細(xì)胞或組織培養(yǎng)生產(chǎn)天然產(chǎn)物藥物是開發(fā)利用珍貴藥用資源的重要途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于克服上述利用的不足之處，提供一種含小檗堿較高的黃檗愈傷組織培養(yǎng)方法以及適應(yīng)該方法所用的培養(yǎng)基。解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是它包括以下步驟(I)外植體制備材料消毒在超凈工作臺上將取下的黃檗葉或黃檗莖段在70%的酒精中浸泡15-20秒，再用10%的次氯酸鈉消毒8分鐘，期間不斷搖動，然后用無菌水沖洗3-5次，每次2分鐘，用無菌濾紙吸干表面水分；(2)愈傷組織誘導(dǎo)將(I)中處理好的黃檗葉片切成0. 5X0. 5cm2的切塊，黃檗莖段切成0. 5cm長的切段接入誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織，該誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基為在I升MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成蔗糖20 -40 g
瓊脂粉5.8 7.6 g
2，4_二氯苯氧乙酸 0.5 2.5 mg
6—(節(jié)胺基)嘌呤0.5 2.0 mgpH為5. 8，配制好的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基分裝在培養(yǎng)瓶中，每瓶25毫升，蓋好瓶蓋，在壓力為0. I 0. 15MPa下滅菌30分鐘，將培養(yǎng)瓶置于溫度為22 26°C、光照強(qiáng)度為40 u mo I m_2 s—1的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，每天光照12 14小時，培養(yǎng)15 20天，待黃檗愈傷組織形成葉后，繼續(xù)培養(yǎng)30 50天，至黃檗愈傷組織褐化。本發(fā)明培養(yǎng)方法中所用的優(yōu)選誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基為I升MS培養(yǎng)基中加入下述 的原料及其配比制成
鹿糖25 35 g
瓊脂粉6 2 7.2 g
2，4_二氯苯氧乙酸 I 5 2.5 mg
6-(芐胺基)嘌呤0.8 1.5 mg本發(fā)明培養(yǎng)方法中所用的最用的最佳誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基為在I升MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及配比制成
蔗糖30 g
瓊脂粉6.8 g
24一二氯苯氧乙酸2.0 mg
6—(芐胺基)嘌呤LOmg本發(fā)明培養(yǎng)方法采用喜樹葉或莖段為外植體，在MS基本培養(yǎng)基中加入蔗糖、瓊脂粉、2，4 一二氯苯氧乙酸、6-(芐胺基)嘌呤的培養(yǎng)基中組織培養(yǎng)，得到黃檗愈傷組織。采用本發(fā)明組織培養(yǎng)方法以及使用的培養(yǎng)基所培養(yǎng)的褐化黃檗愈傷組織，經(jīng)高效液相法檢測，本發(fā)明方法所得到的愈傷組織中小檗堿的含量為5. 4%以上，高于現(xiàn)有報道的黃檗枝葉中和黃檗皮中的小檗堿的含量。本發(fā)明培養(yǎng)方法以及所采用的培養(yǎng)基，可用于黃檗愈傷組織的培養(yǎng)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)例對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例I(I)外植體制備材料消毒在超凈工作臺上將取下的黃檗葉或黃檗莖段在70%的酒精中浸泡15-20秒，再用10%的次氯酸鈉消毒8分鐘，期間不斷搖動，然后用無菌水沖洗3-5次，每次2分鐘，用無菌濾紙吸干表面水分；(2)愈傷組織誘導(dǎo)將(I)中處理好的黃檗葉片切成0. 5X0. 5 I. Ocm2的切塊，黃檗莖段切成0. 5
I.Ocm長的切段接入誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織，該誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基為在I升MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成
蔗糖30 g
_脂粉6.8 g
2，4_二氯苯氧乙酸 2.0 mg
6-(芐胺基)嘌呤1.0 mgpH為5. 8，配制好的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基分裝在培養(yǎng)瓶中，每瓶25毫升，蓋好瓶蓋，在壓力為0. I 0. 15MPa下滅菌30分鐘，將培養(yǎng)瓶置于溫度為22 26°C、光照強(qiáng)度為40 u mo I m_2 s—1的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，每天光照12 14小時，培養(yǎng)15 20天，葉切塊明顯增厚，體積膨大，葉切塊切口周圍先形成黃檗愈傷組織，莖段切段兩端先形成愈傷組織，然后整個切段形成黃檗愈傷組織。黃檗愈傷組織質(zhì)地疏松，呈淡綠色，繼續(xù)培養(yǎng)30 50天，黃檗愈傷組織褐化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，葉片的誘導(dǎo)率為93. 5%，莖段的誘導(dǎo)率為90. 8%。實(shí)施例2在本實(shí)施例的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)步驟中，所用的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基為在I升MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成
蔗糖20 g
瓊脂粉5.8 g
2，4—二氯苯氧乙酸 1.0 mg
6—(芐胺基)嘌呤0.5 mg在本實(shí)施例中，其它培養(yǎng)步驟與實(shí)施例I相同。實(shí)施例3在本實(shí)施例的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)步驟中，所用的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基為在I升MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成蔗糖40 g
瓊脂粉7.6 g
2，4—二氯苯氧乙酸 2.5 mg
6 —(芐胺基)嘌呤2.0 mg在本實(shí)施例中，其它培養(yǎng)步驟與實(shí)施例I相同。實(shí)施例4在本實(shí)施例的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)步驟中，所用的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基為在I升MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成
蔗糖20 g
瓊脂粉7.6 g
2, 4—二氯苯氧乙酸 2.5 mg
6—(芐胺基)嘌呤2.0 mg在本實(shí)施例中，其它培養(yǎng)步驟與實(shí)施例I相同。實(shí)施例5在本實(shí)施例的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)步驟中，所用的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基為在I升MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成
蔗糖40 g
瓊脂粉5.8 g
2，4_二氯苯氧乙酸2.5 mg
6 —(芐胺基)嘌呤2.0 mg 在本實(shí)施例中，其它培養(yǎng)步驟與實(shí)施例I相同。實(shí)施例6在本實(shí)施例的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)步驟中，所用的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基為在I升MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成蔗糖40 g
瓊脂粉7 6 g
2，4_二氯苯氧乙酸0.5 mg
6—(芐胺基)嘌呤2.0 mg在本實(shí)施例中，其它培養(yǎng)步驟 與實(shí)施例I相同。實(shí)施例I在本實(shí)施例的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)步驟中，所用的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基為在I升MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成
蔗糖40 g
瓊脂粉7.6 g
2，4—二氯苯氧乙酸2.5 mg
6-(芐胺基)嘌呤0.5 mg在本實(shí)施例中，其它培養(yǎng)步驟與實(shí)施例I相同。實(shí)施例8在本實(shí)施例的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)步驟中，所用的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基為在I升MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成
蔗糖20 g
瓊脂粉5.8 g
2, 4—二氯苯氧乙酸2.5 mg
6—(芐胺基)嘌呤2.0 mg在本實(shí)施例中，其它培養(yǎng)步驟與實(shí)施例I相同。實(shí)施例9在本實(shí)施例的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)步驟中，所用的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基為在I升MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成蔗糖20 g
瓊脂粉7.6 g
2，4一二氯苯氧乙酸0.5 mg
6—(芐胺基)嘌呤2.0 mg在本實(shí)施例中，其它培養(yǎng)步驟與實(shí)施例I相同。實(shí)施例10在本實(shí)施例的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)步驟中，所用的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基為在I升MS·基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成
蔗糖20 g
瓊脂粉I 6 g
2，4—二氯苯氧乙酸2.0 mg
6—(芐胺基)嘌呤0.5 mg在本實(shí)施例中，其它培養(yǎng)步驟與實(shí)施例I相同。實(shí)施例11在本實(shí)施例的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)步驟中，所用的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基為在I升MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成
蔗糖40 g
瓊脂粉5 8 g
24_二氯苯氧乙酸0.5 mg
6—(芐胺基)嘌呤2.0 mg在本實(shí)施例中，其它培養(yǎng)步驟與實(shí)施例I相同。實(shí)施例12在本實(shí)施例的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)步驟中，所用的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基為在I升MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成蔗糖40 g
瓊脂粉5.8 g
2，4_ 二氯苯氧乙酸 2.5 mg
6—(節(jié)胺基)嘌呤0.5 mg在本實(shí)施例中，其它培養(yǎng)步驟與實(shí)施例I相同。實(shí)施例13在本實(shí)施例的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)步驟中，所用的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基為在I升MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成
蔗糖40 g
瓊脂粉7 6 g
24一二氯苯氧乙酸 1.0 mg
6—(芐胺基)嘌呤0.5 mg在本實(shí)施例中，其它培養(yǎng)步驟與實(shí)施例I相同。實(shí)施例14在本實(shí)施例的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)步驟中，所用的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基為在I升MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成
蔗糖20 g
_脂粉5.8 g
2，4_二氯苯氧乙酸1.0 mg
6-(芐胺基)嘌呤2.0 mg在本實(shí)施例中，其它培養(yǎng)步驟與實(shí)施例I相同。實(shí)施例15在本實(shí)施例的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)步驟中，所用的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基為在I升MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成蔗糖20 g
瓊脂粉5 8 g
2，4—二氯苯氧乙酸 2.0 mg
6—(芐胺基)嘌呤0.5 mg在本實(shí)施例中，其它培養(yǎng)步驟與實(shí) 施例I相同。實(shí)施例16在本實(shí)施例的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)步驟中，所用的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基為在I升MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成
蔗糖20 g
瓊脂粉7.6 g
2，4—二氯苯氧乙酸 LOmg
6—(芐胺基)嘌呤0.5 mg在本實(shí)施例中，其它培養(yǎng)步驟與實(shí)施例I相同。實(shí)施例17在本實(shí)施例的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)步驟中，所用的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基為在I升MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成
蔗糖40 g
瓊脂粉5 8 g
24_ 二氯苯氧乙酸l.Omg
6—(芐胺基)嘌呤0.5 mg在本實(shí)施例中，其它培養(yǎng)步驟與實(shí)施例I相同。實(shí)施例18在以上實(shí)施例I 17，愈傷組織誘導(dǎo)工藝步驟中，將黃檗葉片切成I. OX I. Ocm2的切塊，黃檗莖段切成I. Ocm長的切段接入誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織，所用的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基與相應(yīng)的實(shí)施例相同。為了驗(yàn)證本發(fā)明培養(yǎng)方法的可行性以及愈傷組織培養(yǎng)基的最佳配比，發(fā)明人進(jìn)行了大量研究和實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)，并采用本發(fā)明實(shí)施例I的培養(yǎng)方法和誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基在實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)出的黃檗愈傷組織中小檗堿含量進(jìn)行了對比實(shí)驗(yàn)，情況如下實(shí)驗(yàn)材料黃檗葉、黃檗枝、黃檗莖皮、小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品、MS培養(yǎng)基、2，4 一二氯苯氧乙酸、6—(節(jié)胺基)嘌呤、瓊脂粉、蔗糖、甲醇(分析純)、無水乙醇(分析純)、磷酸(分析純)、乙腈(色譜純)，2，4_二氯苯氧乙酸實(shí)驗(yàn)時名稱為2，4-D，6-(芐胺基)嘌呤實(shí)驗(yàn)時名稱為6-BA。材料提供單位黃檗葉、黃檗枝和黃檗莖皮由東北林業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)林場提供，MS基本培養(yǎng)基按照《植物組織培養(yǎng)》一書MS基本培養(yǎng)基配方由東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組培實(shí)驗(yàn)室配制，2，4_ 二氯苯氧乙酸和6-(芐胺基)嘌呤由Sigma公司生產(chǎn)，瓊脂粉由北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司生產(chǎn)，蔗糖、甲醇(分析純)、無水乙醇(分析純)市售，乙腈(色譜純)由美國Tedia公司生產(chǎn)，小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品購自中國藥檢所。實(shí)驗(yàn)儀器超凈工作臺、容量瓶、Waters高效液相色譜儀(Waters公司)，色譜柱、KQ-100DB超聲波儀由江蘇昆山超聲儀器公司生產(chǎn)。實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果I、黃檗愈傷組織誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)將黃檗的葉片和莖段分別接種在I升MS基本培養(yǎng)基中加入蔗糖30g、瓊脂粉6. 8g及不同種類和不同濃度激素的培養(yǎng)基上，30天后統(tǒng)計黃檗愈傷組織誘導(dǎo)率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表
Io表I黃檗愈傷組織誘導(dǎo)率
權(quán)利要求
1.一種含小檗堿的黃檗愈傷組織培養(yǎng)方法，其特征在于它包括如下步驟 (1)外植體制備 材料消毒在超凈工作臺上將取下的黃檗葉或黃檗莖段在70%的酒精中浸泡15-20秒，再用10%的次氯酸鈉消毒8分鐘，期間不斷搖動，然后用無菌水沖洗3-5次，每次2分鐘，用無菌濾紙吸干表面水分； (2)愈傷組織誘導(dǎo) 將(I)中處理好的黃檗葉片切成0.5X0. 5 LOcm2的切塊，黃檗莖段切成0. 5 I. Ocm長的切段接入誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織，該誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基為在I升MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成蔗糖20 40 g 瓊脂粉5.8 7.6 g2, 4—二氯苯氧乙酸 0 5 2.5 mg6—(芐胺基)嘌呤0.5 2.0 mg pH為5. 8，配制好的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基分裝在培養(yǎng)瓶中，每瓶25毫升，蓋好瓶蓋，在壓力為0. I 0. 15MPa下滅菌30分鐘，將培養(yǎng)瓶置于溫度為22 26°C、光照強(qiáng)度為40 u mo I m_2 s—1的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，每天光照12 14小時，培養(yǎng)15 20天，待黃檗愈傷組織形成葉后，繼續(xù)培養(yǎng)30 50天，至黃檗愈傷組織褐化。
2.按照權(quán)利要求I所述的含小檗堿的黃檗愈傷組織培養(yǎng)方法，其中誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基為在I升MS培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成蔗糖25 35 g瓊脂粉6.2 7.2 g2 4_二氯苯氧乙酸 1.5 2.5 mg.6-(芐胺基)嘌呤0 8 1.5 mg。
3.按照權(quán)利要求I所述的含小檗堿的黃檗愈傷組織培養(yǎng)方法，其中誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基為在I升MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及配比制成蔗糖30 g瓊脂粉6 8 g .2，4一二氯苯氧乙酸 2.0 mg .6-(芐胺基)嘌呤1.0 mg。
全文摘要
一種含小檗堿的黃檗愈傷組織培養(yǎng)方法，包括(1)制備外植體；(2)愈傷組織誘導(dǎo)將(1)處理的黃檗葉片切成0.5×0.5～1.0cm2的塊，黃檗莖段切成0.5～1.0cm長的段接入誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織。該誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基為在1升MS基本培養(yǎng)基中加入蔗糖20～40g，瓊脂粉5.8～7.6g、2，4－二氯苯氧乙酸0.5～2.5mg，6－(芐胺基)嘌呤0.5～2.0mg，pH為5.8，配制好的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基分裝地培養(yǎng)瓶中，每瓶25毫升，在壓力為0.1～0.15MPa下滅菌25分鐘，將培養(yǎng)瓶置于溫度為22～26℃、光照強(qiáng)度為40μmol·m-2·s-1的溫度中培養(yǎng)，每天光照12～14小時，培養(yǎng)15～20天，待黃檗愈傷組織形成葉后，繼續(xù)培養(yǎng)30～50天，至黃檗愈傷組織褐化。
文檔編號A01H4/00GK102742505SQ201210252230
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月20日
發(fā)明者劉彤, 周志強(qiáng), 張玉紅, 曲偉娣, 溫慧, 金鳳新 申請人:東北林業(yè)大學(xué), 周志強(qiáng), 張玉紅