專利名稱：改造合成的蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白基因Cry2A的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于人工改造合成蘇云金芽胞桿菌(Bt)殺蟲晶體蛋白(ICP)基因的DNA序列及其制備方法。本發(fā)明的DNA序列可作為在轉(zhuǎn)基因抗蟲植物中高效表達(dá)的分子育種的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
蟲害是造成農(nóng)業(yè)生產(chǎn)損失的一個(gè)重要因素。據(jù)統(tǒng)計(jì)，蟲害每年給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)13％。
化學(xué)殺蟲劑曾對(duì)防治蟲害、穩(wěn)定農(nóng)業(yè)生產(chǎn)做出過重要貢獻(xiàn)。隨著人們對(duì)化學(xué)殺蟲劑環(huán)境危害的認(rèn)識(shí)、環(huán)保意識(shí)的日益加強(qiáng)，對(duì)環(huán)境安全的生物殺蟲劑已成為研究的熱點(diǎn)。在生物殺蟲劑中，目前研究最清楚、應(yīng)用最成功的是一類Bt制劑。Bt制劑的有效成分是Bt殺蟲晶體蛋白(ICP)。Bt殺蟲晶體蛋白(ICP)是蘇云金芽胞桿菌在芽胞形成過程中產(chǎn)生的。但生產(chǎn)上也發(fā)現(xiàn)，Bt制劑存在著不穩(wěn)定的問題，一方面在田間易被雨水沖刷流失，藥效短；另一方面，因?yàn)锽t殺蟲劑的活性成份是蛋白質(zhì)，在陽光中紫外線的照射下易被分解而失效。植物轉(zhuǎn)基因的成功為Bt殺蟲晶體蛋白的應(yīng)用提供了一條嶄新途徑。
Bt殺蟲晶體蛋白(ICP)是由Bt基因編碼產(chǎn)生。許多ICP的氨基酸序列存在不同程度的同源性。1989年，Hfte和Whiteley(Hfte H and Whiteley HR，Microbio.Rev.，53241-255)根據(jù)ICP的殺蟲譜及氨基酸序列的同源性將當(dāng)時(shí)發(fā)現(xiàn)的大約42個(gè)基因分為五大類、15個(gè)亞類。其中前四類為晶體蛋白的基因家族(Cry)，第五類被稱為細(xì)胞溶解蛋白基因(Cyt)。CryII基因編碼對(duì)鱗翅目昆蟲有毒性的CryI蛋白，CryII基因編碼對(duì)鱗翅目和雙翅目昆蟲有毒性的CryII蛋白，CryIII基因編碼對(duì)鞘翅目昆蟲有毒性的CryIII蛋白，CryIV基因編碼對(duì)雙翅目昆蟲有毒性的CryIV蛋白。由于新的殺蟲基因的不斷分離鑒定，根據(jù)Hfte和Whiteley的雙重分類方法，1992年，F(xiàn)eitelson等(Feitelson et al.，Bio/Technology，10271-275，1992)對(duì)原有的分類進(jìn)行了補(bǔ)充，將Bt基因分為7大類，29亞類。除原來的5大類，新增加了CryV和CryVI兩大類。隨著新Bt基因數(shù)量的不斷增加，人們發(fā)現(xiàn)原有的分類方法存在氨基酸同源性與殺蟲特異性相互矛盾的問題。因此，在1995年無脊椎病理學(xué)會(huì)年會(huì)上專門成立了由Crickmore等人組成的Bt基因命名委員會(huì)，提出了以殺蟲蛋白氨基酸序列同源性為唯一標(biāo)準(zhǔn)的分類命名體系，將Bt基因分為17大類、36亞類(Crickmore et al，1995)，1996年增補(bǔ)為21大類、44亞類；至2002年8月2日，Bt基因達(dá)到42大類、110亞類，總計(jì)200多個(gè)Bt基因序列。
典型的ICP由兩部分組成，N端的活性片段和C端的結(jié)構(gòu)片段，帶有結(jié)構(gòu)片段的ICP被稱為原毒素。它經(jīng)過蛋白酶的消化作用后，產(chǎn)生有活性的毒性肽。最近有人指出，在N端的活性片段又分為毒性區(qū)和細(xì)胞結(jié)合區(qū)。當(dāng)Bt殺蟲晶體蛋白被靶昆蟲取食后，經(jīng)溶解和酶解兩個(gè)步驟產(chǎn)生活性毒素分子，釋放出的活性毒素可穿過昆蟲中腸道滋養(yǎng)層細(xì)胞空隙直接與消化道上皮細(xì)胞作用。細(xì)胞結(jié)合區(qū)與昆蟲中腸道上皮細(xì)胞的受體特異結(jié)合后，毒性區(qū)直接作用于細(xì)胞膜，使細(xì)胞膜穿孔，破壞細(xì)胞的滲透平衡，最后引起細(xì)胞的裂解。
1987年，Vaeck等(Vaeck et al.，Nature，32833-37，1987)、Barton等(Barton etal.，Plant Physiol.851103-1109，1987)、Fischoff等(fischoff et al.，Bio/Technology，5807-813，1987)獲得了轉(zhuǎn)Bt基因植物。但他們獲得的這些早期的轉(zhuǎn)Bt基因植株的抗蟲性都很弱，難以檢測出mRNA的轉(zhuǎn)錄，蛋白質(zhì)表達(dá)量很低。造成Bt基因在植物中表達(dá)量低的原因有許多例如，1、野生Bt基因中富含AT序列，在植物中表達(dá)的mRNA不穩(wěn)定；2、野生Bt基因中可能存在真核基因的內(nèi)含子切割位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)序列，造成轉(zhuǎn)錄本不完整或轉(zhuǎn)錄本的異常加工；3、微生物與植物在翻譯中對(duì)密碼子的使用頻率上有很大差異，使翻譯效率降低；4、真核基因的5’-UTR序列與原核基因有很大的不同，以及真核基因的3’端需要加尾識(shí)別信號(hào)序列。因此，要使得Bt基因在轉(zhuǎn)基因植物中高效表達(dá)，必須對(duì)野生Bt基因進(jìn)行有效的改造。
1990年Adang等(Adang et al，EP0359472，1990)通過調(diào)整野生基因的A+T含量和密碼子的使用頻率，使其與雙子葉植物基因保持一致，去除了影響基因在植物中表達(dá)的AATGAA，合成了一個(gè)新Btt基因新基因與原基因的同源性為85％，A+T含量下降到正常植物基因的水平(55％)。利用改造的基因轉(zhuǎn)化植物，Bt蛋白的表達(dá)量得到提高。
1991年，Perlak等人(Perlak et al.，PNAS USA，7164 883324-3328 1991)在不改變晶體蛋白氨基酸序列的情況下，對(duì)CrylAb基因進(jìn)行了部分改造或通過人工合成進(jìn)行完全改造，選用植物偏愛的密碼子，去除了原序列中干擾基因在植物中表達(dá)的元件，如ATTTA序列，獲得了PM和FM基因；結(jié)果，轉(zhuǎn)PM和FM基因植物的目標(biāo)蛋白表達(dá)量獲得提高。
1992年，郭三堆等人(郭三堆等，95119563.8，C12N5/32，1995)通過雙鏈合成DNA方法，人工合成了全長1824bp的Cry1Ab和Cry1Ac融合的GFM殺蟲基因，結(jié)果Bt毒蛋白在植物中的表達(dá)量大幅度提高，全合成基因比原基因的表達(dá)量提高了約100倍。之后，許多科學(xué)工作者對(duì)Bt殺蟲基因進(jìn)行了大量的改造研究，并利用改造的Bt殺蟲基因做了大量的植物轉(zhuǎn)化工作，為培育Bt抗蟲植物打下了基礎(chǔ)。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，至今已有部分改良或人工合成的Bt基因(用于轉(zhuǎn)基因植物)專利四十多項(xiàng)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于保持原始蘇云金芽胞桿菌(Bt)Cry2A殺蟲蛋白的氨基酸序列不變的前提下，通過人工改造合成新的Cry2A基因(DNA)序列及其制備方法。本發(fā)明的DNA序列將能夠在植物細(xì)胞中高效表達(dá)，進(jìn)而用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因抗蟲植物本發(fā)明通過以下方案實(shí)現(xiàn)一種Cry2A的蘇云金芽胞桿菌(Bt)DNA序列，它具有核苷酸編碼序列表SEQ.ID No.1所示的序列。還具有如序列表SEQ.ID No.2所示的5’端非編碼的引導(dǎo)序列和序列表SEQID No.3所示的3’端的加尾識(shí)別的序列。
所述的的編碼核苷酸序列SEQ.ID No.1的C+G含量為59.04％，與原始DNA序列的同源性為69.45％。
所述的DNA序列的密碼子組成如
圖1所示。
一種改造合成蘇云金芽胞桿菌(Bt)Cry2A基因DNA序列的方法，所述的方法包括它具有編碼核苷酸序列表SEQ.ID No.1、序列表SEQ.ID No.2所示的5’端非編碼的引導(dǎo)序列和序列表SEQ ID No.3所示的3’端的加尾識(shí)別的核苷酸序列。
所述的DNA序列，包括該DNA序列在植物細(xì)胞中的表達(dá)，更進(jìn)一步的在植物轉(zhuǎn)基因抗蟲育種上的應(yīng)用。具體步驟包括(1)找出植物偏愛的密碼子，在保持原Cry2A蛋白的氨基酸組成不變的情況下，用植物基因偏愛的密碼子置換CryA基因?qū)?yīng)的密碼子，初步獲得一個(gè)改造的DNA序列。(2)排除DNA序列中存在的造成植物基因轉(zhuǎn)錄本不穩(wěn)定的富含AT序列以及常用限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，然后通過置換密碼子的方法進(jìn)行改正消除。(3)用改進(jìn)的Cry2A基因的編碼序列的正鏈和對(duì)應(yīng)的負(fù)鏈進(jìn)行Blast2分析，通過置換密碼子的方法排除基因內(nèi)存在大的反向重復(fù)序列。(4)確定Cry2A基因如序列表SEQ ID NO1所示的編碼序列。(5)在確定的Cry2A基因的編碼序列的5’端添加如序列表SEQ ID NO2所示的序列，在3’端添加如序列表SEQ ID NO3所示的序列。(6)在序列兩端加上進(jìn)一步克隆需要的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列。最終確定如序列表SEQ ID NO4所示的序列。(7)化學(xué)合成如如序列表SEQ ID NO4所示的序列。
以下對(duì)核苷酸序列表進(jìn)行說明1、序列表SEQ ID NO.1是設(shè)計(jì)的Cry2A的編碼序列2、序列表SEQ ID NO..2是序列2 5’端引導(dǎo)序列3、序列表SEQ ID NO.3是3’端加尾識(shí)別信號(hào)和轉(zhuǎn)錄終止序列4、序列表SEQ ID NO.4是合成的Cry2A基因序列附圖及其說明附
圖1是本發(fā)明改造合成的新Cry2A的編碼序列與原始Cry2A編碼序列的密碼子特征比較與已有的Cry2A基因相比，本發(fā)明構(gòu)建合成的新Cry2A基因(DNA)序列可在植物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，并將可用于轉(zhuǎn)基因抗蟲植物的育種上。
具體的實(shí)施方式實(shí)施例1植物基因和Cry2A密碼子偏愛性分析從Genbank中查找原始Cry2A基因的核苷酸編碼序列、找出984條植物基因編碼序列及20條高度表達(dá)的核糖體蛋白基因編碼序列，分別統(tǒng)計(jì)各類基因的密碼子使用頻率，列表1。從中可以發(fā)現(xiàn)，Cry2A基因與植物基因在密碼子的使用上有較大差異，主要表現(xiàn)在Cry2A基因?qū)Φ谌粨u擺堿基為A或T的密碼子有偏愛性，而植物基因密碼子的第三位搖擺堿基偏愛使用G或C。
表1 各類基因密碼子使用頻率統(tǒng)計(jì)Codon 氨基酸 植物基因 植物核糖體蛋白基因 原始Cry2ATAA $ 292 5 1TGA $ 465 5 0TAG $ 227 10 0GCT A 7061 80 9GCC A 101101817GCA A 5519 38 9GCG A 7736 89 5TGT C 1663 15 3TGC C 4454 54 1GAT D 8003 65 24GAC D 103761110GAA E 6316 41 15GAG E 139562004TTT F 4189 20 28TTC F 8711 1085GGT G 5567 82 17GGC G 105491202GGA G 5193 49 16GGG G 5470 49 7CAT H 3123 21 8CAC H 4565 72 3ATT I 5047 46 16ATC I 8608 1475ATA I 2781 6 18AAA K 4817 38 8AAG K 138073751TTA L 1698 1 29TTG L 4270 35 9CTT L 5304 53 12CTC L 8852 1604CTAL 1966 5 6CTGL 7342 71 3ATGM 8337 88 11AATN 4672 25 55AACN 8376 81 13CCTP 4137 43 12CCCP 3893 78 1CCAP 4245 32 11CCGP 4866 62 2CAAQ 4091 31 20CAGQ 8188 109 8CGTR 2145 40 7CGCR 4596 127 0CGAR 1239 13 4CGGR 2808 25 1AGAR 2676 16 18AGGR 5024 93 6TCTS 3586 26 15TCCS 5603 103 4TCAS 3536 22 15TCGS 3296 34 4AGTS 2524 11 18AGCS 5339 41 4ACTT 3639 31 21ACCT 6012 122 6ACAT 3558 17 23ACGT 3356 29 7GTTV 5612 61 15GTCV 7167 125 2GTAV 1989 9 14GTGV 8343 119 6TGGW 4236 29 8TATY 3410 24 24TACY 6851 77 3實(shí)施例2Cry2A基因的密碼子改造及合成的新Cry2A基因的密碼子特征分析依據(jù)表1分析結(jié)果，采用植物基因的偏愛性密碼子置換原始Cry2A的對(duì)應(yīng)密碼子，消除Cry2A基因中ATTTA、AATGAA等富含AT序列和不明確的內(nèi)含子序列，以及排除基因中存在的大的反向重復(fù)序列和常用限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列；設(shè)計(jì)出目標(biāo)合成的Cry2A基因的編碼序列如序列表SEQ IDNO..1所示。目標(biāo)合成的Cry2A基因的密碼子特征如圖2所示。實(shí)施例3合成的新Cry2A編碼序列特征分析將原始Cry2A與合成的新Cry2A編碼序列進(jìn)行Blast2分析，兩條序列的同源性為69.45％。堿基組成的統(tǒng)計(jì)結(jié)果為原始基因的C+G％為34.75％，新合成基因的C+G％為59.04％。編碼的氨基酸序列的Blast2分析顯示，兩者編碼的氨基酸序列完全一致。實(shí)施例4提高基因轉(zhuǎn)錄本在植物細(xì)胞中的穩(wěn)定性和表達(dá)效率的末端序列的添加通過對(duì)植物基因的5’端引導(dǎo)序列的結(jié)構(gòu)分析，設(shè)計(jì)序列2，該序列如序列表序列表SEQ ID NO..2所示，并加在新Cry2A基因編碼序列的5’端。另設(shè)計(jì)的序列如序列表SEQ ID NO..3所示，該序列添加在新Cry2A基因編碼序列的3’端實(shí)施例5進(jìn)一步克隆的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列的添加根據(jù)基因進(jìn)一步克隆的需要，在設(shè)計(jì)序列的5’端添加BamH I內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列g(shù)gatcc，3’端添加Sac I、BamH I和Hind III內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列g(shù)agctcggatccaagctt。實(shí)施例6新Cry2A基因的合成通過以上步驟，設(shè)計(jì)出改造合成的新Cry2A基因序列如序列表序列表SEQ ID NO..4所示。然后通過化學(xué)合成該基因，裝載在質(zhì)粒載體pUC18上。實(shí)施例6合成基因在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)和表達(dá)產(chǎn)物的毒性檢測將合成的新Cry2A基因構(gòu)建到大腸桿菌質(zhì)粒表達(dá)載體pGEX-KG，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B)接種單菌落至20mL LB培養(yǎng)基培養(yǎng)4小時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2-3小時(shí)；然后離心收集菌體，加入20mL無菌水重懸；液氮反復(fù)凍溶6次，離心去菌體，上清液喂食鱗翅目昆蟲菜青蟲和二化螟；毒性鑒定結(jié)果見表2和表3表2本發(fā)明合成的基因表達(dá)產(chǎn)物對(duì)菜青蟲的毒性鑒定
表3合成基因表達(dá)產(chǎn)物對(duì)二化螟的毒性鑒定
例7植物轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建用Sac I和BamH I酶切裝載有新Cry2A基因的質(zhì)粒載體pUC18，電泳回收新Cry2A基因片段，將回收片段裝載到含Ubiquitin啟動(dòng)子的中間過渡質(zhì)粒；然后，用Sma I和Sac I酶切和回收，裝載到植物轉(zhuǎn)基因的雙元Ti質(zhì)粒載體，構(gòu)建成完整的用于植物轉(zhuǎn)基因的表達(dá)載體。
序列表Organization Applicant-----------------------Street獅子山街City武漢State湖北省Country中國PostalCode430070PhoneNumber027-87282038FaxNumber027-8739775EmailAddresszhanghb@mail.hzau.edu.cn<110>OrganizationName華中農(nóng)業(yè)大學(xué)Application Project-------------------<120>Title改造合成的蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白基因Cry2A<130>AppFileReference<140>CurrentAppNumber<141>CurrentFilingDate2002-08-04Sequence--------<213>OrganismName蘇云金芽胞桿菌(Bacilus thuringiensis)<400>PreSequenceString1atgaacaacg tgctgaacag cggcaggacc accatctgcg acgcctacaa tgtcgtggcc 60cacgacccct tcagcttcga gcacaagagc ctggatacga tccagaagga atggatggag 120tggaagcgca cggaccacag cctctacgtc gccccagtgg tcggcactgt gtcgagcttc 180ctgctgaaga aggtgggtag cctcatcggc aagcgcatcc tgtccgagct ctggggcatc 240atcttcccca gcggtagcac caacctgatg caggatatcc tgcgcgagac cgaacagttc 300ctgaaccagc gcctgaacac tgacaccctc gctcgtgtca atgcggacct gatcggcctg 360caggccaaca tcagggagtt caatcaacag gtggacaact tcctcaaccc cacccagaac 420ccagtgccgc tgtccatcac gagctccgtg aacaccatgc agcagctgtt cctgaatcgc 480ctcccgcagt tccagatcca aggctaccag ctcttgctgc tgcccctctt cgctcaggcg 540gccaacatgc acctgagctt catccgcgac gtgatcctga acgctgacga gtggggtatc 600tccgccgcca ccctcaggac ctaccgcgat tacctgcgca actacacccg tgactattcc 660aactactgca tcaacaccta ccagaccgcc ttcaggggcc tcaacacccg cctgcacgac 720atgcttgagt tccgcacata catgttcctg aacgtgttcg aatacgtctc catctggagc 780ctcttcaagt accagagcct gatggtgagc tccggcgcta acctctacgc cagcggttcc 840ggcccacagc aaacccagag cttcaccgcc cagaactggc ccttcctcta cagcctgttc 900caagtgaata gcaactacat cctgtccggc atctccggta ccaggctgtc gatcaccttc 960cccaacatcg gcggtctgcc aggcagcacg accactcact ccctgaacag cgccagggtg1020aactacagcg gcggtgtgag cagcggtctc atcggcgcca ccaatctcaa ccacaacttc1080aactgcagca ccgtgctgcc acccctgtcc acccccttcg ttcgcagctg gctggacagc1140ggcaccgata gggagggcgt ggctaccagc accaactggc agaccgaatc cttccagacc1200actctgagcc tcaggtgcgg tgccttcagc gcccgcggca atagcaacta cttccccgac1260tacttcatcc gcaacattag cggcgtccca ctcgtgatcc gcaacgagga cctgaccagg1320cccctccact acaaccaaat ccgcaacatc gagtccccca gcggcacccc aggtggcgct1380agggcctacc tggtgagcgt gcacaaccgc aagaacaata tctacgccgc taacgagaac1440ggcaccatga tccatctggc ccccgaagac tacaccggct tcaccatcag cccaatccac1500gccacgcagg tgaacaatca aacccgcact ttcatcagcg agaagttcgg caaccagggc1560gacagcctga ggttcgagca gagcaacacc acagcccgct acaccctgcg tggcaatggt1620aactcctaca acctctacct gagggtcagc agcatcggca acagcaccat ccgcgtgacc1680attaacggcc gtgtgtacac cgtgagcaac gtgaacacca ctacgaacaa cgacggtgtc1740aacgataacg gcgctcgctt ctccgacatc aacatcggta atatcgtggc cagcgataac1800accaacgtca ccctggacat caacgtgacc ctcaactccg gcaccccctt cgacctgatg1860aacatcatgt tcgtgcccac caacctgccg ccactctact aatga1905<212>TypeDNA<211>Length1905SequenceNameSEQ ID NO1SequenceDescriptionFeature-------SequenceSEQ ID NO1<221>FeatureKeyCDS<222>LocationFrom1<222>LocationTo1905Other InformationCDSJoinNoSequence--------<213>OrganismName未知<400>PreSequenceString2agactcactc gagcgtcgt cacacgcagc ttgtgcggga tatcatttgc ctgtaaccgg 60tttccttaaa gcgaaaaccc ccccacccaa aggtaaggct 100<212>TypeDNA<211>Length100SequenceNameSEQ ID NO2SequenceDescriptionFeature--------SequenceSEQ ID NO2<221>FeatureKey5′UTR<222>LocationFrom1<222>LocationTo100Other InformationCDSJoinNoSequence--------<213>OrganismName未知<400>PreSequenceString3tgacgaattc ccgatctagt aacatagatg acaccgcgcg cgataattta tcctagtttg 60cgcgctatat tttgttttct atcgcgtatt aaatgtataa ttgcgggact ctaatcataa120aaacccatct cataaataac gtcatgcacc tgaatagatc ttggacaagc gttaggccta180tctgtgcatt acatgttaat tattacatgc ttaacgtaat tcaacagaaa ttatatgata240atcatcgcaa gaccggcaac aggattcaat cttaagaaac tttattgcca aatgtttgaa300cgatcgggga aattc 315<212>TypeDNA<211>Length315SequenceNameSEQ ID NO3SequenceDescriptionFeature-------SequenceSEQ ID NO3<221>FeatureKey3′UTR<222>LocationFrom1<222>LocationTo315Other InformationCDSJoinNoSequence--------<213>OrganismName蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)<400>PreSequenceString4cggatccaga ctcactctga gcgtcgtcac acgcagcttg tgcgggatat catttgcctg 60taaccggttt ccttaaagcg aaaacccccc cacccaaagg taaggctatg aacaacgtgc 120tgaacagcgg caggaccacc atctgcgacg cctacaatgt cgtggcccac gaccccttca 180gcttcgagca caagagcctg gatacgatcc agaaggaatg gatggagtgg aagcgcacgg 240accacagcct ctacgtcgcc ccagtggtcg gcactgtgtc gagcttcctg ctgaagaagg 300tgggtagcct catcggcaag cgcatcctgt ccgagctctg gggcatcatc ttccccagcg 360gtagcaccaa cctgatgcag gatatcctgc gcgagaccga acagttcctg aaccagcgcc 420tgaacactga caccctcgct cgtgtcaatg cggacctgat cggcctgcag gccaacatca 480gggagttcaa tcaacaggtg gacaacttcc tcaaccccac ccagaaccca gtgccgctgt 540ccatcacgag ctccgtgaac accatgcagc agctgttcct gaatcgcctc ccgcagttcc 600agatccaagg ctaccagctc ttgctgctgc ccctcttcgc tcaggcggcc aacatgcacc 660tgagcttcat ccgcgacgtg atcctgaacg ctgacgagtg gggtatctcc gccgccaccc 720tcaggaccta ccgcgattac ctgcgcaact acacccgtga ctattccaac tactgcatca 780acacctacca gaccgccttc aggggcctca acacccgcct gcacgacatg cttgagttcc 840gcacatacat gttcctgaac gtgttcgaat acgtctccat ctggagcctc ttcaagtacc 900agagcctgat ggtgagctcc ggcgctaacc tctacgccag cggttccggc ccacagcaaa 960cccagagctt caccgcccag aactggccct tcctctacag cctgttccaa gtgaatagca1020actacatcct gtccggcatc tccggtacca ggctgtcgat caccttcccc aacatcggcg1080gtctgccagg cagcacgacc actcactccc tgaacagcgc cagggtgaac tacagcggcg1140gtgtgagcag cggtctcatc ggcgccacca atctcaacca caacttcaac tgcagcaccg1200tgctgccacc cctgtccacc cccttcgttc gcagctggct ggacagcggc accgataggg1260agggcgtggc taccagcacc aactggcaga ccgaatcctt ccagaccact ctgagcctca1320ggtgcggtgc cttcagcgcc cgcggcaata gcaactactt ccccgactac ttcatccgca1380acattagcgg cgtcccactc gtgatccgca acgaggacct gaccaggccc ctccactaca1440accaaatccg caacatcgag tcccccagcg gcaccccagg tggcgctagg gcctacctgg1500tgagcgtgca caaccgcaag aacaatatct acgccgctaa cgagaacggc accatgatcc1560atctggcccc cgaagactac accggcttca ccatcagccc aatccacgcc acgcaggtga1620acaatcaaac ccgcactttc atcagcgaga agttcggcaa ccagggcgac agcctgaggt1680tcgagcagag caacaccaca gcccgctaca ccctgcgtgg caatggtaac tcctacaacc1740tctacctgag ggtcagcagc atcggcaaca gcaccatccg cgtgaccatt aacggccgtg1800tgtacaccgt gagcaacgtg aacaccacta cgaacaacga cggtgtcaac gataacggcg1860ctcgcttctc cgacatcaac atcggtaata tcgtggccag cgataacacc aacgtcaccc1920tggacatcaa cgtgaccctc aactccggca cccccttcga cctgatgaac atcatgttcg1980tgcccaccaa cctgccgcca ctctactaat gacgaattcc cgatctagta acatagatga2040caccgcgcgc gataatttat cctagtttgc gcgctatatt ttgttttcta tcgcgtatta2100aatgtataat tgcgggactc taatcataaa aacccatctc ataaataacg tcatgcacct2160gaatagatct tggacaagcg ttaggcctat ctgtgcatta catgttaatt attacatgct2220taacgtaatt caacagaaat tatatgataa tcatcgcaag accggcaaca ggattcaatc2280ttaagaaact ttattgccaa atgtttgaac gatcggggaa attcgagctc ggatccaagc2340ttc 2343<212>TypeDNA<211>Length2343SequenceNameSEQ ID NO4SequenceDescriptionFeature-------SequenceSEQ ID NO4<221>FeatureKeygene<222>LocationFrom11<222>LocationTo2343Other InformationCDSJoinNo
權(quán)利要求
1.一種Cry2A的蘇云金芽胞桿菌(Bt)DNA序列，它具有核苷酸編碼序列表SEQ.ID NO1所示的序列。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA序列，它具有序列表SEQ.ID NO2所示的5’端非編碼的引導(dǎo)序列和序列表SEQ ID NO3所示的3’端的加尾識(shí)別的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA序列，其特征在于編碼核苷酸序列的C+G含量為59.04％，與原始DNA序列的同源性為69.45％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA序列，其特征在于密碼子組成如
圖1所示。
5.一種獲得如權(quán)利要求1所述的DNA序列的方法，其步驟包括，(1)找出植物偏愛的密碼子，在保持原Cry2A蛋白的氨基酸組成不變的情況下，用植物基因偏愛的密碼子置換CryA基因?qū)?yīng)的密碼子，初步獲得一個(gè)改造的DNA序列；(2)排除步驟(1)所述的DNA序列中存在的造成植物基因轉(zhuǎn)錄本不穩(wěn)定的富含AT序列以及常用限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，然后通過置換密碼子的方法進(jìn)行改正消除；(3)用改進(jìn)的Cry2A基因的編碼序列的正鏈和對(duì)應(yīng)的負(fù)鏈進(jìn)行Blast2分析，通過置換密碼子的方法排除基因內(nèi)存在大的反向重復(fù)序列；(4)確定Cry2A基因如序列表SEQ ID NO1所示的編碼序列；(5)在確定的Cry2A基因的編碼序列的5’端添加如序列表SEQ ID NO2所示的序列，在3’端添加如序列表SEQ ID NO3所示的序列；(6)在序列兩端加上進(jìn)一步克隆需要的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列，最終確定如序列表SEQ ID NO4所示的序列；(7)化學(xué)合成如序列表SEQ ID NO4所示的序列。
全文摘要
一種改造合成的蘇云金芽胞桿菌殺蟲蛋白DNA序列Cry2A。其特征在于設(shè)計(jì)并合成了蘇云金芽胞桿菌殺蟲蛋白DNA序列Cry2A；與原始Cry2A DNA序列比較，該DNA序列編碼蛋白的氨基酸組成不變，植物偏愛性密碼子的使用頻率較高，消除了原始DNA序列中的富含AT序列和存在的反向重復(fù)序列以及不明確的真核DNA序列內(nèi)含子序列，C+G含量為59.04％，與原始DNA序列的同源性為69.45％。在編碼序列的5’端添加有引導(dǎo)序列和3’端添加加尾識(shí)別信號(hào)序列。本發(fā)明的DNA序列可在植物細(xì)胞種表達(dá)，并可應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因抗蟲植物的育種上。
文檔編號(hào)A01N63/00GK1480533SQ02139000
公開日2004年3月10日 申請日期2002年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月4日
發(fā)明者林擁軍, 張啟發(fā) 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)