專利名稱：一種黃曲霉毒素吸附劑及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于食品生物技術領域，涉及一種黃曲霉毒素吸附劑及其應用，具體的說，該黃曲霉毒素吸附劑是一種含有中藥渣和滅活乳酸菌的動物保健品。
背景技術：
黃曲霉毒素(Aflatoxin, AFT)是由黃曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(A.parasiticus)等真菌產(chǎn)生的一組結構極其相似的、具有強致癌性的有毒次生代謝物，常見的有81、82、61、62』1、112六種。其中以黃曲霉毒素BI毒性最強，M1、G1次之，B2、G2較弱。黃曲霉對生存環(huán)境要求不高，是一種非常粗生的霉菌，在自然環(huán)境中極易生長、繁殖和產(chǎn)毒。特別容易在玉米、花生、棉子及其餅柏等動物性飼料中生長。同時，AFT毒性極強、不易破壞，并且對畜禽造成嚴重的免疫抑制。AFT主要的靶器官是肝臟，對肺、心肌層和腎也有損害，而且能在大腦中積累，高濃度黃曲霉毒素對一些物種有致畸作用。目前，對飼料中AFT去除的方法主要有物理法、化學法和生物法三大類。如采用活性炭、硅鋁酸鹽類和葡甘聚糖等吸附飼料中的AFT后一并排除體外，其中以硅鋁酸鹽類吸附劑應用最為廣泛。諾維信公司公開了采用漆酶、角質酶和羧肽酶降解AFT方法(發(fā)明專利，CN 101959425 A)，沈陽科豐牧業(yè)科技有限公司公開了采用產(chǎn)脘假絲酵母、糞腸球菌、嗜酸乳桿菌和枯草芽孢桿菌的混合制劑降解AFT的方法(發(fā)明專利，CN 101812406 A)。中草藥是祖國傳統(tǒng)醫(yī)學的重要組成部分，中草藥正逐步走向世界。近年來，國內外市場對中藥需求的快速增長，中藥材提取加工后產(chǎn)生的中藥渣也越來越多。目前，全國中成藥廠每年產(chǎn)生的藥渣可達1000萬噸以上，其中90%以上的藥渣作為廢料垃圾掩埋或焚燒，這樣處理，對地下水和大氣環(huán)境帶來相當大的污染，同時也是一種嚴重的資源浪費。中草藥是純天然物質，無毒無害、無殘留、無耐藥性，安全可靠，而且兼有營養(yǎng)和藥效雙重功能，因而受到我國畜牧工作者的重視。利用中草藥或其藥渣，煎湯或研磨成細末，制成單方或復方制劑，在普通飼養(yǎng)條件下，將制劑添加于動物日糧中，以預防動物疾病、促進生長、提高生產(chǎn)性能或改善畜禽產(chǎn)品質量，這種制劑稱為中草藥飼料添加劑。但是，由于許多中草藥資源有限，價格不菲，在動物生產(chǎn)中應用成本較高，所以很推廣使用。經(jīng)過提取后的中藥渣中除含有大量的纖維素、木質素外，仍殘留有相當多的有效成分。作為飼料添加劑具有一定的防病促長功能。將中藥渣作為飼料添加劑對動物生長具有良好的促進作用，同時節(jié)約資源和成本，在替代中藥材用作飼料添加劑方面有很大的潛力。

發(fā)明內容
為解決上述現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種黃曲霉毒素吸附劑，該吸附劑是一種由中藥渣粉和乳酸菌組成的，能夠抑制飼料貯藏過程中黃曲霉毒素產(chǎn)生菌合成黃曲霉毒素(AFT)的飼料添加劑。本發(fā)明提供的由中藥渣粉和乳酸菌組成的飼料添加齊U，可吸附飼料中的黃曲霉毒素并隨糞便排出體外，對動物內臟起到保護作用。本發(fā)明的另一目的在于 提供上述黃曲霉毒素吸附劑的應用。
本發(fā)明的目的通過以下技術方案實現(xiàn):一種黃曲霉毒素吸附劑，該吸附劑是由中藥渣粉和乳酸菌混合制成。每IOOkg上述吸附劑中，中藥渣粉的含量為50 90kg，乳酸菌的含量為IO14 IO16個細胞。所述中藥渣粉是細度為60目 200目的中藥渣粉，含水量為6% 12%。所述中藥渣粉為板藍根、雞骨草和金銀花水浸提取后的藥渣混合物，為廣東涼茶生產(chǎn)后的廢料，對其混合比例不作限定。所述乳酸菌是乳酸菌和滅活乳酸菌制劑中的一種或兩者的混合物。所述乳酸菌可采用滅活乳酸菌制劑，根據(jù)其所含菌數(shù)調節(jié)添加劑量。所述乳酸菌是嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌、短雙歧桿菌和唾液乳桿菌中的一種以上。所述滅活乳酸菌制劑是將所述乳酸菌經(jīng)70 100°C高溫處理10 20min，得到滅活乳Ife囷制劑。所述黃曲霉毒素吸附劑為粉劑、顆粒劑或片劑。所述黃曲霉毒素吸附劑可用作飼料添加劑，應用于飼料貯藏階段，也可在養(yǎng)殖場使用。本發(fā)明的原理是:平板抑菌實驗考察中藥渣粉的水提取物對黃曲霉生長的抑制效果結果表明中藥渣中含有可以有效抑制黃曲霉生長的物質，從而使以其為原料制備的黃曲霉素吸附劑也具有抑制黃曲霉生長的效果。本發(fā)明利用板藍根、雞骨草和金銀花水提取后的藥渣作為乳酸菌吸附劑，開發(fā)可吸附飼料中黃曲霉毒素的飼用復合微生態(tài)制劑，黃曲霉毒素吸附劑中是將中藥渣粉作為乳酸菌及其代謝產(chǎn)物的吸附劑，將菌體和乳酸菌代謝產(chǎn)物吸附在中藥渣顆粒表面。該飼用微生態(tài)制劑具有促進動物消化吸收、調節(jié)動物腸道微生態(tài)平衡，同時由于利用了三種中藥殘留藥效成分，使其具有清熱祛濕之功效，尤其適合在南方養(yǎng)殖區(qū)域使用，可促進動物生長、保證動物健康及提高畜產(chǎn)品品質。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果:本發(fā)明的黃曲霉毒素吸附劑通過多組分間的相互配合和作用，防治飼料中的黃曲霉毒素影響動物健康，提高動物健康水平，其優(yōu)點如下:(I)中藥渣中殘余的黃酮類物質可抑制黃曲霉毒素產(chǎn)生菌合成毒素；(2)中藥渣中粗纖維及其木質素具有較大的表面積，對黃曲霉毒素具有吸附作用；(3)本發(fā)明的黃曲霉毒素吸附劑中乳酸菌對黃曲霉毒素具有吸附作用，可與中藥渣中難降解組分一起吸附飼料中的黃曲霉毒素并隨動物糞便排出體外，滅活乳酸菌細胞的使用使產(chǎn)品效果更穩(wěn)定；(4)本發(fā)明使用的滅活乳酸菌制劑中的滅活乳酸菌細胞可吸附到小腸上皮粘膜細胞，起到防止動物腸道病原菌侵染的效果；(5)中藥渣和滅活乳酸菌制劑中的滅活乳酸菌細胞對于保護動物健康具有協(xié)同增效的作用，且該吸附劑對于幼齡動物具有較好的保健效果；(6)通過本發(fā)明，中藥渣得到資源化利用，從而實現(xiàn)中草藥全藥利用。
同時，本發(fā)明不僅減少了中藥渣對環(huán)境的污染，并且使藥渣中殘留的藥效成分被再次利用，使日益緊缺的中藥材資源得到了更充分合理有效的利用，提高了產(chǎn)品的附加值，對于環(huán)境保護和廢物資源化利用均具有重要意義。


圖1為實施例1中中藥渣粉的水提取物對黃曲霉As3.4408的生長及其合成黃曲
霉毒素的影響。圖2實施例4的黃曲霉毒素吸附劑對黃曲霉毒素的體外吸附實驗結果。圖3實施例5中黃曲霉毒素吸附劑對飼料中黃曲霉As3.4408合成黃曲霉毒素的影響。圖4實施例6中黃曲霉毒素吸附劑的飼養(yǎng)效果實驗結果。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例1通過平板抑菌實驗考察中藥渣粉的水提取物對黃曲霉As3.4408(現(xiàn)保藏在中國微生物菌種保藏中心，現(xiàn)用編號為CGMCC3.4408)生長的抑制效果，該實驗研究過程的實驗方法如下:(I)中藥渣水提取物的制備:將板藍根、雞骨草和金銀花水提取后的混合藥渣Ikg(廣藥集團提供)于5L沸水中煮沸10分鐘后，過濾，濾液經(jīng)濃縮除去2/3的水分，再通過冷凍干燥升華剩余水分，獲得中藥渣水提取物。(2)制作含中藥渣水提取物的PDA培養(yǎng)基:稱取中藥渣水提取物溶解于蒸餾水配制成溶液，然后用此溶液按常規(guī)方法配制含中藥渣提取物的PDA固體培養(yǎng)基，滅菌后倒入滅菌平皿(直徑9cm)，制成含中藥渣提取物的PDA平板，用0.1g中藥渣水提取物溶于IOOml蒸餾水得到的溶液制得的PDA平板標記為B，用Ig中藥渣水提取物溶于IOOml蒸餾水得到的溶液制得的PDA平板標記為C。用蒸餾水按常規(guī)方法配制PDA固體培養(yǎng)基，滅菌后倒入滅菌平皿(直徑9cm)，制成用于對比的PDA平板，標記為A。(3)接種培養(yǎng):將黃曲霉As3.4408菌株轉接于PDA斜面培養(yǎng)基，28°C恒溫培養(yǎng)5d，用接種針無菌點接于含中藥渣提取物的PDA平板及用于對比的PDA平板中央，28°C恒溫培養(yǎng)4d，采用365nm紫外光照射下拍照觀察，黃曲霉毒素在365nm紫外光下激發(fā)熒光，菌落周圍熒光強弱(對應圖片中菌落周圍的白色光圈的亮度)反應出黃曲霉毒素濃度的高低。實驗結果見圖1，圖中，與對比的PDA平板比較，含中藥渣提取物的PDA平板接種培養(yǎng)后的菌落直徑顯著減小，而且，隨著中藥渣提取物濃度的提高，菌落直徑及周圍光圈亮度隨之減小，表明中藥渣粉的水提取物對黃曲霉As3.4408生長的抑制效果顯著，即中藥渣中含有可以有效抑制黃曲霉As3.4408生長的物質，從而使以其為原料制備的黃曲霉素吸附劑也具有抑制黃曲霉As3.4408生長的效果。實施例2黃曲霉毒素吸附劑的制備方法如下:
1.滅活乳酸菌制劑的制備方法如下:(I)菌種活化:將所需乳酸菌菌株嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌和唾液乳桿菌菌株分別接種IOOuL到IOmL MRS液體培養(yǎng)基(是一種常用的乳桿菌培養(yǎng)基，配方略)，37°C靜置培養(yǎng)24h，得到活化后的乳酸菌菌株嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌和唾液乳桿菌菌株。(2)種子液制備:將活化后的乳酸菌菌株嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌和唾液乳桿菌菌株分別接種IOmL到IOOOmL MRS液體培養(yǎng)基，37°C靜置培養(yǎng)16h，制備得到種子液。(3)發(fā)酵:分別轉接用各種菌株制備的種子液500mL至裝有IOL發(fā)酵培養(yǎng)基的14L發(fā)酵罐中，200轉/分鐘攪拌，37 0C，自動反饋控制添加10% NaOH調節(jié)pH為6.2，發(fā)酵24h，然后升溫至80°C，保溫15分鐘，殺死乳酸菌活細胞，得到發(fā)酵液。發(fā)酵培養(yǎng)基的配方如下:
蛋白胨50g牛肉膏50g
酵母提取物50gK2HPO420g
乳清粉50gMgSO4 H2O2g
吐溫80IOmL水IOL
pH6.8115°C滅菌，20min(4)發(fā)酵液的濃縮與干燥:采用旋轉蒸發(fā)儀在70°C下將發(fā)酵液濃縮除去1/2的水分，用噴霧干燥機進行噴霧干燥，進風溫度設定為170°C、物料溫度60°C、壓力l.0MPa，得到滅活乳酸菌制劑。2.將板藍根、雞骨草和金銀花經(jīng)過水提取后的混合藥渣(來源于廣藥集團)干燥后粉碎，過80目篩得到中藥渣粉(含水量12% )，稱取8kg中藥渣粉，加入嗜酸乳桿菌和滅活干酪乳桿菌制劑共2kg (質量比例為1:1)，混合均勻，使乳酸菌的含量為I X IOltl個細胞/g，混合均勻后得黃曲霉毒素吸附劑，記為吸附劑A。實施例3將板藍根、雞骨草和金銀花水提取后的混合藥渣(廣藥集團提供)干燥后粉碎，過60目篩后得到中藥渣粉(含水量10% )，稱取9kg中藥渣粉，加入植物乳桿菌和滅活唾液乳桿菌菌粉Ikg (質量比例為1:1)，混合均勻，使乳酸菌的含量為I X IOltl個細胞/g，滅活唾液乳桿菌制劑按實施例2的制備方法制備，同時步驟(3)中升溫至100°C，保溫處理lOmin，其他制備條件不變；混合均勻后得黃曲霉毒素吸附劑，記為吸附劑B。實施例4對實施例2 3制備的黃曲霉毒素吸附劑對黃曲霉毒素的體外吸附效果進行實驗分析。取兩只IOml離心管,分別加入磷酸鹽緩沖溶液(pH = 7.4) 5ml,再分別加入20mg實施例I制備的吸附劑A和20mg實施例2制備的吸附劑B，得到混合溶液，然后分別在混合溶液中加入黃曲霉毒素BI (FERMENTEK公司)使其終濃度為50ppb，制得黃曲霉毒素磷酸鹽緩沖溶液，分別標記為A和B。采用不添加中藥渣時的乳酸菌進行對照實驗，即向5mL黃曲霉毒素磷酸鹽緩沖溶液中添加嗜酸乳桿菌和滅活干酪乳桿菌菌粉Ig(質量比例為1: 1)，使其中的乳酸菌含量為2X IO9個細胞/mL，然后加入黃曲霉毒素BI (FERMENTEK公司)使其終濃度為50ppb，標記為AO ;再另取5mL黃曲霉毒素磷酸鹽緩沖溶液，添加植物乳桿菌和滅活唾液乳桿菌菌粉Ig(質量比例為1: 1)，使其中的乳酸菌含量為2X109個細胞/mL，然后加入黃曲霉毒素BI (FERMENTEK公司)使其終濃度為50ppb，標記為BO ;每個樣品設3個重復。將離心管在恒溫振蕩器上160rpm，37°C振蕩60min，然后將離心管置高速離心機上于8000rpm，4°C離心lOmin，分別取上清液，采用國標法(GB/T18980-2003，免疫親和層析高效液相色譜法)測定黃曲霉毒素BI含量。黃曲霉毒素吸附劑的吸附效能⑶計算方法如下:
D= (50X5-MXV) X 1000/20 (ng/g)注:M-上清液中黃曲霉毒素BI的濃度，ng/mlV-上清液總體積D-每g吸附劑干粉所吸附的黃曲霉毒素BI的量(ng)實驗結果見圖2，AO、B0、Al、BI 的 D 值分別為 38.4±7.3、33±3、39.2±6.2、
37.1±5.1，與用雞日糧(D = 10.2±4.4)(即向含有黃曲霉毒素的磷酸鹽緩沖溶液中添加日糧)進行的吸附試驗相比較，AO、BO、A、B四種黃曲霉毒素吸附劑的對黃曲霉毒素的清除效果達到極顯著水平(P < 0.001)。可見，添加本實驗制備的黃曲霉毒素吸附劑，通過對黃曲霉毒素進行吸附，可以有效清除黃曲霉毒素。實施例5黃曲霉毒素吸附劑對飼料中黃曲霉As3.4408合成黃曲霉毒素的影響研究，方法如下:取5份雞日糧，每一份lkg，其中I份不添加任何物質，作為對比，記為CK，取兩份分別添加實施例1所得的吸附劑A，添加量為每kg飼料添加Ig和2g，混合均勻，得到Al (黃曲霉毒素吸附劑的添加量為0.1% )和A2(黃曲霉毒素吸附劑的添加量為0.2% );剩下兩份每一份添加實施例2所得的吸附劑B，添加量分別為每kg飼料添加Ig和2g，混合均勻，得到BI (黃曲霉毒素吸附劑的添加量為0.1% )和B2(黃曲霉毒素吸附劑的添加量為0.2% );向以上5份雞日糧中分別加水至含水量50 %，接種黃曲霉As3.4408，28°C恒溫培養(yǎng)4d，采用國標法(GB/T18980-2003，免疫親和層析高效液相色譜法)測定飼料中的黃曲霉毒素BI的含量。實驗結果見圖3。對照組CK，即空白日糧中黃曲霉毒素含量為4340.34± 1009.92 μ g/kg，A2試驗組黃曲霉毒素含量為3400.9 ±490.29 μ g/kg，顯著低于對照組(P < 0.001) ；B1和B2試驗組黃曲霉毒素含量分別為3980.23±200.32 μ g/kg和3600.36±863.23μ g/kg，也顯著低于對照組黃曲霉毒素含量水平(p < 0.05)?？梢?，黃曲霉毒素吸附劑對飼料中黃曲霉毒素BI生物合成的抑制效果是顯著的，并且吸附劑用量越大，對黃曲霉毒素BI生物合成的抑制效果越顯著。實施例6對黃曲霉毒素吸附劑的飼養(yǎng)效果進行實驗研究，在受到黃曲霉毒素輕度污染的肉雞日糧中添加實施例1制備的黃曲霉毒素吸附劑，添加量為0.2% (每kg日糧中添加2g黃曲霉毒素吸附劑)，得到添加吸附劑的飼料，用于對照的肉雞日糧中不添加，為空白飼料。選用300只健康I日齡肉仔雞(雌雄各半)，隨機分為6個組，每組50只雞。參考肉雞營養(yǎng)需要進行常規(guī)飼養(yǎng)，3組喂養(yǎng)添加吸附劑的飼料，另外3組喂養(yǎng)空白飼料。試驗周期21d，自由采食與飲水，常規(guī)免疫。第21d，每組隨機挑選3只雞，心臟采血后頸動脈放血處死，收集血清和肝臟，于-20°C保存?zhèn)溆?。采用相關試劑盒(上海科興商貿有限公司)測定肝臟有關酶活性指標，包括琥珀酸脫氫酶(SDH)和超氧化物歧化酶(SOD)。試驗結束后，統(tǒng)計平均日增重、采食量、料重比和死亡率(方法見文獻:按張輝華等，熱滅活乳酸桿菌制劑對竹絲肉雞生長性能的影響.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2005 (8):36-37)。實驗結果見圖4，其中，A圖為黃曲霉毒素吸附劑對料重比和死亡率的影響，B為黃曲霉毒素吸附劑對SDH和SOD酶活力的影響。可知，投喂添加黃曲霉毒素吸附劑的飼料后，與投喂空白飼料的實驗組比較，雞肝臟SDH和SOD酶活力水平分別為9.11±1.lU/mg和399.98±87U/mg，酶活力水平均顯著增加(p < 0.01);料重比為1.52±0.21，顯著降低(投喂空白飼料的實驗組為1.59±0.32) (p < 0.05)，死亡率3.23±0.37，顯著降低(投喂空白飼料的實驗組為4.56±0.4) (P < 0.01)?？梢?，在雞日糧中添加黃曲霉毒素吸附劑，有利于提高飼料轉化率，并能有效防止動物死亡。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其它的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種黃曲霉毒素吸附劑，其特征在于:這種吸附劑是由中藥渣粉和乳酸菌混合制成。
2.根據(jù)權利要求1所述的黃曲霉毒素吸附劑，其特征在于:每IOOkg所述吸附劑中，中藥渣粉的含量為50 90kg，乳酸菌的含量為IO14 IO16個細胞。
3.根據(jù)權利要求2所述的黃曲霉毒素吸附劑，其特征在于:所述中藥渣粉的細度為60 200目，含水量6% 12%。
4.根據(jù)權利要求1所述的黃曲霉毒素吸附劑，其特征在于:所述中藥渣粉為板藍根、雞骨草和金銀花水浸提取后的藥渣混合物。
5.根據(jù)權利要求1所述的黃曲霉毒素吸附劑，其特征在于:所述乳酸菌是乳酸菌和滅活乳酸菌制劑中的一種或兩者的混合物。
6.根據(jù)權利要求1所述的黃曲霉毒素吸附劑，其特征在于:所述乳酸菌是嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌、短雙歧桿菌和唾液乳桿菌中的一種以上。
7.根據(jù)權利要求5所述的黃曲霉毒素吸附劑，其特征在于:所述滅活乳酸菌制劑是將所述乳酸菌經(jīng)70 100°C高溫處理10 20min，得到滅活乳酸菌制劑。
8.根據(jù)權利要求1 7所述的黃曲霉毒素吸附劑的應用，其特征在于:所述黃曲霉毒素吸附劑用作飼料添加劑，應用于飼料貯藏階段或養(yǎng)殖場。
全文摘要
本發(fā)明屬于食品生物技術領域，公開一種黃曲霉毒素吸附劑及其應用，是一種能夠在飼料貯藏過程中抑制黃曲霉毒素產(chǎn)生菌生長和黃曲霉毒素生物合成的飼料添加劑，為中藥渣粉和乳酸菌的組合物。本發(fā)明提供的中藥渣和乳酸菌的組合物，其中中藥渣可有效抑制黃曲霉毒素生物合成，并可吸附飼料中的黃曲霉毒素隨糞便排出體外，對動物內臟起到保護作用。同時由于利用了板藍根、雞骨草和金銀花三種中藥殘留藥效成分，使其具有清熱祛濕之功效，尤其適合在南方養(yǎng)殖區(qū)域使用，可動物生長過程中起到抗應激、促進動物生長、保證動物健康及提高畜產(chǎn)品品質的功效。
文檔編號A23K1/16GK103211098SQ20121001916
公開日2013年7月24日 申請日期2012年1月19日 優(yōu)先權日2012年1月19日
發(fā)明者方祥, 李敏 申請人:廣州翰海生物科技有限公司, 華南農業(yè)大學