專利名稱：涉及編碼自交不親和性蛋白相關(guān)多肽的基因的耐旱植物和相關(guān)構(gòu)建體及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明領(lǐng)域涉及植物育種和基因?qū)W，并且具體地講涉及用于賦予植物耐旱性的重組DNA構(gòu)建體。
背景技術(shù)：
非生物脅迫是世界范圍內(nèi)作物損失的主要原因，它引起主要作物超過50%的平均產(chǎn)量損失(Boyer, J. S. (1982) Science 218 :443-448 ；Bray, Ε. Α.等人(2000)， Biochemistry and Molecular Biology of Plants,由 Buchannan, B. B.等人編輯，Amer. Soc. ,Plant Biol.，第1158-1249頁)。在多種非生物脅迫中，干旱是限制世界范圍內(nèi)作物產(chǎn)量的主要因素。在不同發(fā)育階段使植物暴露于水限制環(huán)境似乎活化了多個(gè)生理和發(fā)育變化。理解干旱脅迫感受、轉(zhuǎn)導(dǎo)和耐受性的基本生物化學(xué)機(jī)制和分子機(jī)制是生物學(xué)上的主要挑戰(zhàn)。已經(jīng)公布了對非生物脅迫響應(yīng)的分子機(jī)制和干旱脅迫耐受性的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的回顧 (Valliyodan, B.和 Nguyen, H. Τ.，(2006) Curr. Opin. Plant Biol. 9 :189-195 ；Wang，W.等人(2003)Planta218 :1-14) ；Vinocur, B.禾口 Altman，Α. (2005)Curr. Opin. Biotechnol. 16 123-132 ；Chaves, Μ. Μ.和 Oliveira, Μ. Μ. (2004)J. Exp. Bot. 55 :2365-2384 ；Shinozaki， K.等人(2003)Curr. Opin. Plant Biol. 6 :410-417 ；Yamaguchi-Shinozaki, K.禾口 Shinozaki，K. (2005)Trends Plant Sci. 10 :88-94)。在非生物脅迫響應(yīng)的分子方面的較早期的工作通過差異和/或差減分析完成(Bray, Ε. A. (1993)Plant Physiol. 103 :1035-1040 ；Shinozaki, K.禾口 Yamaguchi-Shinozaki，K. (1997)Plant Physiol. 115 :327-334 ；Zhu, J.-K.等人(1997) Crit.Rev. Plant Sci. 16 :253-277 ；Thomashow, M. F. (1999)Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 50 :571-599)。其他方法包括選擇候選基因并分析該基因的表達(dá)或其在脅迫條件下的活性產(chǎn)物，或者通過在明確界定的脅迫系統(tǒng)中進(jìn)行功能互補(bǔ)(Xiong，L.和am， J. -K. (2001)Physiologia Plantarum 112 :152-166)。此外，正向和反向基因研究涉及鑒定和分離調(diào)節(jié)基因中的突變，該研究也已經(jīng)用于提供在脅迫或暴露情況下基因表達(dá)中觀察到的改變中的證據(jù)(Xiong, L.和 Zhu，J.-K. (2001) Physiologia Plantarum 112:152-166)。可利用激活標(biāo)記來鑒定能影響性狀的基因。已經(jīng)在模型植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)中使用該方法(ffeigel,D.等人，(2000)Plant Physiol. 122 :1003-1013)。插入轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件能夠顯著激活和/或提高附近內(nèi)源性基因的表達(dá)。該方法能夠用于選擇涉及農(nóng)學(xué)上重要的表型(包括脅迫耐受性)的基因。發(fā)明概述本發(fā)明包括在一個(gè)實(shí)施方案中，在基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO 18、20、22、M、26J8、30、32或34 進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%的序列同一性，并且其中所述植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時(shí)表現(xiàn)出增強(qiáng)的耐旱性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，增強(qiáng)植物耐旱性的方法，包括(a)將重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入到可再生的植物細(xì)胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與 SEQ ID NO :18、20、22、24、26、28、30、32或34進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%的序列同一性；(b) 在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體，以及在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時(shí)表現(xiàn)出增強(qiáng)的耐旱性；以及任選地，(c)獲得來源于所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體，以及在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時(shí)表現(xiàn)出增強(qiáng)的耐旱性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，評價(jià)植物耐旱性的方法，包括(a)將重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入到可再生的植物細(xì)胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與 SEQ ID NO :18、20、22、24、26、28、30、32或34進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%的序列同一性；(b) 在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及(c)評價(jià)所述轉(zhuǎn)基因植物與不包含所述重組DNA 構(gòu)建體的對照植物相比的耐旱性；以及任選地，(d)獲得來源于所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及任選地，(e)評價(jià)所述子代植物與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物相比的耐旱性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，評價(jià)植物耐旱性的方法，包括(a)將重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入到可再生的植物細(xì)胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一個(gè)調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與 SEQ ID NO :18、20、22、24、26、28、30、32或34進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%的序列同一性；(b) 在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；(c)獲得來源于所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及(d)評價(jià)所述子代植物與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物相比的耐旱性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括本發(fā)明的任何方法，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸包含 (a)編碼自交不親和性相關(guān)多肽(SIPR)的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V比對方法在與SEQ ID NO 18、20、22、對、26、沘、30、32或；34中的其中一個(gè)進(jìn)行比較時(shí)具有至少90%或95%的序列同一性，或(b)所述核苷酸序列的全長互補(bǔ)序列，其中所述全長互補(bǔ)序列和所述核苷酸序列由相同數(shù)目的核苷酸組成并且是100%互補(bǔ)的。所述多肽可包含SEQ ID NO :18、20、22、24J6、28、30、32或34的氨基酸序列。所述核苷酸序列可包含核苷酸序列 SEQ ID NO :17、19、21、23、25、27、29、31 或 33。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明任何分離的多核苷酸的重組DNA構(gòu)建體，所述分離的多核苷酸可操作地連接至少一種調(diào)控序列，并且本發(fā)明涉及包含所述重組DNA構(gòu)建體的細(xì)胞、植物和種子。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括包含本發(fā)明的任何分離的多核苷酸的載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明任何重組DNA構(gòu)建體的細(xì)胞、植物或種子。所述細(xì)胞可為真核細(xì)胞，例如酵母、昆蟲或植物細(xì)胞，或者可為原核細(xì)胞，例如細(xì)菌。附圖簡沭和序列表根據(jù)以下的詳細(xì)描述和附圖以及序列表，可更全面地理解本發(fā)明，以下的詳細(xì)描述和附圖以及序列表構(gòu)成本專利申請的一部分。


圖1示出pHSbarENDs2激活標(biāo)記構(gòu)建體(SEQ ID NO 1)的示意圖，該構(gòu)建體用于制備擬南芥屬種群。圖2示出載體pD0NRTM/ZeO (SEQ ID NO :2)的圖譜。attPl位點(diǎn)位于核苷酸 570-801 ；attP2位點(diǎn)位于核苷酸27M-2985 (互補(bǔ)鏈)。圖3示出載體pD0NR 221(SEQ ID NO 3)的圖譜。attPl位點(diǎn)位于核苷酸570-801 ； attP2位點(diǎn)位于核苷酸27M-2985 (互補(bǔ)鏈)。圖4示出載體pBC-yell0W(SEQ ID NO 4)的圖譜，該載體是用于構(gòu)建擬南芥屬表達(dá)載體的目的載體。attRl位點(diǎn)位于核苷酸11276-11399(互補(bǔ)鏈)；attR2位點(diǎn)位于核苷酸9695-9819(互補(bǔ)鏈)。圖5示出PHP27840 (SEQ ID NO 5)的圖譜，該載體是用于構(gòu)建大豆表達(dá)載體的目的載體。attRl位點(diǎn)位于核苷酸7310-7434 ；attR2位點(diǎn)位于核苷酸8890-9014。圖6示出PHP23236(SEQ ID NO 6)的圖譜，該載體是用于構(gòu)建feispe Flint來源的玉米品系的表達(dá)載體的目的載體。attRl位點(diǎn)位于核苷酸2006-2130 ；attR2位點(diǎn)位于核苷酸沘99-3023。圖7示出PHP10523(SEQ ID NO 7)的圖譜，它是存在于農(nóng)桿菌屬菌株LBA4404中的質(zhì)粒 DNA (Komari 等人，Plant J. 10 :165-174(1996) ；NCBI 通用標(biāo)識符 59797027)。圖8示出PHP23235(SEQ ID NO 8)的圖譜，該載體是用于feispe Flint來源的玉米品系的目的載體。圖9示出PHP^647(SEQ ID NO 9)的圖譜，它是用于玉米近交來源的品系的目的載體。attRl位點(diǎn)位于核苷酸2289-2413 ；attR2位點(diǎn)位于核苷酸3869-3993。
圖10示出PHP^634(SEQ ID NO :16)的圖譜，該載體是用于構(gòu)建Gaspe Flint來源的玉米品系的表達(dá)載體的目的載體。圖 11A-11J 給出如 SEQ ID NO 18、20、22、24、26、28、30、32、34_40 所示的 SIPR 多
肽氨基酸序列比對結(jié)果。
圖12給出
圖11A-11J中給出的每對序列的序列同一性百分比和趨異值。
SEQ ID NO 1是p!BbarENDs2激活標(biāo)記載體的核苷酸序列。SEQ ID NO 2是GATEWAY 供體載體pD0NR Aeo的核苷酸序列。SEQ ID NO :3是GATEWAY 供體載體pD0NR 221的核苷酸序列。SEQ ID NO :4是pBC-yellow的核苷酸序列，pBC-yellow是用于擬南芥屬的目的載體。SEQ ID NO :5是PHP27840的核苷酸序列，PHP27840是用于大豆的目的載體。SEQ ID NO :6是PHP23236的核苷酸序列，PHP23236是用于Gaspe Flint來源的玉米品系的目的載體。SEQ ID NO 7 是 PHP10523 的核苷酸序列(Komari 等人，Plant J. 10 165-174(1996) ；NCBI 通用標(biāo)識符 59797027)。SEQ ID NO :8 是 ΡΗΡ232!35 的核苷酸序列，ΡΗΡ232!35 是用于 feispe Flint 來源的品系的目的載體。SEQ ID NO :9是PHP^647的核苷酸序列，PHP^647是用于玉米近交來源的品系的目的載體。SEQ ID NO 10是attBl位點(diǎn)的核苷酸序列。
SEQ ID NO 11是attB2位點(diǎn)的核苷酸序列。SEQ ID NO 12是Atlg^797_5‘ attB正向引物的核苷酸序列，它包含attBl序列，用于擴(kuò)增At 1 g26797蛋白編碼區(qū)。SEQ ID NO 13是Atlg^797_3‘ attB反向引物的核苷酸序列，它包含attB2序列，用于擴(kuò)增At 1 g26797蛋白編碼區(qū)。SEQ ID NO :14是VC062引物的核苷酸序列，它包含T3啟動子和attBl位點(diǎn)，用于擴(kuò)增克隆進(jìn)BLUESCRIPT II SK(+)載體(Stratagene)的cDNA插入序列。SEQ ID NO :15是VC063引物的核苷酸序列，它包含T7啟動子和attB2位點(diǎn)，用于擴(kuò)增克隆進(jìn)BLUESCRIPT II SK(+)載體(Stratagene)的cDNA插入序列。SEQ ID NO 16是PHP^634(也稱為DVl 1)的核苷酸序列，它是用于Gaspe Flint 來源的玉米品系的目的載體。SEQ ID NO :17對應(yīng)于NCBI GI No. 30689649，它是來自編碼擬南芥屬自交不親和性相關(guān)多肽(擬南芥)的基因座Atlg^5797的核苷酸序列。SEQ ID NO :18對應(yīng)于NCBI GI NO. 30689650，它是由 SEQ ID N0:17編碼的氨基酸序列(擬南芥)。SEQ ID NO :19對應(yīng)于NCBI GI No. 145362四3，它是來自基因座Atlg26798的核苷酸序列(擬南芥)。SEQ ID NO :20對應(yīng)于NCBI GI No. 42571653，它是由 SEQ ID NO 19 的核苷酸序歹Ij
編碼的氨基酸序列(擬南芥)。SEQ ID NO :21 對應(yīng)于 NCBI GI No. 79318656，它是來自基因座 Atlg26796 的核苷酸序列(擬南芥)。SEQ ID NO 22對應(yīng)于NCBI GI No. 79318657，它是由 SEQ ID NO :21 的核苷酸序列編碼的氨基酸序列(擬南芥)。SEQ ID NO :23 對應(yīng)于 NCBI GI No. 18396056，它是來自基因座 Atlg26795 的核苷酸序列(擬南芥)。SEQ ID NO 24對應(yīng)于NCBI GI No. 18396057，它是由 SEQ ID N0:23 的核苷酸序列編碼的氨基酸序列(擬南芥)。SEQ ID NO :25 對應(yīng)于 NCBI GI No. 18416755，它是來自基因座 At5gl2060 的核苷酸序列(擬南芥)。SEQ ID NO J6對應(yīng)于NCBI GI No. 15239857，它是由 SEQ ID N0:25 的核苷酸序列
編碼的氨基酸序列(擬南芥)。
SEQ ID NO :27 對應(yīng)于 NCBI GI No. 79315207，它是來自基因座 At3g55677 的核苷酸序列(擬南芥)。SEQ ID NO J8對應(yīng)于NCBI GI No. 79315208，它是由 SEQ ID N0:27 的核苷酸序列
編碼的氨基酸序列(擬南芥)。SEQ ID NO : 對應(yīng)于琴葉擬南芥(Arabidopsis lyrata)序列，其編碼 DTPlO 多肽(琴葉擬南芥琴葉亞種(Arabidopsis lyrata subsp. lyrata))。它編碼NCBI GI No. 297850998提供的公開可用的琴葉擬南芥序列的截短形式。SEQ ID NO :30對應(yīng)于由SEQ ID NO 29的核苷酸序列編碼的氨基酸序列(琴葉擬南芥琴葉亞種)。它是NCBI GI NO. 297850998提供的序列的截短形式。SEQ ID NO :31對應(yīng)于NCBI GI No. 2M118733，它是編碼DTPlO多肽的核苷酸序列 (毛果楊(Populus trichocarpa)) οSEQ ID NO :32 對應(yīng)于 NCBI GI No. 224118734，它是由 SEQ ID NO 31 的核苷酸序列編碼的氨基酸序列(毛果楊)。SEQ ID NO :33 對應(yīng)于 NCBI GI NO :270257654 的核苷酸 3234493-3234978 (葡萄 (Vitis vinifera))。SEQ ID NO :34 對應(yīng)于 NCBI GI No. 270257838，它是由 SEQ ID NO 33 的核苷酸序列編碼的氨基酸序列(葡萄)。SEQ ID NO :35是EP專利公布EP103;3405的SEQ ID NO 18685提供的氨基酸序列 (擬南芥)。SEQ ID NO 36是EP專利公布EP215^91的SEQ ID NO :49855提供的氨基酸序列 (擬南芥)。SEQ ID NO :37是EP專利公布EP103;3405的SEQ ID NO :2 提供的氨基酸序列 (擬南芥)。SEQ ID NO :38是美國專利公布US6855866的SEQ ID NO :9提供的氨基酸序列(擬
南芥)。SEQ ID NO :39是EP專利公布EP215^91的SEQ ID NO 12314提供的氨基酸序列 (擬南芥)。SEQ ID NO 40 對應(yīng)于 NCBI GI No. 297850998 (琴葉擬南芥琴葉亞種)。序列描述以及所附序列表遵循如37C. F. R. § 1. 821-1. 825所列出的關(guān)于專利申
請中核苷酸和/或氨基酸序列公開的規(guī)定。此序列表中以單個(gè)字母表示核苷酸，以三字母表示氨基酸，如Nucleic Acids Res. 13 :3021-3030(1985)和 Biochemical J. 219(No. 2) :345-373(1984)所描述的 IUPAC-IUBMB標(biāo)準(zhǔn)中所規(guī)定，它們以引用方式并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號和格式遵循在37C. F. R. § 1. 822中所列出的規(guī)定。發(fā)明詳述本文中所列出的每篇參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容的全文以引用的方式并入本文。本文以及所附權(quán)利要求書中所用的單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“所述”包括復(fù)數(shù)指代，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“一株植物”的涵義包括多株此類植物，“一個(gè)細(xì)胞”的涵義包括一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞及本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的等同物，等等。
如本文所用術(shù)語“AT-自交不親和性蛋白相關(guān)多肽”、“AT-Sira多肽”、“AT-耐旱表型10多肽” 和“AT-DTP10多肽”本文互換使用并且指由擬南芥基因座Atlg^5797編碼的擬南芥蛋白。術(shù)語“自交不親和性蛋白相關(guān)多肽”、“sira多肽”、“耐旱表型10多肽”和“DTP10 多肽”本文互換使用并且指At-DTPio的同源物。“自交不親和性蛋白-相關(guān)多肽”指與虞美人(Papaver Rhoeas)的自交不親和性蛋白 Sl 相關(guān)的蛋白家族。(Foote HC, Ride JP, Franklin-Tong VE, Walker EA, Lawrence MJ, Franklin FC; , Proc Natl Acad Sci U S A 1994 ；91 :2265-2269. =Cloning and expression of a distinctive class of self-incompatibility(S)gene from Papaver rhoeas L.)。自交不親和性(Si)指表面上健康的植物當(dāng)自花授粉時(shí)不能產(chǎn)生種子。在一些開花植物中自花受精抑制通過其中所述植物能夠識別自身花粉和非自身花粉的識別機(jī)制而發(fā)生。在大多數(shù)植物中SI系統(tǒng)受稱為S-基因座的單個(gè)復(fù)等位基因基因座控制。在虞美人中SI響應(yīng)在柱頭表面發(fā)生并且由復(fù)雜信號級聯(lián)系統(tǒng)調(diào)節(jié)，該級聯(lián)系統(tǒng)涉及Ca2+和蛋白質(zhì)磷酸化的瞬時(shí)增加。這個(gè)響應(yīng)在由柱頭分泌的S-蛋白和它們在花粉管中的同源受體相互作用后開始。S-蛋白是小信號分子，推測其能夠結(jié)合花粉上的受體來介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號途徑，該途徑最終介導(dǎo)花粉管生長的抑制。在擬南芥中的Sira蛋白的功能是未知的，因?yàn)樗亲曰ㄊ诰闹参?Matten 等人，Proc. Natl. Acad. Sci.，1994，第 91 卷，第 1992-1997 頁； Foote 等人，Proc. Natl. Acad. Sci.，1994，第 91 卷，第 2265-2269 頁；Wheeler 等人，J. Exp. Botany, 2003，第 54 (380)卷，第 131-139 頁)。 術(shù)語“單子葉植物”和“單子葉的植物”本文互換使用。本發(fā)明的單子葉植物包括禾本科植物。術(shù)語“雙子葉植物”和“雙子葉的植物”本文互換使用。本發(fā)明的雙子葉植物包括以下家族十字花科植物、豆科植物和茄科植物。術(shù)語“全長互補(bǔ)序列，，和“全長的互補(bǔ)序列，，本文互換使用，指給定核苷酸序列的互補(bǔ)序列，其中所述互補(bǔ)序列和核苷酸序列由相同數(shù)目的核苷酸組成且是100%互補(bǔ)的?！氨磉_(dá)序列標(biāo)簽”(“EST”)是得自cDNA文庫的DNA序列，因此是已經(jīng)被轉(zhuǎn)錄的序列。EST通常通過cDNA插入序列單程測序獲得。將完整的cDNA插入序列稱為“全長插入序列”(“FIS”)?！爸丿B群”序列是由選自但不限于EST、FIS和PCR序列的兩個(gè)或更多個(gè)序列裝配成的序列。將編碼完整或功能性蛋白的序列稱為“完全基因序列”(“CGS”)，該序列能得自FIS或重疊群?！稗r(nóng)學(xué)特性”是可測量的參數(shù)，包括但不限于低溫脅迫下的綠度、產(chǎn)量、生長速率、 生物量、成熟時(shí)的鮮重、成熟時(shí)的干重、果實(shí)產(chǎn)量、種子產(chǎn)量、總植物含氮量、果實(shí)含氮量、種子含氮量、營養(yǎng)組織含氮量、總植物游離氨基酸含量、營養(yǎng)組織游離氨基酸含量、果實(shí)游離氨基酸含量、種子游離氨基酸含量、總植物蛋白質(zhì)含量、果實(shí)蛋白質(zhì)含量、種子蛋白質(zhì)含量、 營養(yǎng)組織蛋白質(zhì)含量、耐旱性、氮攝取、根倒伏、收獲指數(shù)、莖倒伏、植物高度、穗高、穗長、早期幼苗活力和出苗?！稗D(zhuǎn)基因”指其基因組因異源核酸(如重組DNA構(gòu)建體)的存在而發(fā)生改變的任何細(xì)胞、細(xì)胞系、愈傷組織、組織、植物部分或植物，包括那些最初的轉(zhuǎn)基因事件以及從最初的轉(zhuǎn)基因事件通過有性雜交或無性生殖而產(chǎn)生的那些。如本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”不涵蓋通過常規(guī)植物育種方法或通過諸如隨機(jī)異花受精、非重組病毒感染、非重組細(xì)菌轉(zhuǎn)化、非重組轉(zhuǎn)座或自發(fā)突變之類的自然發(fā)生事件導(dǎo)致的基因組(染色體基因組或染色體外基因組) 改變?！盎蚪M”在用于植物細(xì)胞時(shí)不僅涵蓋存在于細(xì)胞核中的染色體DNA，而且還包括存在于細(xì)胞的亞細(xì)胞組分(如線粒體、質(zhì)粒)中的細(xì)胞器DNA?！爸参铩卑ㄕ麄€(gè)植物、植物器官、植物組織、種子和植物細(xì)胞以及同一植物的子代。植物細(xì)胞包括但不限于得自下列物質(zhì)的細(xì)胞種子、懸浮培養(yǎng)物、胚、分生區(qū)域、愈傷組織、葉、根、芽、配子體、孢子體、花粉和小孢子?！白哟卑ㄖ参锏娜魏魏罄m(xù)世代?！稗D(zhuǎn)基因植物”包括在其基因組內(nèi)包含異源多核苷酸的植物。例如異源多核苷酸被穩(wěn)定地整合進(jìn)基因組中，使得該多核苷酸傳遞至連續(xù)的世代。異源多核苷酸可單獨(dú)地或作為重組DNA構(gòu)建體的部分整合進(jìn)基因組中。針對序列而言的“異源”意指來自外來物種的序列，或者如果來自相同物種，則指通過蓄意的人為干預(yù)而從其天然形式發(fā)生了組成和/或基因座的顯著改變的序列?！岸嗪塑账帷?、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互換使用且是任選含有合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基的單鏈或雙鏈RNA或DNA聚合物。核苷酸(通常以它們的5'-單磷酸形式存在)通過它們的單字母命名指代如下“A”指腺苷酸或脫氧腺苷酸(分別用于RNA或DNA)，“C”指胞苷酸或脫氧胞苷酸，“G”指鳥苷酸或脫氧鳥苷酸，“U” 指尿苷酸，“T”指脫氧胸苷酸，“R”指嘌呤(A或G)，“Y”指嘧啶(C或T)，“K”指G或T，“H” 指A或C或T，“ I ”指肌苷，“N”指任何核苷酸?！岸嚯摹?、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)類似物的氨基酸聚合物，以及適用于天然存在的氨基酸聚合物。術(shù)語“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白質(zhì)”還可包括修飾，包括但不限于糖基化、脂質(zhì)連接、硫酸鹽化、谷氨酸殘基的 Y羧化、羥化和ADP-核糖基化。“信使RNA(mRNA) ”指無內(nèi)含子且可通過細(xì)胞翻譯成蛋白質(zhì)的RNA。“cDNA”指與mRNA模板互補(bǔ)并且利用逆轉(zhuǎn)錄酶從mRNA模板合成的DNA。cDNA可為單鏈的或者可用DNA聚合酶I的Klenow片段轉(zhuǎn)化成雙鏈形式?！俺墒臁钡鞍字附?jīng)翻譯后加工的多肽，即已經(jīng)去除了存在于初始翻譯產(chǎn)物中的任何前肽或肽原的多肽?！扒绑w”蛋白質(zhì)指mRNA的初級翻譯產(chǎn)物，即前肽和肽原仍然存在。前肽和原肽可為并且不限于細(xì)胞內(nèi)定位信號。“分離的”指物質(zhì)，例如核酸和/或蛋白質(zhì)，該物質(zhì)基本上不含在天然存在的環(huán)境中通常伴隨該物質(zhì)或與其反應(yīng)的組分，或者說是該物質(zhì)被從所述組分移出。分離的多核苷酸可從它們天然存在于其中的宿主細(xì)胞純化。技術(shù)人員已知的常規(guī)核酸純化方法可用于獲得分離的多核苷酸。該術(shù)語也涵蓋重組多核苷酸和化學(xué)合成的多核苷酸?！爸亟M體”指例如通過化學(xué)合成或者通過用基因工程技術(shù)操縱分離的核酸片段來實(shí)現(xiàn)的兩個(gè)原本分離的序列片段的人工組合?！爸亟M體”也包括指已經(jīng)通過導(dǎo)入異源核酸而進(jìn)行了修飾的細(xì)胞或載體，或源于經(jīng)這樣修飾的細(xì)胞的細(xì)胞，但不涵蓋由天然發(fā)生的事件 (如自發(fā)突變、自然轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)座)對細(xì)胞或載體的改變，例如沒有蓄意人為干擾而發(fā)生的那些?！爸亟MDNA構(gòu)建體”指在自然界中通常不會一起存在的核酸片段的組合。因此，重組DNA構(gòu)建體可包含源于不同來源的調(diào)控序列和編碼序列，或源于相同來源但以不同于通常天然存在的方式排列的調(diào)控序列和編碼序列。術(shù)語“入門克隆”和“入門載體”本文可互換使用?！罢{(diào)控序列”指位于編碼序列的上游(5'非編碼序列)、中間或下游(3'非編碼序列)，并且影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性或者翻譯的核苷酸序列。調(diào)控序列可包括但不限于啟動子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和多腺苷酸化識別序列。術(shù)語“調(diào)控序列”和 “調(diào)控元件”在本文中可互換使用?！皢幼印敝改軌蚩刂屏硪缓怂崞无D(zhuǎn)錄的核酸片段?！霸谥参镏杏泄δ艿膯幼印笔悄軌蚩刂浦参锛?xì)胞中的轉(zhuǎn)錄的啟動子，無論其是否來源于植物細(xì)胞?！敖M織特異性啟動子”和“組織優(yōu)選啟動子”可互換使用，并且指主要但非必須專一地在一種組織或器官中表達(dá)，而是也可在一種特定細(xì)胞中表達(dá)的啟動子。“發(fā)育調(diào)控啟動子”指其活性由發(fā)育事件決定的啟動子。術(shù)語“可操作地連接”指核酸片段連接成單一片段，使得其中一個(gè)核酸片段的功能受到另一個(gè)核酸片段的調(diào)控。例如，在啟動子能夠調(diào)節(jié)核酸片段的轉(zhuǎn)錄時(shí)，該啟動子與該核酸片段進(jìn)行了可操作地連接。“表達(dá)”指功能產(chǎn)物的產(chǎn)生。因此，核酸片段的表達(dá)可指核酸片段的轉(zhuǎn)錄(如生成 mRNA或功能RNA的轉(zhuǎn)錄)和/或RNA翻譯成前體或成熟蛋白質(zhì)?！氨硇汀币庵讣?xì)胞或生物體的可檢測的特征。有關(guān)將核酸片段(例如重組DNA構(gòu)建體)插入細(xì)胞內(nèi)的“導(dǎo)入”意指“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”，并且包括指將核酸片段整合進(jìn)真核或原核細(xì)胞中，在該細(xì)胞中核酸片段可整合進(jìn)細(xì)胞的基因組(如染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)內(nèi)，轉(zhuǎn)變成自主的復(fù)制子或瞬時(shí)表達(dá)(如轉(zhuǎn)染的mRNA)?！稗D(zhuǎn)化細(xì)胞”是將核酸片段(如重組DNA構(gòu)建體)導(dǎo)入其中的任何細(xì)胞。在此所用的“轉(zhuǎn)化”指穩(wěn)定轉(zhuǎn)化和瞬時(shí)轉(zhuǎn)化兩者?！胺€(wěn)定轉(zhuǎn)化”指將核酸片段導(dǎo)入宿主生物體的基因組中，導(dǎo)致基因穩(wěn)定遺傳。一旦穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，核酸片段穩(wěn)定地整合進(jìn)宿主生物體和任何連續(xù)世代的基因組中?！八矔r(shí)轉(zhuǎn)化”指將核酸片段導(dǎo)入宿主生物體的核中或包含DNA的細(xì)胞器中，引起基因表達(dá)而沒有基因穩(wěn)定遺傳?！暗任换颉笔钦紦?jù)染色體上給定位點(diǎn)的基因的幾種供選擇替代形式的其中一種。 當(dāng)二倍體植物中一對同源染色體上給定基因座上存在的等位基因相同時(shí)，該植物在該基因座處是純合的。如果二倍體植物中一對同源染色體上給定基因座上存在的等位基因不同， 則該植物在該基因座處是雜合的。如果轉(zhuǎn)基因存在于二倍體植物中一對同源染色體中的其中之一上，則該植物在該基因座處是半合子的?！叭~綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽”是與蛋白協(xié)同翻譯并將蛋白導(dǎo)向葉綠體或在其中制備蛋白的細(xì)胞中存在的其它質(zhì)體類型。“葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)序列”指編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核苷酸序列?！靶盘栯摹笔且环N與蛋白質(zhì)共同被翻譯并將蛋白導(dǎo)向分泌系統(tǒng)的氨基酸序列(Chrispeels，(1991) Ann. Rev. Plant Phys. Plant Mol. Biol. 42 :21-53)。如果將所述蛋白導(dǎo)向液泡，可另外加上液泡靶向信號(同上)，或者如果將所述蛋白導(dǎo)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，可加上內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留信號(同上)。如果將蛋白導(dǎo)向細(xì)胞核，將移除任何存在的信號肽并用以核定位信號替代(RaiWiel， (1992)Plant Phys. 100 1627-1632) 0 “線粒體信號肽”是指導(dǎo)前體蛋白質(zhì)導(dǎo)進(jìn)入線粒體中的氨基酸序列(Zhang 和 GlaseH2002) Trends Plant Sci 7:14-21)。序列比對和同一性百分比可用設(shè)計(jì)用于檢測同源序列的多種比較方法來測定， 這些方法包括但不限于LASERGENE 生物信息計(jì)算包(DNASTAR hc. (Madison, WI))的 MEGALIGN 程序。除非另外說明，本文提供的序列的多重比對用Clustal V比對方法 (Higgins和Sharp, 1989，CAB I OS. 5 :151-153)采用默認(rèn)參數(shù)(空位罰分=10，空位長度罰分=10)執(zhí)行。用Clustal V方法進(jìn)行成對比對和蛋白質(zhì)序列的百分比同一性計(jì)算的默認(rèn)參數(shù)為 KTUPLE = 1，空位罰分=3，窗口(WINDOW) = 5 和 DIAGONALS SAVED = 5。對于核酸，這些參數(shù)為KTUPLE = 2，空位罰分=5，窗口 = 4和DIAGONALS SAVED = 4。在序列比對后，使用Clustal V程序，通過參閱相同程序上的“序列距離”表可能獲得“百分比同一性” 和“趨異度”值；除非另外說明，本文提供的和申明的同一性百分比和趨異度是以該方式計(jì)算。本文使用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的并且在如下文獻(xiàn)中有更全面的描述Sambrook， J. , Fritsch, Ε. F.禾口 Maniatis， Τ. Molecular Cloning A Laboratory Manual ；Cold Spring Harbor Laboratory Press :Cold Spring Harbor, 1989 (下文稱為 “Sambrook” )?，F(xiàn)在來看實(shí)施方案實(shí)施方案包括分離的多核苷酸和多肽、用于提供耐旱性的重組DNA構(gòu)建體、包含這些重組DNA構(gòu)建體的組合物(例如植物或種子)，以及利用這些重組DNA構(gòu)建體的方法。分離的多核苷酸和多肽本發(fā)明包括下列分離的多核苷酸和多肽分離的多核苷酸包含(i)編碼多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V比對方法在與SEQ ID NO :18、20、22、對、26、沘、30、32或；34進(jìn)行比較時(shí)具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、 65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%, 80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性；或(ii)⑴的核酸序列的全長互補(bǔ)序列，其中⑴的核酸序列的全長互補(bǔ)序列由相同數(shù)目的核苷酸組成并且是100%互補(bǔ)的。任何上述分離的多核苷酸可用于本發(fā)明的任何重組DNA構(gòu)建體(包括抑制DNA構(gòu)建體)。所述多肽優(yōu)選地為sira多肽。分離的多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID N0 18、20、22、24、26、28、30、32 或 34 進(jìn)行比較時(shí)具有至少 50%,51 %,52%,53%,54%,55%, 56%,57%,58%,59%,60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%, 71 72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 82%,83%,84%,85%,86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。所述多肽優(yōu)選地為sira多肽。分離的多核苷酸，包括(i)基于Clustal V比對方法在與17、19、21、23、25、27、 29,31 或 33 進(jìn)行比較時(shí)具有至少 50%、51 %、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、 59%,60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%, 74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%, 89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的序列同一性的核酸序列；或(ii) (i)的核酸序列的全長互補(bǔ)序列。任何上述分離的多核苷酸可用于本發(fā)明的任何重組DNA構(gòu)建體(包括抑制DNA構(gòu)建體)。所述分離的多核苷酸優(yōu)選地編碼SIPR多肽。重組DNA構(gòu)津體和抑制DNA構(gòu)津體在一個(gè)方面，本發(fā)明包括重組DNA構(gòu)建體(包括抑制DNA構(gòu)建體)。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列(如在植物中有功能的啟動子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括(i)核酸序列，所述核酸序列編碼的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO 18、20、22、M、26J8、30、32或 34 進(jìn)行比較時(shí)具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、 61 62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 72%,73%,74%,75%, 76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%, 91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的序列同一性；或(ii)⑴核酸序列的全長互補(bǔ)序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列(如在植物中有功能的啟動子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括(i)核酸序列，所述核酸序列基于Clustal V比對方法在與16、18、20、22、24、26、28、30或32進(jìn)行比較時(shí)具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、 65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%, 80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性，或(ii)⑴核酸序列的全長互補(bǔ)序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列(如在植物中有功能的啟動子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼SPR多肽蛋白。SPR多肽可來自擬南芥、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、煙豆(Glycine tabacina)、野大豆 (Glycine soja)禾口短絨里予大豆(Glycine tomentella)。在另一方面，本發(fā)明包括抑制DNA構(gòu)建體。抑制DNA構(gòu)建體可包含至少一種調(diào)控序列(如在植物中有功能的啟動子)，所述調(diào)控序列可操作地連接(a)以下序列的全部或部分(i)編碼多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO 18、20、22、M、26J8、30、32或；34進(jìn)行比較時(shí)具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、 62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%, 77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^ 100% 的序列同一性，或者(ii) (a) (i)的核酸序列的全長互補(bǔ)序列；或者(b)來源于所關(guān)注靶基因的全部或部分有義鏈或反義鏈的區(qū)域，所述區(qū)域的核酸序列基于Clustal V比對方法在與所述區(qū)域所來源的有義鏈或反義鏈的全部或部分比較時(shí)具有至少50%、51%、52%、53%、討％、55%、56%、57%、58%、 59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%, 74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%, 89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的序列同一性，并且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼sira多肽；或者(c)以下序列的全部或部分(i)核酸序列，所述核酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO 16、18、20、22、24J6、28、30或 32 進(jìn)行比較時(shí)具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、 56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%, 76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%, 91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的序列同一性，或(ii) (c)⑴ 的核酸序列的全長互補(bǔ)序列。所述抑制DNA構(gòu)建體可包含共抑制構(gòu)建體、反義構(gòu)建體、病毒抑制構(gòu)建體、發(fā)夾抑制構(gòu)建體、莖環(huán)抑制構(gòu)建體、產(chǎn)生雙鏈RNA的構(gòu)建體、RNAi構(gòu)建體或小 RNA構(gòu)建體(如siRNA構(gòu)建體或miRNA構(gòu)建體)。應(yīng)當(dāng)理解(正如本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解的)，本發(fā)明不僅僅涵蓋這些具體的示例性序列。引起給定位點(diǎn)處產(chǎn)生化學(xué)上等價(jià)的氨基酸但不影響所編碼多肽的功能特性的核酸片段中的改變是本領(lǐng)域眾所周知的。因此，氨基酸丙氨酸(疏水性氨基酸)的密碼子可被編碼另一個(gè)疏水性較弱的殘基(例如甘氨酸)或疏水性較強(qiáng)的殘基(例如纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸)的密碼子取代。類似地，導(dǎo)致一個(gè)帶負(fù)電荷的殘基替換為另一個(gè)帶負(fù)電荷的殘基(例如天冬氨酸替代谷氨酸)或者一個(gè)帶正電荷的殘基替換為另一個(gè)帶正電荷的殘基(例如賴氨酸替換精氨酸)的改變也可預(yù)期產(chǎn)生功能上等價(jià)的產(chǎn)物。引起多肽分子的N 末端和C末端部分改變的核苷酸變化也將預(yù)計(jì)不會改變多肽的活性。所提出的修飾中的每一種均完全在本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)內(nèi)，如測定編碼產(chǎn)物生物活性的保留情況?！耙种艱NA構(gòu)建體”是在轉(zhuǎn)化或穩(wěn)定整合進(jìn)植物基因組時(shí)，導(dǎo)致該植物中的靶基因 “沉默”的重組DNA構(gòu)建體。對該植物來說，該靶基因可以是內(nèi)源性的或是轉(zhuǎn)基因的。如本文針對靶基因所使用的，“沉默”通常指在由靶基因表達(dá)的mRNA或蛋白質(zhì)/酶的水平上的抑制，和/或在酶活性或蛋白質(zhì)功能性的水平上的抑制。本文中可交換使用的術(shù)語“抑制”、 “抑制性”以及“沉默”包括降低、減少、減退、減小、抑制、消除或防止?！俺聊被颉盎虺聊?不確定機(jī)理并且包括但不限于反義、共抑制、病毒-抑制、發(fā)夾抑制、莖-環(huán)抑制、基于RNAi 的方法以及基于小RNAi的方法。抑制DNA構(gòu)建體可包含來源于受關(guān)注的靶基因的區(qū)域并且可包含受關(guān)注的靶基因的有義鏈(或反義鏈)的核酸序列的全部或部分。取決于所要利用的方法，該區(qū)域可與所關(guān)注基因的有義鏈(或反義鏈)的全部或部分100%相同或者具有少于100%同一性的同一性(如具有至少 50%,51%,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,61%, 62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%, 77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性)。抑制DNA構(gòu)建體是本領(lǐng)域所熟知的，一旦選定受關(guān)注的靶基因就很容易構(gòu)建，并且包括但不限于共抑制構(gòu)建體、反義構(gòu)建體、病毒抑制構(gòu)建體、發(fā)夾抑制構(gòu)建體、莖環(huán)抑制構(gòu)建體、產(chǎn)生雙鏈RNA的構(gòu)建體，以及更通常的是，RNAi (RNA干擾)構(gòu)建體和小RNA構(gòu)建體， 例如siRNA (短干擾RNA)構(gòu)建體和miRNA (微RNA)構(gòu)建體?！胺戳x抑制”指產(chǎn)生能夠抑制靶基因或基因產(chǎn)物表達(dá)的反義RNA轉(zhuǎn)錄物?！胺戳xRNA” 指與靶初級轉(zhuǎn)錄物或mRNA的全部或部分互補(bǔ)，并阻斷分離的靶核酸片段表達(dá)的RNA轉(zhuǎn)錄物 (美國專利5，107，065)。反義RNA可與特定基因轉(zhuǎn)錄物的任何部分，即5'非編碼序列、3' 非編碼序列、內(nèi)含子或編碼序列互補(bǔ)。“共抑制”指產(chǎn)生能夠抑制靶基因或基因產(chǎn)物表達(dá)的有義RNA轉(zhuǎn)錄物?！坝辛x”RNA 指包括mRNA并且可在細(xì)胞內(nèi)或體外翻譯成蛋白質(zhì)的RNA轉(zhuǎn)錄物。此前，已通過著眼于以有義方向過表達(dá)與內(nèi)源mRNA具有同源性的核酸序列(其導(dǎo)致與過表達(dá)的序列具有同源性的所有RNA減少)設(shè)計(jì)出了植物中的共抑制構(gòu)建體(參見Vaucheret等人，Plant J. 16 651-659(1998)；和 Gura，Nature 404 :804-808(2000)) 另一種變型描述了將植物病毒序列用于引導(dǎo)對近端mRNA編碼序列的抑制(于 1998年8月20日公開的PCT公開WO 98/36083)。RNA干擾是指由短干擾RNA(SiRNA)介導(dǎo)的動物中序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默的過程(Fire等人，Nature 391 :806 (1998))。在植物中的對應(yīng)過程通常稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默 (PTGS)或RNA沉默，并且在真菌中也稱為阻抑作用。據(jù)信轉(zhuǎn)錄后基因沉默過程是用于防止外來基因表達(dá)的進(jìn)化保守的細(xì)胞防御機(jī)制，并且通常由不同植物區(qū)系和門所共享(Fire等人，Trends Genet. 15 :358(1999))。小RNA在控制基因表達(dá)中起重要作用。很多發(fā)育過程(包括開花)的調(diào)節(jié)是由小 RNA控制的?，F(xiàn)在有可能通過使用在植物中產(chǎn)生小RNA的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體來以工程手段改變植物基因的基因表達(dá)。小RNA似乎是通過與互補(bǔ)RNA或DNA靶序列堿基配對來行使功能的。當(dāng)與RNA結(jié)合時(shí)，小RNA或者引發(fā)靶序列的RNA裂解或者引發(fā)翻譯抑制。當(dāng)與DNA靶序列結(jié)合時(shí)，據(jù)信小RNA可介導(dǎo)靶序列的DNA甲基化。無論具體機(jī)制是什么，這些事件的后果是基因表達(dá)受到抑制。微RNA(miRNA)是長度為約19至約M個(gè)核苷酸(nt)的已經(jīng)在動物和植物中鑒定出的非編碼 RNA(Lagos-Quintana 等人，Science 294 :853-858(2001), Lagos-Quintana 等人，Curr. Biol. 12 :735-739(2002) ；Lau 等人，Science 294 :858-862(2001) ；Lee 和 Ambros, Science 294 :862-864(2001) ；Llave 等人，Plant Cell 14 :1605-1619(2002)； Mourelatos 等 A, Genes. Dev. 16 :720-728 (2002) ；Park ^ A, Curr. Biol. 12 1484-1495(2002) ；Reinhart 等人，Genes. Dev. 16 1616-1626 (2002)) 它們是由大小為大約70nt至200nt的較長的前體轉(zhuǎn)錄物加工生成的，并且這些前體轉(zhuǎn)錄物能夠形成穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。微RNA(miRNA)看起來通過與位于由這些基因產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物中的互補(bǔ)序列結(jié)合來調(diào)節(jié)靶基因。就lin-4和let-7而言，靶位點(diǎn)位于靶mRNA的3'非翻譯區(qū)中(Lee等人，Cell 75 :843-854(1993) ；Wightman 等人，Cell 75 :855-862(1993) ；Reinhart 等人， Nature 403 :901-906 (2000) ；Slack 等人，Mol. Cell 5 :659-669 (2000))，并且在 lin-4 和 let-7miRNA與其靶位點(diǎn)之間有幾個(gè)錯(cuò)配。結(jié)合lin_4或let-7miRNA似乎引起由靶miRNA編碼的蛋白的穩(wěn)態(tài)水平的下調(diào)，而不影響自身的轉(zhuǎn)錄物(Olsen和Ambros，Dev. Biol. 216 671-680(1999))。另一方面，最近有證據(jù)表明，在某些情況下，miRNA可以引起靶轉(zhuǎn)錄物在靶位點(diǎn)內(nèi)特異性RNA裂解，并且該裂解步驟看起來需要miRNA與靶轉(zhuǎn)錄物之間具有100% 的互補(bǔ)性(Hutvagner 和 Zamore,Science 297 :2056-2060(2002) ；Llave 等人，Plant Cell 14 :1605-1619(2002)) 0看來似乎miRNA可能以至少兩種途徑進(jìn)入靶基因調(diào)控(1)當(dāng)靶互補(bǔ)性為< 100%時(shí)蛋白下調(diào)；和( 當(dāng)靶互補(bǔ)性為100%時(shí)RNA裂解。進(jìn)入RNA裂解途徑的微RNA與在動物中RNA干擾(RNAi)期間以及在植物中轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)期間產(chǎn)生的 2l-25nt短干擾RNA (siRNA)類似，并且可能整合進(jìn)與在RNAi情況中觀察到的復(fù)合物類似或相同的RNA-誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)內(nèi)。用生物信息學(xué)鑒定miRNA的靶標(biāo)在動物中沒有成功，這可能是因?yàn)閯游飉iRNA與它們的靶標(biāo)具有低水平的互補(bǔ)性。另一方面，生物信息學(xué)方法已經(jīng)成功地用于預(yù)測植物 miRNA 的靴標(biāo)(Llave 等人，Plant Cell 14 :1605-1619(2002) ；Park 等人，Curr. Biol. 12 1484-1495(2002) ；Rhoades 等人，Cell 110 :513_52(K2002))，因此，似乎植物miRNA 與其推定靶的整個(gè)互補(bǔ)性高于動物miRNA。植物miRNA的這些預(yù)測靶標(biāo)中的大部分編碼涉及植物發(fā)育模式或細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄因子家族的成員。調(diào)控序列本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體(包括抑制DNA構(gòu)建體)可包含至少一種調(diào)控序列。調(diào)控序列可為啟動子。多種啟動子可用于本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體中?？筛鶕?jù)所需結(jié)果來選擇啟動子， 并且可包括用于在宿主生物體中表達(dá)的組成型啟動子、組織特異性啟動子、誘導(dǎo)型啟動子或其他啟動子。在多數(shù)情況下引起基因在大多數(shù)細(xì)胞型中表達(dá)的啟動子通常稱為“組成型啟動子”。雖然候選基因當(dāng)通過組成型啟動子驅(qū)動表達(dá)時(shí)可預(yù)測其效應(yīng)，但候選基因在35S 或UBI啟動子控制下的高水平、組成型表達(dá)可具有多重效應(yīng)。使用組織特異和/或脅迫特異啟動子可消除不需要的效應(yīng)但保留耐旱性的能力。在擬南芥屬中已經(jīng)觀察到了該效應(yīng) (Kasuga 等人(1999) Nature Biotechnol. 17 :287-91)。適用于植物宿主細(xì)胞的組成型啟動子包括例如Rsyn7啟動子的核心啟動子和在 WO 99/43838和美國專利6，072，050中公開的其他組成型啟動子；CaMV 35S核心啟動子 (Odell 等人，Nature 313:810-812(1985))；稻肌動蛋白啟動子(McElroy 等人，Plant Cell 2 :163-171(1990))；泛素啟動子(Christensen 等人，Plant Mol. Biol. 12 :619-632(1989) 和 Christensen 等人，Plant Mol. Biol. 18 :675-689(1992)) ；pEMU 啟動子(Last 等人， Theor. Appl. Genet. 81 :581-588 (1991)) ；MAS (VeIten 等人，EMBO J. 3 :2723-2730 (1984))； ALS啟動子(美國專利5，659，026)等。其他組成型啟動子包括例如在美國專利5，608，149、 5，608，144,5,604，121,5,569，597,5,466，785,5,399，680,5,268，463,5,608，142 禾口 6，177,611中公開的那些啟動子。在選擇啟動子用于本發(fā)明方法時(shí)，可能有利的是使用組織特異性啟動子或發(fā)育調(diào)控啟動子。組織特異性啟動子或發(fā)育調(diào)節(jié)啟動子是這樣的DNA序列該序列調(diào)節(jié)DNA序列選擇性地在對雄穗發(fā)育、結(jié)籽或兩者重要的植物細(xì)胞/組織中表達(dá)，并限制這種DNA序列只在植物的雄穗發(fā)育或種子成熟期間表達(dá)。任何引起所需時(shí)空表達(dá)的可鑒定啟動子均可用于本發(fā)明的方法中。種子或胚特異性的并且可用于本發(fā)明的啟動子包括大豆Kimitz胰蛋白酶抑制劑(Kti3，Jofuku 和 Goldberg，Plant Cell 1 1079-1093 (1989))、patatin (馬鈴薯塊莖) (Rocha-Sosa，M.等人，1989，EMB0 J. 8 :23-29)、convicilin、豌豆球蛋白和豆球蛋白(豌豆子葉)(Rerie,ff. G.等人，1991，Mol. Gen. Genet. 259 :149-157 ；Newbigin, Ε. J.等人，1990， Planta 180 :461-470 ；Higgins, Τ. J. V.等人，1988，Plant. Mol. Biol. 11 :683-695)、玉米蛋白(玉米胚乳)(Schemthaner，J. P.等人，1988，EMBO J. 7 :1249-1255)、菜豆蛋白(菜豆子葉)Gegupta-Gopalan，C.等人，1985，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 82 :3320-3324)、植物血球凝集素(菜豆子葉)(Voelker，T.等人，1987，EMBO J. 6 :3571-3577)、B-伴球蛋白和大豆球蛋白(大豆子葉)(Chen，Z-L等人，1988，EMBO J. 7 :297-302)、谷蛋白(稻胚乳)、大麥醇溶蛋白(大麥胚乳)(Marris，C.等人，1988，Plant Mol. Biol. 10 :359-366)、麥谷蛋白和麥醇溶蛋白(小麥胚乳)(Colot，V.等人，1987，EMBO J. 6 :3559-3564)和甘薯貯藏蛋白 (sporamin)(甘薯塊根)(Hattori, T.等人，1990，Plant Mol. Biol. 14 :595-604)?？刹僮鞯剡B接嵌合基因構(gòu)建體異源編碼區(qū)的種子特異性基因的啟動子在轉(zhuǎn)基因植物中保持它們的時(shí)空表達(dá)模式。此類實(shí)例包括在擬南芥和甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)種子中表達(dá)腦啡肽的擬南芥屬2S種子儲藏蛋白基因啟動子(Vanderkerddiove等人，Bio/Technology 7 L^9-932(1989))、表達(dá)熒光素酶的菜豆凝集素和β-菜豆蛋白啟動子(Riggs等人，Plant Sci. 63 :47-57(1989)),以及表達(dá)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的小麥谷蛋白啟動子(Colot等人， EMBO J 6 :3559-3564(1987))?？烧T導(dǎo)啟動子響應(yīng)內(nèi)源性或外源性刺激的存在，例如，通過化合物(化學(xué)誘導(dǎo)劑)，或響應(yīng)環(huán)境、激素、化學(xué)信號和/或發(fā)育信號而選擇性表達(dá)可操作地連接的DNA序列。 可誘導(dǎo)的或受調(diào)控的啟動子包括例如受光、熱、脅迫、水澇或干旱、植物激素、創(chuàng)傷或諸如乙醇、茉莉酮酸酯、水楊酸或安全劑之類的化學(xué)品調(diào)控的啟動子。本發(fā)明使用的啟動子包括以下啟動子1)脅迫誘導(dǎo)型RD^A啟動子(Kasuga 等人，(1999), Nature Biotechnol. 17 :287-91) ；2)大麥啟動子 B22E ;B22E 的表達(dá)是發(fā)育中的玉米籽粒中的柄所特異性的(“Primary Structure of a Novel Barley Gene Differentially Expressed in Immature Aleurone Layers (在未成熟糊粉層中差異表達(dá)的新大麥基因的一級結(jié)構(gòu))”。Klemsdal，S. S.等人，Mol. Gen. Genet. 228(1/2) 9-16(1991))；以及 3)玉米啟動子 Zag2( “Identification and molecular characterization of ZAG1, the maize homolog of the Arabidopsis floral homeotic gene AGAM0US (ZAG1-擬南芥花同源異形基因AGAM0US的玉米同系物的鑒定和分子表征)”， Schmidt, R. J.等人，Plant Cell 5(7) :729-737(1993) ；"Structural characterization, chromosomal localization and phylogenetic evaluation of two pairs of AGAMO US-like MADS-box genes from maize (兩對來自玉米的 AGAM0US 樣 MADS-box 基因的結(jié)構(gòu)表征、染色體定位及系統(tǒng)發(fā)育評價(jià))”，Theissen等人，Genel56(2) :155-166(1995) ；NCBI GenBank登錄號X80206))。hg2轉(zhuǎn)錄物可在授粉前5天至授粉后(DAP) 7天至8天被檢測到，并且引導(dǎo)Ciml在發(fā)育中的雌花序的心皮中表達(dá)，Ciml對發(fā)育中的玉米籽粒的籽仁而言是特異性的。Ciml轉(zhuǎn)錄物在授粉前4天至5天至授粉后6天至8天被檢測到。其他可用的啟動子包括可來源于其表達(dá)與發(fā)育中的雌小花母系相關(guān)的基因的任何啟動子。用于調(diào)控本發(fā)明的核苷酸序列在植物中表達(dá)的啟動子是莖特異性啟動子。這種莖特異性啟動子包括苜蓿S2A啟動子(GenBank登錄號EF030816 ；Abrahams等人，Plant Mol. Biol. 27 :513-528(1995))和 S2B 啟動子(GenBank 登錄號:EF030817)等等，將這些文獻(xiàn)以引用的方式并入本文。啟動子可整體源于天然基因，或由源于天然存在的不同啟動子的不同元件構(gòu)成， 或甚至可包含合成的DNA片段。用于本發(fā)明的啟動子可包括RIP2、mLIP15、ZmCORl、Rabl7、CaMV35S, RD29A, B22E、Zag2、SAM合成酶啟動子、泛素啟動子、CaMV 19S、nos、Adh、蔗糖合成酶啟動子、R-等位基因啟動子、維管組織優(yōu)選的啟動子S2A(Genbank登陸號EF030816)和S2B(Genbank登錄號EF030817)及來自玉米的組成型啟動子G0S2。其他啟動子包括根優(yōu)選的啟動子，例如玉米NAS2啟動子、玉米Cyclo啟動子(US2006/0156439，公開于2006年7月13日)、玉米 R00TMET2 啟動子(W005063998,公開于 2005 年 7 月 14 日)、CRlBIO 啟動子(W006055487,公開于2006年5月洸日)、CRWAQ81 (W005035770,公開于2005年4月21日)和玉米ZRP2. 47 啟動子(NCBI 保藏U38790 ；GI No. 1063664)，本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體也可包括其他調(diào)控序列，包括但不限于翻譯前導(dǎo)序列、 內(nèi)含子和多腺苷酸化識別序列。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體還包括增強(qiáng)子或沉默子。內(nèi)含子序列可加至5'非翻譯區(qū)、蛋白編碼區(qū)或3'非翻譯區(qū)以增加積聚在胞漿中的成熟信息的量。已經(jīng)顯示，在植物和動物兩者的表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄單位中包含可剪接內(nèi)含子可使基因表達(dá)在mRNA和蛋白質(zhì)水平上均增強(qiáng)高達(dá)1000倍。參見Buchman和Berg， Mol. Cell Biol. 8 :4395-4405(1988) ；Callis 等人，Genes Dev. 1 :1183-1200 (1987)。任何植物都可選擇用來鑒定將用于本發(fā)明重組DNA構(gòu)建體的調(diào)控序列和Sira基因序列。適用于分離基因和調(diào)控序列的靶植物的實(shí)例應(yīng)該包括但不限于苜蓿、蘋果、杏、擬南芥屬、洋薊、芝麻菜、蘆筍、鱷梨、香蕉、大麥、豆類、甜菜、黑莓、藍(lán)莓、西蘭花、抱子甘藍(lán)、卷心菜、卡諾拉、香瓜、胡蘿卜、木薯、蓖麻、菜花、芹菜、櫻桃、菊苣、芫荽、柑桔類、克萊門氏小柑橘類、三葉草、椰子、咖啡、玉米、棉、蔓越莓、黃瓜、花旗松、茄子、菊苣、茅菜、桉樹、茴香、 無花果、大蒜、葫蘆、葡萄、柚子樹、白蘭瓜、豆薯、獼猴桃、生菜、韭蔥、檸檬、酸橙、火炬松、亞麻子、芒果、甜瓜、蘑菇、油桃、堅(jiān)果、燕麥、油棕、油菜、秋葵、橄欖樹、洋蔥、橙、觀賞植物、棕櫚、木瓜樹、歐芹、歐洲防風(fēng)草、豌豆、桃樹、花生、梨樹、胡椒、柿樹、松樹、菠蘿、大蕉、李樹、 石榴樹、白楊、馬鈴薯、南瓜、溫柏、輻射松、紅菊苣、蘿卜、油菜、樹莓、稻、黑麥、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、楓香樹、柑橘、茶、煙草、蕃茄、黑小麥、 草皮草、蕪菁、葡萄樹、西瓜、小麥、薯蕷和西葫蘆。組合物本發(fā)明的組合物是其基因組中包含本發(fā)明的任何重組DNA構(gòu)建體(包括任何抑制 DNA構(gòu)建體)(例如上面所討論的任何一種構(gòu)建體)的植物。組合物也包括任何植物的子代，以及獲得自植物或其子代的任何種子，其中所述子代或種子在其基因組中包含重組DNA 構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)。子代包括通過植物的自花授粉或異型雜交而獲得的連續(xù)世代。子代也包括雜交和近交。在雜交種子繁殖的農(nóng)作物中，成熟的轉(zhuǎn)基因植物可自花授粉而產(chǎn)生純合的近交系植物。該近交系植物產(chǎn)生含有新導(dǎo)入的重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)的種子。這些種子可生長而產(chǎn)生將會表現(xiàn)出改變的農(nóng)學(xué)特性(例如，任選地在水限制條件下農(nóng)學(xué)特性增加)的植物，或者可用于育種程序以產(chǎn)生雜交種子，這些雜交種子可生長而產(chǎn)生將會表現(xiàn)出如改變的農(nóng)學(xué)特性的植物。所述種子可為玉米種子。植物可為單子葉植物或雙子葉植物，例如玉米或大豆植物，如玉米雜種植物或玉米近交系植物。植物還可為向日葵、高梁、卡諾拉、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥或黍。重組DNA構(gòu)建體可穩(wěn)定地整合進(jìn)植物的基因組中。具體實(shí)施方案包括但不限于下列的1.在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物(例如玉米或大豆植物)，所述重組 DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽， 所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO 18、20、22、24、洸、28、30、 32 或 34 進(jìn)行比較時(shí)具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、 60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%, 75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%, 90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的序列同一性，并且其中所述植物在與未包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時(shí)表現(xiàn)出增強(qiáng)的耐旱性。在與該對照植物比較時(shí)，該植物還可表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。2.在基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物(例如玉米或大豆植物)，所述重組DNA 構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼sira多肽，并且其中在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物比較時(shí)，所述植物表現(xiàn)出增強(qiáng)的耐旱性。在與該對照植物比較時(shí)，該植物還可表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。3.在基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物(例如玉米或大豆植物)，所述重組DNA 構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼sira多肽，并且其中在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時(shí)，所述植物表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。4.在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物(例如玉米或大豆植物)，所述重組 DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽， 所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO 18、20、22、24、洸、28、30、 32 或 34 進(jìn)行比較時(shí)具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、 60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%, 75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%, 90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的序列同一性，并且其中所述植物在與未包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時(shí)表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。5.在基因組中包含抑制DNA構(gòu)建體的植物(例如玉米或大豆植物)，所述抑制DNA 構(gòu)建體包含至少一種可操作地連接來源于所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的全部或部分的區(qū)域的調(diào)控元件，所述區(qū)域的核酸序列基于Clustal V比對方法在與所述區(qū)域所來源的有義鏈或反義鏈的全部或部分比較時(shí)具有至少50 %、51 %、52 %、53 %、54%、55 %、56 %、 57%,58%,59%,60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%, 87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性，并且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼SPR多肽，并且其中所述植物在與不包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時(shí)表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。6.在基因組中包含抑制DNA構(gòu)建體的植物(例如玉米或大豆植物)，所述抑制 DNA構(gòu)建體包含至少一種調(diào)控元件，該調(diào)控元件可操作地連接以下序列的全部或部分(a) 編碼多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO 18、20、22、24、26、28、30、32 或 34 進(jìn)行比較時(shí)具有至少 50%,51 %,52%,53%,54%,55%, 56%,57%,58%,59%,60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%, 71 72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 82%,83%,84%,85%, 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性；或(b) (a)的核酸序列的全長互補(bǔ)序列，并且其中所述植物在與不包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時(shí)表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。7.上述實(shí)施方案1-6中的植物的任何子代、上述實(shí)施方案1-6中的植物的任何種子、上述實(shí)施方案1-6中的植物的子代的任何種子以及來自上述實(shí)施方案1-6中的任何植物以及它們的子代的細(xì)胞。在任何前述實(shí)施方案1-7或本發(fā)明的任何其他實(shí)施方案中，Sira多肽可來自擬南芥、玉米、大豆、煙豆、野大豆或短絨野大豆。在任何前述實(shí)施方案1-7或本發(fā)明的任何其他實(shí)施方案中，重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)可包含至少在植物中有功能的啟動子作為調(diào)控序列。在任何前述實(shí)施方案1-7或本發(fā)明的任何其他實(shí)施方案中，所述至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變是增加或減少。在任何前述實(shí)施方案1-7或本發(fā)明的任何其他實(shí)施方案中，所述至少一種農(nóng)學(xué)特性可選自綠度、產(chǎn)量、生長速率、生物量、成熟時(shí)的鮮重、成熟時(shí)的干重、果實(shí)產(chǎn)量、種子產(chǎn)量、總植物含氮量、果實(shí)含氮量、種子含氮量、營養(yǎng)組織含氮量、總植物氨基酸含量、營養(yǎng)組織游離氨基酸含量、果實(shí)游離氨基酸含量、種子游離氨基酸含量、總植物蛋白質(zhì)含量、果實(shí)蛋白質(zhì)含量、種子蛋白質(zhì)含量、營養(yǎng)組織蛋白質(zhì)含量、耐旱性、氮攝取、根倒伏、收獲指數(shù)、莖倒伏、植物高度、穗高、穗長、早期幼苗活力和在低溫脅迫下的出苗。例如，至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變可為產(chǎn)量、綠度或生物量的增加。在任何前述實(shí)施方案1-7或本發(fā)明的任何其他實(shí)施方案中，在與不包含所述重組 DNA構(gòu)建體(或所述抑制DNA構(gòu)建體)的對照植物在水限制條件下進(jìn)行比較時(shí)，植物可表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。“干旱”指植物可利用的水不足，尤其是當(dāng)時(shí)間延長時(shí)，能夠引起植物損傷或阻止其正常發(fā)育(例如限制植物生長或種子產(chǎn)量)?！澳秃敌浴敝钢参镌诟珊禇l件下存活較長時(shí)間并且基本上不表現(xiàn)出生理或物理退化的特性。植物的“增強(qiáng)的耐旱性”相對于參比植物或?qū)φ罩参镞M(jìn)行測量，它是植物在干旱條件下存活較長時(shí)間，并且相對于在相似干旱條件下生長的參比或?qū)φ罩参锘旧喜槐憩F(xiàn)出相同程度的生理或物理退化的特性。通常當(dāng)轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體或抑制DNA構(gòu)建體時(shí)，它相對于參比或?qū)φ罩参锉憩F(xiàn)出增強(qiáng)的耐旱性，所述參比或?qū)φ罩参镌谄浠蚪M中不包含重組DNA構(gòu)建體或抑制DNA構(gòu)建體。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟悉模擬干旱條件并評價(jià)植物耐旱性的規(guī)程，所述植物已經(jīng)遭受了模擬的或天然存在的干旱條件。例如，技術(shù)人員可通過向植物提供比正常需求較少的水或在一定時(shí)期內(nèi)不提供水來模擬干旱條件，并且技術(shù)人員可通過尋找在生理和/或物理?xiàng)l件上的差異來評價(jià)耐旱性，包括但不限于活力、生長、大小或根長、或具體地講葉片顏色或葉片面積大小。用于評價(jià)耐旱性的其他技術(shù)包括測量葉綠素?zé)晒?、光合作用速率和換氣速率。干旱脅迫實(shí)驗(yàn)可涉及慢性脅迫(即緩慢干燥)和/或可涉及兩種急性脅迫(即突然除去水)，它們由一天或兩次恢復(fù)分開。慢性脅迫可持續(xù)8-10天。急性脅迫可持續(xù)3-5 天。在對轉(zhuǎn)基因植物和相應(yīng)對照植物進(jìn)行干旱脅迫以及良好灌溉處理期間可測量以下變量變量“ ％面積chg_慢性開始-急性2”是介于慢性脅迫第一天和第二次急性脅迫那一天之間的、通過遠(yuǎn)可見光譜成像測定的總面積百分比變化的量度變量“ ％面積chg_慢性開始-慢性結(jié)束”是介于慢性脅迫第一天和慢性脅迫最后一天之間的、通過遠(yuǎn)可見光譜成像測定的總面積百分比變化的量度變量“％面積ChgJg性開始-收獲”是介于慢性脅迫第一天和收獲那一天之間的、 通過遠(yuǎn)可見光譜成像測定的總面積百分比變化的量度變量“ ％面積chg_慢性開始-恢復(fù)M小時(shí)”是介于慢性脅迫第一天和恢復(fù)M小時(shí)(急性脅迫2之后M小時(shí))之間的、通過遠(yuǎn)可見光譜成像測定的總面積百分比變化的量
度變量“psii_急性1”是在第一次急性脅迫末期的光系統(tǒng)II (PSII)效率的量度。它提供對PSII天線吸光效率的評估，并且直接涉及葉片內(nèi)部的二氧化碳同化。變量“psii_急性2”是在第二次急性脅迫末期的光系統(tǒng)II (PSII)效率的量度。它提供對PSII天線吸光效率的評估，并且直接涉及葉片內(nèi)部的二氧化碳同化。變量“fv/fm_急性1”是在第一次急性脅迫末期的最佳量子產(chǎn)率(Fv/Fm)的量度_(最大和最小熒光之間的可變熒光差值/最大熒光)變量“fv/fm_急性2”是在第二次急性脅迫末期的最佳量子產(chǎn)率(Fv/Fm)的量度_(最大和最小熒光之間的可變熒光差值/最大熒光)變量“葉片卷曲_收獲”是在收獲日的頂部圖像對側(cè)面圖像的比率的量度。變量“葉片卷曲_恢復(fù)M小時(shí)”是恢復(fù)M小時(shí)頂部圖像對側(cè)面圖像的比率的量度。變量“比生長速率(SGR) ”指植物總表面積經(jīng)過單獨(dú)一天的變化(通過Lemna Tec Instrument測量)(Y(t) =。Y (t) = Y0*em等同于Y/Δ t的變化％，其中各個(gè)術(shù)語含義如下Y(t) = t時(shí)的總表面積；YO =初始總表面積(估計(jì)值)；r =比生長速率天數(shù)、 以及t =種植后的天數(shù)(“DAP”)變量“苗干重”是將苗置于104°C烘箱96小時(shí)后的苗重量的量度
變量“苗鮮重”是從植物切除后立即稱重的苗重量的量度下文實(shí)例描述一些用于模擬干旱條件和/或評價(jià)耐旱性的代表性規(guī)程和技術(shù)。也可通過在田間測試中比較植物在模擬的或天然存在的干旱條件下(例如通過測量與非干旱條件下相比，在干旱條件下基本等同的產(chǎn)量，或測量與對照或參比植物相比， 在干旱條件下更少的產(chǎn)量損失)保持足夠產(chǎn)量(至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、 81 82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 92%,93%,94%,95%, 96%、97%、98%、99%或100%產(chǎn)量)的能力來評價(jià)耐旱性。在評估或測量其中利用了對照或參照植物的本發(fā)明任何實(shí)施方案(例如，如本文描述的組合物或方法)中的轉(zhuǎn)基因植物的農(nóng)學(xué)特性或表型時(shí)，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將很容易認(rèn)識到要利用的合適對照植物。例如，通過如下非限制性示例來說明1.轉(zhuǎn)化過的植物的子代，該轉(zhuǎn)化過的植物對于重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)來說是半合子的，使得該子代分離成包含或不包含該DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體) 的植物包含所述重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)的子代將通常相對于不包含所述重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)的子代來進(jìn)行測量(即不包含所述重組DNA構(gòu)建體 (或抑制DNA構(gòu)建體)的子代是對照或參照植物)。2.重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)基因滲入至近交系中，例如在玉米中，或基因滲入進(jìn)品種中，例如在大豆中基因滲入品系將通常相對于親本近交系或品種品系進(jìn)行測量(即親本近交系或品種品系是對照或參照植物)。3.雙雜交系，其中第一雜交系由兩個(gè)親本近交系產(chǎn)生，而第二雜交系由相同的兩個(gè)親本近交系產(chǎn)生，不同的是其中一個(gè)親本近交系含有重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)第二雜交系通常將相對于第一雜交系進(jìn)行測量(即第一雜交系為對照植物或參照植物)。4.包含重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)的植物該植物可以相對于這樣的對照植物進(jìn)行評估或測量，該對照植物不包含重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)， 但具有與該植物相當(dāng)?shù)倪z傳背景(例如，與包含重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)的植物相比，核遺傳物質(zhì)具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或100%的序列同一性)。存在許多可用于分析、比較和表征植物遺傳背景的基于實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)；其中這些技術(shù)是同工酶電泳、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA(RAPD)、任何引物聚合成酶鏈反應(yīng)(AP-PCR)、DNA擴(kuò)增指紋(DAF)、序列特異擴(kuò)增區(qū)域 (SCAR)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP )和也稱為微衛(wèi)星的簡單序列重復(fù)(SSR)。此外，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將容易認(rèn)識到，評估或測量轉(zhuǎn)基因植物的農(nóng)學(xué)特性或表型時(shí)合適的對照或參照植物將不包括先前已經(jīng)針對所需的農(nóng)學(xué)特性或表型，通過誘變或轉(zhuǎn)化而選擇的植物。^^ 方法包括但不限于用于增強(qiáng)植物耐旱性的方法、用于評價(jià)植物耐旱性的方法、用于改變植物農(nóng)學(xué)特性的方法、用于測定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法和用于制備種子的方法。 所述植物可為單子葉或雙子葉植物，例如玉米或大豆植物。植物還可為向日葵、高梁、卡諾拉、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥或黍。所述種子可為玉米或大豆種子，例如玉米雜交種子或玉米近交種子。
方法包括但不限于如下方法轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法包括用本發(fā)明的任何分離的多核苷酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞。也包括通過這種方法轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是真核細(xì)胞，例如酵母、昆蟲或植物細(xì)胞，或原核，例如細(xì)菌。生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括用本發(fā)明的任何分離的多核苷酸或重組DNA構(gòu)建體來轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞并從轉(zhuǎn)化過的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明也涉及由該方法制備的轉(zhuǎn)基因植物，以及從該轉(zhuǎn)基因植物中獲得的轉(zhuǎn)基因種子。用于從細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)基中分離本發(fā)明多肽的方法，其中所述細(xì)胞包含具有本發(fā)明多核苷酸的重組DNA構(gòu)建體，所述多核苷酸可操作地連接至少一個(gè)調(diào)控序列，并且其中轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在適于重組DNA構(gòu)建體表達(dá)的條件下生長。改變宿主細(xì)胞中本發(fā)明多肽表達(dá)水平的方法，包括(a)用本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；以及(b)在適于表達(dá)所述重組DNA構(gòu)建體的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化過的細(xì)胞，其中重組DNA構(gòu)建體的表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化過的宿主細(xì)胞中的本發(fā)明多肽含量改變。增強(qiáng)植物耐旱性的方法，包括(a)將重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入到可再生的植物細(xì)胞中， 所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列(例如在植物中有功能的啟動子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID而18、20、22、對、26、沘、30、32或；34進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%、51%、 52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%, 67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%, 97^^98^^99%或100%的序列同一性；和(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體，以及在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時(shí)表現(xiàn)出增強(qiáng)的耐旱性。所述方法還可包括(c)獲得來源于所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體，以及在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物比較時(shí)表現(xiàn)出增強(qiáng)的耐旱性。增強(qiáng)植物耐旱性的方法，包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體導(dǎo)入到可再生的植物細(xì)胞中，所述抑制DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列(例如在植物中有功能的啟動子)的以下序列的全部或部分(i)編碼多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V比對方法在與SEQ ID NO :18、20、22、對、26、沘、30、32或；34進(jìn)行比較時(shí)具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、 65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%, 80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性，或(ii) (a) (i)的核酸序列的全長互補(bǔ)序列；以及(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含抑制DNA構(gòu)建體，以及在與不包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時(shí)表現(xiàn)出增強(qiáng)的耐旱性。所述方法還可包括(c)獲得來源于所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含抑制DNA構(gòu)建體，以及在與不包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對照植物比較時(shí)表現(xiàn)出增強(qiáng)的耐旱性。
增強(qiáng)植物耐旱性的方法，包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體導(dǎo)入到可再生的植物細(xì)胞中，所述抑制DNA構(gòu)建體包含至少一種調(diào)控序列(例如植物中有功能的啟動子)，所述調(diào)控序列可操作地連接來源于所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的全部或部分的區(qū)域，所述區(qū)域的核酸序列基于Clustal V比對方法在與所述區(qū)域所來源的所述有義鏈或反義鏈的全部或部分進(jìn)行比較時(shí)具有至少 50%,51%,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%, 60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%, 75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%, 90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的序列同一性，并且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼sira多肽；以及(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含抑制DNA構(gòu)建體，以及在與不包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時(shí)表現(xiàn)出增強(qiáng)的耐旱性。所述方法還可包括(c)獲得來源于所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含抑制 DNA構(gòu)建體，以及在與不包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對照植物比較時(shí)表現(xiàn)出增強(qiáng)的耐旱性。評價(jià)植物耐旱性的方法，包括(a)將重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入到可再生的植物細(xì)胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列(如在植物中有功能的啟動子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO :18、20、22、對、26、沘、30、32或；34進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%、51%、 52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%, 67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%, 97^^98^^99%或100%的序列同一性；(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及(c)評價(jià)所述轉(zhuǎn)基因植物與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物相比的耐旱性。所述方法還可包括(d)獲得來源于所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體，以及(e)評價(jià)所述子代植物與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物相比的耐旱性。評價(jià)植物耐旱性的方法，包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體導(dǎo)入到可再生的植物細(xì)胞中，所述抑制DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列(例如在植物中有功能的啟動子)的以下序列的全部或部分(i)編碼多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V比對方法在與SEQ ID NO :18、20、22、對、26、沘、30、32或；34進(jìn)行比較時(shí)具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、 65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%, 80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性，或(ii) (a) (i)的核酸序列的全長互補(bǔ)序列；(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含抑制DNA構(gòu)建體；以及(c)評價(jià)所述轉(zhuǎn)基因植物與不包含所述抑制 DNA構(gòu)建體的對照植物相比的耐旱性。所述方法還可包括(d)獲得來源于所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含抑制DNA構(gòu)建體，以及(e)評價(jià)所述子代植物與不包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對照植物相比的耐旱性。
評價(jià)植物耐旱性的方法，包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體導(dǎo)入到可再生的植物細(xì)胞中，所述抑制DNA構(gòu)建體包含至少一種調(diào)控序列(例如植物中有功能的啟動子)，所述調(diào)控序列可操作地連接來源于所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的全部或部分的區(qū)域，所述區(qū)域的核酸序列基于Clustal V比對方法在與所述區(qū)域所來源的所述有義鏈或反義鏈的全部或部分進(jìn)行比較時(shí)具有至少 50%,51%,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%, 60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%, 75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%, 90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的序列同一性，并且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼sira多肽；(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含抑制DNA構(gòu)建體；以及(c)評價(jià)所述轉(zhuǎn)基因植物與不包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對照植物相比的耐旱性。所述方法還可包括(d)獲得來源于所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含抑制 DNA構(gòu)建體，以及(e)評價(jià)所述子代植物與不包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對照植物相比的耐旱性。評價(jià)植物耐旱性的方法，包括(a)將重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入到可再生的植物細(xì)胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列(如在植物中有功能的啟動子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO :18、20、22、對、26、沘、30、32或；34進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%、51%、 52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%, 67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%, 97^^98^^99%或100%的序列同一性；(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；(c)獲得來源于所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及(d)評價(jià)所述子代植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時(shí)的耐旱性。評價(jià)植物耐旱性的方法，包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體導(dǎo)入到可再生的植物細(xì)胞中，所述抑制DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列(例如在植物中有功能的啟動子)的以下序列的全部或部分(i)編碼多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V比對方法在與SEQ ID NO :18、20、22、對、26、沘、30、32或；34進(jìn)行比較時(shí)具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、 65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%, 80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性，或(ii) (a) (i)的核酸序列的全長互補(bǔ)序列；(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含抑制DNA構(gòu)建體；(c)獲得來源于所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述抑制DNA構(gòu)建體；以及(d)評價(jià)所述子代植物與不包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對照植物相比的耐旱性。評價(jià)植物耐旱性的方法，包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體導(dǎo)入到可再生的植物細(xì)胞中，所述抑制DNA構(gòu)建體包含至少一種調(diào)控序列(例如植物中有功能的啟動子)，所述調(diào)控序列可操作地連接來源于所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的全部或部分的區(qū)域，所述區(qū)域的核酸序列基于Clustal V比對方法在與所述區(qū)域所來源的所述有義鏈或反義鏈的全部或部分進(jìn)行比較時(shí)具有至少 50%,51%,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%, 60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%, 75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%, 90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的序列同一性，并且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼sira多肽；(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含抑制DNA構(gòu)建體；以及(c)獲得來源于所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述抑制DNA構(gòu)建體；以及(d)評價(jià)所述子代植物與不包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對照植物相比的耐旱性。測定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法，包括(a)將重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入到可再生的植物細(xì)胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列(例如在植物中有功能的啟動子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID N0:18、20、22、24、26J8、30、32或34進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%、 51 52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,61 62%,63%,64%,65%, 66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%, 81 82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 92%,93%,94%,95%, 96^^97%,98^^99%或100%序列同一性；(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及(c) 確定所述轉(zhuǎn)基因植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時(shí)(任選地在水限制條件下)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。所述方法還可包括(d)獲得來源于所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及(e)確定所述子代植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時(shí)(任選地在水限制條件下)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。測定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法，包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體導(dǎo)入到可再生的植物細(xì)胞中，所述抑制DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列(例如在植物中有功能的啟動子)的以下序列的全部或部分(i)編碼多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO :18、20、22、24、26、沘、30、32或34進(jìn)行比較時(shí)具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、 65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%, 80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性；或(ii)⑴的核酸序列的全長互補(bǔ)序列；(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述抑制DNA構(gòu)建體；以及(c)確定所述轉(zhuǎn)基因植物在與不包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時(shí)(任選地在水限制條件下)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。所述方法還可包括(d)獲得來源于所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述抑制DNA構(gòu)建體；以及(e)確定所述子代植物在與不包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時(shí)(任選地在水限制條件下)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。測定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法，包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體導(dǎo)入到可再生的植物細(xì)胞中，所述抑制DNA構(gòu)建體包含至少一種調(diào)控序列(例如植物中有功能的啟動子)， 所述調(diào)控序列可操作地連接來源于所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的全部或部分的區(qū)域，當(dāng)，所述區(qū)域的核酸序列基于Clustal V比對方法在與所述區(qū)域所來源的所述有義鏈或反義鏈的全部或部分進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%、51%、52%、53%、討％、55%、56%、57%、 58%,59%,60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%, 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性，并且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼sira多肽；(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述抑制DNA構(gòu)建體； 以及(c)確定所述轉(zhuǎn)基因植物在與不包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時(shí)(任選地在水限制條件下)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。所述方法還可包括(d)獲得來源于所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述抑制DNA構(gòu)建體；以及(e)確定所述子代植物在與不包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時(shí) (任選地在水限制條件下)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。測定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法，包括(a)將重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入到可再生的植物細(xì)胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列(例如在植物中有功能的啟動子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO :18、20、22、24、26、沘、30、32或34進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%、 51 52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,61 62%,63%,64%,65%, 66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%, 81 82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 92%,93%,94%,95%, 96^^97%,98^^99%或100%的序列同一性；(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；(c)獲得來源于所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA 構(gòu)建體；以及(d)確定所述子代植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時(shí)(任選地在水限制條件下)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。測定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法，包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體導(dǎo)入到可再生的植物細(xì)胞中，所述抑制DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列(例如在植物中有功能的啟動子)的以下序列的全部或部分(i)編碼多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO :18、20、22、24、26、沘、30、32或34進(jìn)行比較時(shí)具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、 65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%, 80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性；或(ii)⑴的核酸序列的全長互補(bǔ)序列；(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述抑制DNA構(gòu)建體；(c)獲得來源于所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述抑制DNA構(gòu)建體；以及(d)確定所述轉(zhuǎn)基因植物在與不包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時(shí)(任選地在水限制條件下)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。測定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法，包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體導(dǎo)入到可再生的植物細(xì)胞中，所述抑制DNA構(gòu)建體包含至少一種調(diào)控序列(例如植物中有功能的啟動子)，所述調(diào)控序列可操作地連接來源于所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的全部或部分的區(qū)域， 所述區(qū)域的核酸序列基于Clustal V比對方法在與所述區(qū)域所來源的所述有義鏈或反義鏈的全部或部分進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、 59%,60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%, 74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%, 89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性，并且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼sira多肽；(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述抑制DNA構(gòu)建體；(c)獲得來源于所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述抑制DNA 構(gòu)建體；以及(d)確定所述轉(zhuǎn)基因植物在與不包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時(shí)(任選地在水限制條件下)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。產(chǎn)生種子(例如可作為提供耐旱性的產(chǎn)品銷售的種子)的方法，該方法包括任何前述的方法，并且還包括從所述子代植物獲得種子，其中所述種子在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)。在任何前述方法或本發(fā)明方法的任何其他實(shí)施方案中，在所述導(dǎo)入步驟中所述可再生的植物細(xì)胞可包括愈傷組織細(xì)胞、胚胎愈傷組織細(xì)胞、配子細(xì)胞、分生細(xì)胞或未成熟胚芽細(xì)胞?？稍偕闹参锛?xì)胞可來自近交玉米植物。在任何前述方法或本發(fā)明方法的任何其他實(shí)施方案中，所述再生步驟可包括(i) 在包含促胚發(fā)生激素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，直至觀察到愈傷組織；(ii)將步驟(i)的所述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞轉(zhuǎn)移到第一培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基包括促組織形成激素；以及(iii)在第二培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)步驟(ii)后的所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，以允許嫩芽伸長、 根發(fā)育或這兩者同時(shí)發(fā)生。在任何前述方法或本發(fā)明方法的任何其他實(shí)施方案中，所述至少一種農(nóng)學(xué)特性可選自綠度、產(chǎn)量、生長速率、生物量、成熟時(shí)的鮮重、成熟時(shí)的干重、果實(shí)產(chǎn)量、種子產(chǎn)量、總植物含氮量、果實(shí)含氮量、種子含氮量、營養(yǎng)組織含氮量、總植物游離氨基酸含量、營養(yǎng)組織游離氨基酸含量、果實(shí)游離氨基酸含量、種子游離氨基酸含量、總植物蛋白質(zhì)含量、果實(shí)蛋白質(zhì)含量、種子蛋白質(zhì)含量、營養(yǎng)組織蛋白質(zhì)含量、耐旱性、氮攝取、根倒伏、收獲指數(shù)、莖倒伏、植物高度、穗高、穗長、早期幼苗活力和在低溫脅迫下的出苗。至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變可為產(chǎn)量、綠度或生物量的增加。在任何前述方法或本發(fā)明方法的任何其他實(shí)施方案中，在與不包含所述重組DNA 構(gòu)建體(或所述抑制DNA構(gòu)建體)的對照植物在水限制條件下進(jìn)行比較時(shí)，植物可表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。在任何前述方法或本發(fā)明方法的任何其他實(shí)施方案中，存在供選擇的替代方案用于將包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列的多核苷酸的重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入可再生的植物細(xì)胞中。例如，可將調(diào)控序列(例如一種或多種增強(qiáng)子、任選地作為轉(zhuǎn)位因子的部件)導(dǎo)入可再生的植物細(xì)胞，然后篩選其中將所述調(diào)控序列可操作地連接至編碼本發(fā)明多肽的內(nèi)源性基因的事件。將本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入植物可通過任何合適的技術(shù)來進(jìn)行，這些技術(shù)包括但不限于引導(dǎo)DNA攝取、化學(xué)處理、電穿孔、微注射、細(xì)胞融合、感染、載體介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移、轟擊或農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。植物轉(zhuǎn)化和再生技術(shù)已經(jīng)在國際專利公布WO 2009/006276中進(jìn)行了描述，其內(nèi)容以引用方式并入本文。含有編碼受關(guān)注蛋白質(zhì)的外來的外源性分離核酸片段的植物的發(fā)育或再生是本領(lǐng)域所熟知的?？蓪⒃偕闹参镞M(jìn)行自花授粉以產(chǎn)生純合的轉(zhuǎn)基因植物?；蛘?，將得自再生植物的花粉與農(nóng)學(xué)上重要的品系的產(chǎn)生種子的植物進(jìn)行雜交。相反，將來自這些重要品系植物的花粉用于給再生植物授粉。利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法培育含有所需多肽的本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物。
實(shí)施例本發(fā)明將在下面的實(shí)施例中進(jìn)一步說明，其中份數(shù)和百分比是以重量計(jì)并且度數(shù)是攝氏度，除非另外說明。應(yīng)該理解，盡管這些實(shí)施例說明了本發(fā)明的實(shí)施方案，但僅是以例證的方式給出的。根據(jù)上面的論述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不脫離其實(shí)質(zhì)和范圍的情況下，可對本發(fā)明做出各種變化和修改，以使其適用于多種用法和條件。因此，除了本文所示和描述的那些之外，根據(jù)前文所述，本發(fā)明的各種修改形式對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說將是顯而易見的。此類修改形式也旨在涵蓋于所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。實(shí)施例1H有激活標(biāo)記基因白射以南芥屬種群的泡丨備構(gòu)建18. 5kb 的 T-DNA 基二元構(gòu)建體，pHSbarENDs2(圖 1 ;SEQ ID N0:1)，其包含來源于花椰菜花葉病毒35S啟動子的四個(gè)多聚增強(qiáng)子元件(對應(yīng)于序列-341至-64，如 Odell等人Nature 313 :810-812(1985)所定義)。該構(gòu)建體也包含允許質(zhì)粒拯救的載體序列(pUC9)和多接頭、再動員T-DNA的轉(zhuǎn)座子序列(Ds)、以及允許草胺磷選擇轉(zhuǎn)基因植物的 bar基因。原則上，僅將從右邊界(RB)至左邊界(LB)包含的10. 81Λ片段轉(zhuǎn)移到寄主植物基因組中。因?yàn)樵鰪?qiáng)子元件位于靠近RB處，它們可誘導(dǎo)T-DNA整合后的基因組位點(diǎn)順式激活。通過整個(gè)植物的農(nóng)桿菌屬轉(zhuǎn)化制備擬南芥屬激活標(biāo)記種群。將pHSbarENDd構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌菌株C58中，在25°C下在LB中培養(yǎng)至0D600 1. 0。然后離心沉淀細(xì)胞，并重懸在相等體積的5%蔗糖/0.05% Silwet L-77 (OSI Specialties, Inc)中。 在早期抽薹時(shí)，培育擬南芥生態(tài)型Col-O的土壤使用農(nóng)桿菌屬懸浮液進(jìn)行頂部灌溉。一周后，相同植物再次用在蔗糖/Silwet中的相同農(nóng)桿菌屬菌株進(jìn)行頂部灌溉。然后將該植物的種子設(shè)為標(biāo)準(zhǔn)。所得Tl種子在土壤中播種，通過噴灑草胺磷(Finale ；AgrEvo ；Bayer Environmental Science)選擇轉(zhuǎn)基因幼苗。選擇了總計(jì)100，000個(gè)草胺磷抗性Tl幼苗。 分開保存來自每個(gè)品系的T2種子。實(shí)施例2篩選以鑒定耐旱性增強(qiáng)的品系
定量干旱篩選將來自每個(gè)96，000個(gè)分離Tl激活標(biāo)記品系的九個(gè)草胺磷抗性T2 植物每株種植在有kottS Metro-MiX 200 土壤的單個(gè)罐中。每個(gè)淺箱配置有8個(gè)方罐。 每個(gè)方罐頂部填充有土壤。每個(gè)罐(或單元)均播種以產(chǎn)生3X3陣列的9個(gè)草胺磷抗性幼苗。土壤澆水至飽和，然后植物在標(biāo)準(zhǔn)條件下生長(即16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗循環(huán)； 22 0C ； 60%相對濕度)。不提供附加的水。在可見的干旱脅迫癥狀出現(xiàn)時(shí)拍攝植物的數(shù)字圖像。每天拍攝圖像一次(在每天的相同時(shí)間)，直至植物變干。通常收集連續(xù)四天的數(shù)據(jù)。使用顏色分析鑒定潛在的耐旱性品系?？墒褂妙伾治鰷y量進(jìn)入黃色區(qū)的葉片面積百分比的增加。使用色調(diào)、飽和度和強(qiáng)度數(shù)據(jù)(“HSI”)，黃色區(qū)由色調(diào)35至45組成。葉片面積的保持也被用作鑒定潛在耐旱性品系的另一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)閿M南芥屬葉片在干旱脅迫期間萎蔫。葉片面積的保持可用蓮座型葉叢面積隨時(shí)間的減少來測量。葉片面積根據(jù)使用LemnaTec成像系統(tǒng)獲得的綠色像素?cái)?shù)目進(jìn)行測量。激活標(biāo)記和對照(例如野生型)植物在淺箱中并列生長，所述淺箱包含72個(gè)植物(9個(gè)植物/罐)。 當(dāng)萎蔫開始時(shí)，拍攝圖像多日以監(jiān)控萎蔫過程?；谶B續(xù)四天獲得的綠色像素?cái)?shù)，從這些數(shù)據(jù)中測定激活標(biāo)記植物和伴隨的對照植物的萎蔫特征圖。該特征圖選自發(fā)生最大程度萎蔫的四天中的一系列測量結(jié)果。耐旱能力通過激活標(biāo)記植物與對照植物相比的抗萎蔫傾向來測量。使用LemnaTec HTSBonitUV軟件分析CCD圖像。根據(jù)綠色像素?cái)?shù)目獲得對擬南芥屬植物的葉片面積的評估。對每張圖像的數(shù)據(jù)進(jìn)行平均化以獲得對激活標(biāo)記植物和野生型植物的綠色像素值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差的評估。噪聲函數(shù)的參數(shù)通過平方偏差對平均像素?cái)?shù)的直線回歸獲得，使用批中的所有圖像數(shù)據(jù)。平均像素?cái)?shù)數(shù)據(jù)的誤差估計(jì)使用噪聲函數(shù)的擬合參數(shù)進(jìn)行計(jì)算。激活標(biāo)記植物和野生型植物的平均像素?cái)?shù)相加以獲得每張圖像的總?cè)~片面積的評估。具有最大萎蔫的四天間隔通過選擇對應(yīng)于植物生長最大差異的間隔獲得。激活標(biāo)記植物和野生型植物的單個(gè)萎蔫響應(yīng)通過歸一化使用間隔第一天的綠色像素?cái)?shù)值的數(shù)據(jù)獲得。激活標(biāo)記植物與野生型植物相比的耐旱性通過相加經(jīng)過兩天至四天的激活標(biāo)記植物和野生型植物間的萎蔫響應(yīng)的加權(quán)差值來評分；加權(quán)數(shù)通過傳遞數(shù)據(jù)誤差進(jìn)行評估。耐旱性評分為正對應(yīng)于激活標(biāo)記植物與野生型植物相比萎蔫更慢。激活標(biāo)記植物和野生型植物之間的萎蔫響應(yīng)的差異顯著性從平方偏差的加權(quán)和獲得。將在與整個(gè)淺箱的平均值進(jìn)行比較時(shí)具有黃色積聚顯著延遲和/或蓮座型葉叢面積顯著保持的品系命名為Wiase Ihits0在相同分析條件下進(jìn)行Wiase Ihits的重復(fù)試樣再篩選。當(dāng)Wiase 2平行測定的其中一個(gè)或全部顯示與整個(gè)淺箱的平均值有顯著差異時(shí) (評分大于0. 9)，則認(rèn)為該品系是經(jīng)驗(yàn)證的耐旱性品系。實(shí)施例3激活標(biāo)記基因的鑒定在耐旱性品系中側(cè)接T-DNA插入序列的基因使用以下兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方法中的一個(gè)或兩個(gè)進(jìn)行鑒定(1)熱不對稱交錯(cuò)(TAIL) PCR(Liu等人，(1995)，Plant J. 8 :457-63)；和 (2) SAIFF PCR(Siebert 等人，(1995) Nucleic Acids Res. 23 1087-1088)。至于復(fù)雜的多聚T-DNA插入序列品系，TAIL PCR和SAIFF PCR可能均不足以鑒定候選基因。在這些情況下，可使用包括反式PCR、質(zhì)粒拯救和/或基因組文庫構(gòu)建在內(nèi)的其他程序。成功的結(jié)果是其中單個(gè)TAIL或SAIFF PCR片段包含T-DNA邊界序列和擬南芥屬基因組序列?！┇@得側(cè)接T-DNA插入序列的基因組序列標(biāo)記，通過與公開可用的擬南芥屬基因組的序列比對來鑒定候選基因。具體地講，最靠近35S增強(qiáng)子元件/T-DNA RB的注釋基因是激活的基因的候選基因。為了驗(yàn)證鑒定的基因真的靠近T-DNA并排除TAIL/SAIFF片段是嵌合偽克隆的可能性，用一個(gè)T-DNA中的寡核苷酸和一個(gè)候選基因特異性的寡核苷酸進(jìn)行對基因組DNA的診斷PCR。將提供PCR產(chǎn)品的基因組DNA樣本理解為表示T-DNA插入序列。該分析也驗(yàn)證了其中一種以上的插入事件發(fā)生在相同品系中的情況，例如，在TAIL和/或SAIFF PCR分析中鑒定是否有多個(gè)不同基因組片段。實(shí)施例4A激活標(biāo)記SIPR基因的鑒定進(jìn)一步分析顯示耐旱性的激活標(biāo)記品系(No. 104159)。提取來自該品系的DNA，并且在突變品系中側(cè)接T-DNA插入序列的基因通過SAIFF PCR (Siebert等人，Nucleic Acids Res. 23 :1087-1088(1995)).鑒定一個(gè)PCR擴(kuò)增的片段，它包含T-DNA邊界序列和擬南芥屬基因組序列。獲得側(cè)接T-DNA插入序列的基因組序列，通過與完全擬南芥屬基因組的序列比對鑒定候選基因。就給定的T-DNA整合事件而言，最靠近35S增強(qiáng)子元件/T-DNA RB的注釋基因是品系中的活化候選基因。在品系104159的情況下，T-DNA位于Atlg^796(NCBI GI NO. 3766801)的密碼子序列中，其具有指向候選基因Atlg26797 (SEQ ID NO 17 ；NCBIGI No. 30689649)的!35S 增強(qiáng)子元件，編碼 SIPR 多肽(SEQ ID NO :18 ；NCBI GI No. 30689650)。實(shí)施例4B候選耐旱性基因表達(dá)水平的測定功能性的激活標(biāo)記等位基因?qū)?dǎo)致在其中它正常表達(dá)的組織中的候選基因上調(diào)、 在其中它通常不表達(dá)該基因的組織中異常表達(dá)、或者兩種情況都發(fā)生。比較在同源突變品系和野生型品系中的候選基因的表達(dá)水平。使用標(biāo)準(zhǔn)RT-PCR 程序如得自 Qiagen 的Quanti;Tect Reverse ^Transcription。使用肌動蛋白基因的RT-PCR 作為對照物以顯示來自突變品系和野生型的樣本的擴(kuò)增和載入是相似的。最優(yōu)化各個(gè)基因的測定條件。在成熟的蓮座型葉中檢查表達(dá)水平。如果激活標(biāo)記等位基因?qū)е略谄渌M織(例如根)中的異常表達(dá)，通過該檢測分析法它不被檢出。同樣地，陽性結(jié)果是有用的，但是陰性結(jié)果不排除基因不需要進(jìn)行進(jìn)一步的分析。實(shí)施例5經(jīng)由轉(zhuǎn)化到擬南芥屬中驗(yàn)證擬南芥屬候選基因Atlg26797(SIPR多肽)可將候選基因轉(zhuǎn)化到擬南芥屬中并在35S啟動子作用下過表達(dá)。如果在轉(zhuǎn)基因品系中觀察到與親本激活標(biāo)記品系相同或相似的表型，則將該候選基因認(rèn)為是擬南芥屬中驗(yàn)證過的“前導(dǎo)基因”。用以下方法測試候選擬南芥屬SII3R基因(Atlg26797 ;SEQ ID NO 17 ；NCBI GI No. 30689649)賦予耐旱性的能力。
用緊接hvitrogen Gateway C1轉(zhuǎn)化插入序列上游的1. 3kb的35S啟動子構(gòu)建 16. 8kb的T-DNA基二元載體，稱為pBC-yellow (SEQ ID NO :4 ；圖4)。該載體也包含RD29a 啟動子，該啟動子驅(qū)動基因表達(dá)M-Yellowanvitrogen )，它賦予轉(zhuǎn)化過的種子黃色熒光。通過RT-PCR擴(kuò)增Atlg^797cDNA蛋白編碼區(qū)，使用以下引物(l)Atlg26797-5' attB 正向引物(SEQ ID NO 12)ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctccatgctaatcacagttctag(2)Atlg26797-3' attB 反向引物(SEQ ID NO 13)ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcagtcaatctctaagatgtcc正向引物包含attBl 序列(ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT ；SEQ ID NO 10)和共有的Kozak序列(CAACA)鄰近蛋白編碼區(qū)的前19個(gè)核苷酸(以所述cDNA的ATG起始密碼子開頭)。反向引物包含attB2 序列(ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT ； SEQ ID NO 11)，該序列鄰近蛋白編碼區(qū)的反向互補(bǔ)序列的后21個(gè)核苷酸(以所述cDNA的終止密碼子的反向互補(bǔ)序列開頭)。使用INVITROGEN GATEWAY CL0NASE 技術(shù)，用 pD0NR /Zeo (SEQ ID NO :2 ；圖 2) 進(jìn)行BP重組反應(yīng)。這種方法將細(xì)菌致死ccdB基因以及氯霉素抗性基因(CAM)從pDONR / Zeo移除并定向地克隆了在旁側(cè)具有attB 1和attB2位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物而得到入門克隆 PHP32324。該入門克隆與目的載體一起用于隨后的LR重組反應(yīng)如下。用緊接INVITROGEN GATEWAY Cl轉(zhuǎn)化插入序列上游的1. 3kb35S啟動子構(gòu)建稱為pBC-yellow(SEQ ID NO :4 ；圖4)的16. 8kb T-DNA基的二元載體(目的載體)，所述插入序列包含ccdB細(xì)菌致死基因以及側(cè)接attRl和attR2序列的氯霉素抗性基因(CAM)。該載體也包含RD29a啟動子，該啟動子驅(qū)動基因表達(dá)M-Yellow (INVITROGEN )，它賦予轉(zhuǎn)化過的種子黃色熒光。使用INVITROGEN GATEWAY 技術(shù)，對包含定向克隆PCR產(chǎn)物和pBC的 PHP32324入門克隆進(jìn)行LR重組反應(yīng)。這允許迅速的和定向的克隆pBC中在35S啟動子后的候選基因以制備35S啟動子Atlg26797表達(dá)構(gòu)建體，pBC-Yellow_Atlg26797。申請人:然后使用如實(shí)施例1所述的相同農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化程序?qū)?5S啟動子Atlg26797表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入野生型擬南芥屬生態(tài)型Col-O中。轉(zhuǎn)基因Tl種子通過黃色熒光進(jìn)行選擇，并且將Tl種子緊鄰著野生型種子種植并在水限制條件下生長。生長條件和成像分析如實(shí)施例2所述。發(fā)現(xiàn)來自激活標(biāo)記的初始耐旱性表型可在用其中Atlg26797 通過35S啟動子直接表達(dá)的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化過的野生型擬南芥屬植物中重現(xiàn)。通過實(shí)施例2的方法測定的耐旱性評分是1. 934。實(shí)施例6cDNA文庫的制備和cDNA克降的分離和測序cDNA文庫可通過許多可用的方法中的任一種制備。例如，通過首先根據(jù)生產(chǎn)商的說明書(Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA)制備 Uni-ZAP XR 載體中的 cDNA 文庫，可將cDNA導(dǎo)入質(zhì)粒載體中。根據(jù)Mratagene提供的說明書，將Uni-ZAP )(R文庫轉(zhuǎn)換成質(zhì)粒文庫。當(dāng)轉(zhuǎn)換的時(shí)候，將把cDNA插入序列包含于質(zhì)粒載體pBLUESCRIPT 中。此外，可使用iM連接酶(New England Biolabs)將cDNA直接導(dǎo)入預(yù)切過的BLUESCRIPT II SK(+)載體(Stratagene)中，隨后按照制造商規(guī)程(GIBC0 BRL Products)轉(zhuǎn)染DHlOB細(xì)胞。一旦cDNA插入序列處于質(zhì)粒載體中，從隨機(jī)選取的含重組pBLUESCRIPT 質(zhì)粒的細(xì)菌菌落制備質(zhì)粒DNA，或者用對插入的cDNA序列旁側(cè)的載體序列特異性的引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增插入的cDNA序列。將擴(kuò)增的DNA插入序列或質(zhì)粒DNA在引物標(biāo)記法測序反應(yīng)(dye-primer sequencing reaction)中進(jìn)行測序，以產(chǎn)生部分cDNA序列(表達(dá)序列標(biāo)記或“EST，，；參見 Adams 等人，1991 Jcience 252:1651-1656)。用 Perkin Elmer Model 377 熒光測序儀分析所得的EST。用改進(jìn)的轉(zhuǎn)座規(guī)程產(chǎn)生全長插入序列(FIQ數(shù)據(jù)。從歸檔的甘油原種作為單一菌落回收確定了 FIS的克隆，并通過堿性裂解分離質(zhì)粒DNA。將分離的DNA模板在基于PCR的測序反應(yīng)中與載體引物M13正向和反向寡核苷酸反應(yīng)并上樣至自動化的測序儀上。通過與對其進(jìn)行FIS查詢的初始EST序列進(jìn)行序列比對來確認(rèn)克隆鑒定。將確認(rèn)的模板通過基于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Tyl轉(zhuǎn)座因子 (Devine和Boeke (1994) ,Nucleic Acids Res. 22 :3765-377 。該體外轉(zhuǎn)座系統(tǒng)在整個(gè)一組大DNA分子中隨機(jī)地放入獨(dú)特的結(jié)合位點(diǎn)。隨后將轉(zhuǎn)座的DNA用于通過電穿孔轉(zhuǎn)化DHlOB 電感受態(tài)細(xì)胞(GIBCO BRL/Life Technologies, Rockville, MD)。轉(zhuǎn)座因子含有另外的可選標(biāo)記(稱為 DHFR ;Fling 和 Richards (1983)，Nucleic Acids Res. 11 :5147-5158)，使得能在瓊脂平板上僅雙重篩選含有整合的轉(zhuǎn)座子的那些亞克隆。從每次轉(zhuǎn)座反應(yīng)隨機(jī)地選擇多個(gè)亞克隆，通過堿性裂解制備質(zhì)粒DNA，并用對轉(zhuǎn)座子內(nèi)的結(jié)合位點(diǎn)特異性的獨(dú)特引物從轉(zhuǎn)座事件位點(diǎn)向外進(jìn)行測序(ABI PRISM dyeterminator ReadyReaction mix)。收集序列數(shù)據(jù)(ABIPRISM Collections)并用 Phred 和 Phrap (Ewing 等人 (1998)，Genome Res. 8 :175-185 ；Ewing 禾口 Green (1998)Genome Res. 8 :186-194)。 Phred 是一種公用軟件程序，該程序再次讀取ABI序列數(shù)據(jù)，再次調(diào)出(recall)堿基，賦質(zhì)量值， 并將堿基序列(base call)和質(zhì)量值寫入可編輯的輸出文件中。Phrap序列組裝程序使用這些質(zhì)量值來增加組裝的序列重疊群的準(zhǔn)確度。通過Consed序列編輯器(Gordon等人 (1998)，Genome Res. 8 :195-202)。在一些克隆中，cDNA片段可對應(yīng)基因的3'端的一部分并且不會涵蓋整個(gè)開放閱讀框。為了獲得上游信息，使用兩種不同規(guī)程中的一種。這兩種方法中的第一種方法導(dǎo)致產(chǎn)生含有所需基因序列的部分的DNA片段，而第二種方法導(dǎo)致產(chǎn)生含有整個(gè)開放閱讀框的片段。這兩種方法均使用兩輪PCR擴(kuò)增以從一個(gè)或多個(gè)文庫獲得片段。有時(shí)基于以前的知識(特定的基因應(yīng)該存在于某些組織中)選擇文庫，有時(shí)則進(jìn)行隨機(jī)地選擇。獲得相同基因的反應(yīng)可平行地在若干文庫中進(jìn)行，或者在文庫池中進(jìn)行。文庫池通常用3至5個(gè)不同的文庫制備并且使其歸一化而成為一致的稀釋度。在第一輪擴(kuò)增中，兩種方法均使用載體特異性的(正向)引物，同時(shí)還使用基因特異性的(反向)引物，該正向引物對應(yīng)位于克隆 5'端處的載體的一部分。第一種方法使用與已知基因序列的一部分互補(bǔ)的序列，而第二種方法使用與3'非翻譯區(qū)(也稱為UTR)的一部分互補(bǔ)的基因特異性引物。在第二輪擴(kuò)增中，兩種方法均使用套式引物組。按照生產(chǎn)商的說明書，用市售試劑盒將所得DNA片段連接進(jìn) pBLUESCRIPT 載體中。該試劑盒選自可得自包括 INVITR0GEN (Carlsl3ad，CA) ,Promega Biotech (Madison，WI)和 Gibco_BRL(Gaithersburg，MD)在內(nèi)的一些供應(yīng)商的許多試劑盒。 如上所述，將質(zhì)粒DNA通過堿性裂解方法分離并進(jìn)行測序和用Wired/Wrrap進(jìn)行裝配。實(shí)施例7
cDNA克降的鑒定編碼受關(guān)注的多肽的cDNA克隆能通過BLAST(Basic Local Alignment Search Tool ；Altschul等人(1993) J. Mol. Biol. 215 :403-410 ；還可參見國立衛(wèi)生研究院國家醫(yī)學(xué)圖書館的國家生物技術(shù)信息中心的萬維網(wǎng)址上對BLAST算法的解釋)進(jìn)行鑒定，尋找與 BLAST “nr”數(shù)據(jù)庫中所包含氨基酸序列(包括所有非冗余GenBank⑶S翻譯序列、來源于 3維結(jié)構(gòu)Brookhaven蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank)、SWISSPR0T蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫的最新的主要版本、EMBL和DDBJ數(shù)據(jù)庫的序列)的相似性。在所有的閱讀框中翻譯來自克隆的 DNA 并用 NCBI 提供的 BLASTX 算法(Gish 和 Mates，1993，Nat. Genet. 3 :266-272) 比較與“nr”數(shù)據(jù)庫中包含的所有可公開獲得的蛋白質(zhì)序列的相似性。采用國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)提供的BLASTP算法，分析cDNA序列編碼的多肽與包含在“nr”數(shù)據(jù)庫中的所有可公開獲得的氨基酸序列的相似性。為方便起見，通過BLAST計(jì)算僅僅偶然觀察到 cDNA序列與所搜索的數(shù)據(jù)庫中所包含序列的匹配的P值(概率)或E值(期望值)，在本文報(bào)導(dǎo)為“pLog”值，它代表所報(bào)導(dǎo)的P值或E值的負(fù)對數(shù)。因此，pLog值越大，cDNA編碼的序列和BLAST的“匹配”代表同源蛋白的可能性就越大。EST序列能與如上所述的Genbank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較。通過使用BLASTN算法 (Altschul 等人(1997) ,Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402.)對杜邦(DUP0NT )專利數(shù)據(jù)庫比較具有序列同源共有區(qū)域或重疊區(qū)域的核苷酸序列，可找到含更5'端或3'端序列的EST。在兩個(gè)或更多個(gè)核酸片段之間存在共有或重疊序列時(shí)，該序列可裝配成單一的連續(xù)核苷酸序列，從而使最初的片段在5'或3'初始方向上延伸。一旦確定了最5'的EST 后，可以如上所述，通過全長插入序列來確定其完整的序列?？捎胻BLASTn算法，通過將已知基因(來自專有來源或公開數(shù)據(jù)庫的已知基因)的氨基酸序列對EST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較， 可找到屬于不同物種的同源基因。tBLASTn算法對所有6個(gè)閱讀框都翻譯了的核苷酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行氨基酸查詢的搜索。該搜索允許不同物種之間的核苷酸密碼子使用的差異，并且允許密碼子簡并。實(shí)施例8編碼SIPR多肽的cDNA克隆的表征表1(非專利文獻(xiàn))和表2 (專利文獻(xiàn))中顯示的是本文所述的擬南芥屬Sira多肽(SEQ ID NO 18)及其同源物(SEQ ID NO :20、22、24、26、28、30、32 和 34)的 BLASTP 結(jié)果。SEQ ID N0:30由SEQ ID NO : 編碼，并且是NCBI GI No. 297850998提供的公開可用的琴葉擬南芥(Arabidopsis lyrata)序列的截短型。還顯示了每對氨基酸序列的序列同一性百分比值表 權(quán)利要求
1.在基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V比對方法在與SEQ ID NO :18、20、22、對、26、沘、30、32或；34進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%的序列同一性，并且其中所述植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時(shí)表現(xiàn)出增強(qiáng)的耐旱性。
2.權(quán)利要求1的植物，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
3.增強(qiáng)植物耐旱性的方法，包括(a)將重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入到可再生的植物細(xì)胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO :18、20、22、對、26、沘、30、32或；34進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%的序列同一性；以及(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體，以及在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時(shí)表現(xiàn)出增強(qiáng)的耐旱性。
4.權(quán)利要求3的方法，還包括(c)獲得來源于所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體，以及在與不包含所述DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時(shí)表現(xiàn)出增強(qiáng)的耐旱性。
5.評價(jià)植物耐旱性的方法，包括(a)將重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入到可再生的植物細(xì)胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO :18、20、22、對、26、沘、30、32或；34進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%的序列同一性；(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及(c)評價(jià)所述轉(zhuǎn)基因植物與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物相比的耐旱性。
6.權(quán)利要求5的方法，還包括(d)獲得來源于所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及(e)評價(jià)所述子代植物與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物相比的耐旱性。
7.評價(jià)植物耐旱性的方法，包括(a)將重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入到可再生的植物細(xì)胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO :18、20、22、對、26、沘、30、32或；34進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%的序列同一性；(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；(c)獲得來源于所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及(d)評價(jià)所述子代植物與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物相比的耐旱性。
8.權(quán)利要求3的方法，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
9.權(quán)利要求4的方法，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
10.權(quán)利要求5的方法，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
11.權(quán)利要求6的方法，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
12.權(quán)利要求7的方法，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
全文摘要
本發(fā)明涉及分離的多核苷酸和多肽，以及用于提供耐旱性的重組DNA構(gòu)建體、包含這些重組DNA構(gòu)建體的組合物(例如植物或種子)，以及利用這些重組DNA構(gòu)建體的方法。所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至在植物中有功能的啟動子的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼SIPR多肽。
文檔編號A01H5/00GK102575261SQ201080046213
公開日2012年7月11日 申請日期2010年10月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月15日
發(fā)明者H·薩凱, J·馬倫, R·W·威廉斯, S·M·艾倫, S·V·廷蓋, S·盧克 申請人:先鋒國際良種公司, 納幕爾杜邦公司