、耳后皮膚和頸部等部位；涂抹完，略變干后，臉部再覆上一片保濕面膜，保持60分鐘，撤下保濕面膜。
[0052]美容者本發(fā)明生物美容產(chǎn)品處理之后當(dāng)天不使用其他化妝品和洗臉，使用爽膚水或膠原蛋白液保持皮膚濕潤(rùn)；一般需間隔7天后連續(xù)使用4-12次，可達(dá)到更佳的醫(yī)學(xué)美容效果，對(duì)皮膚可以祛斑痕、祛皺、美白煥膚以及抗氧化的作用。
[0053]以下，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行說明，但本發(fā)明的技術(shù)范圍不限于這些示例。
[0054]實(shí)施例1人自體表皮細(xì)胞的制備
[0055]由取人0.l-2cm2皮膚，用IX磷酸鹽緩沖液(PBS，pH值7.4，含100IU/ml青霉素和0.lmg/ml鏈霉素)5ml浸潤(rùn)15分鐘，用Iml移液槍吸棄，再用I XPBS (pH值7.4，含100IU/ml青霉素和0.lmg/ml鏈霉素)同樣反復(fù)沖洗，洗滌后用disperse II消化，放置4°C冰箱過夜，第二天取出皮膚用鑷子將表皮和真皮撕開。
[0056]表皮用眼科剪刀剪碎至Imm3左右，用IXPBS洗滌后加入到15ml離心管中，1000轉(zhuǎn)每分種離心5分鐘后棄上清，加入3ml 0.25% (質(zhì)量體積比)胰酶消化30分鐘，其中胰酶含質(zhì)量體積比0.01 % EDTA ;消化后過40 μ m細(xì)胞篩，過濾后加入1ml I XPBS,經(jīng)1000轉(zhuǎn)每分鐘離心10分鐘得到細(xì)胞沉淀，再次1ml IXPBS重懸后，經(jīng)1000轉(zhuǎn)每分鐘離心10分鐘獲得表皮細(xì)胞沉淀，加5ml 0.9%生理鹽水重懸，苔盤蘭計(jì)數(shù)，得到的5.4X 17表皮細(xì)胞放置4°C冰箱存放備用。
[0057]實(shí)施例2人自體成纖維細(xì)胞的制備
[0058]取制備例I中獲得的真皮用眼科剪刀剪碎至Imm3左右，用I XPBS洗滌后加入到15ml離心管中，1000轉(zhuǎn)每分種離心5分鐘后棄上清，加入3ml 0.25%胰酶消化30分鐘，消化后過40 μπι細(xì)胞篩，過濾后加入1ml 1XPBS，經(jīng)1000轉(zhuǎn)每分鐘離心10分鐘得到單細(xì)胞沉淀，再次1ml IXPBS重懸后，經(jīng)1000轉(zhuǎn)每分鐘離心10分鐘獲得單細(xì)胞沉淀，加入a -MEM培養(yǎng)基重懸，苔盤蘭計(jì)數(shù)，用a -MEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、50ng/ml重組人干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、25ng/ml重組人表皮生長(zhǎng)因子和25ng/ml重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)按1-10X 16細(xì)胞/ml加入15ml到75cm2培養(yǎng)瓶中，于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每隔2天更換一次新鮮培養(yǎng)液；
[0059]成纖維細(xì)胞在75cm2培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)融合達(dá)到90%以上，用5ml移液管吸棄培養(yǎng)液，加入0.5ml 0.25%胰酶消化后1000轉(zhuǎn)每分鐘離心5分鐘收集成纖維細(xì)胞；用5ml移液管加入1ml新鮮的a -MEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、50ng/ml重組人干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、25ng/ml重組人表皮生長(zhǎng)因子和25ng/ml重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)，加入到75cm2培養(yǎng)瓶中繼續(xù)在37°C，5% C02培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)，每隔2天換一次新鮮培養(yǎng)液；如此連續(xù)傳代5代培養(yǎng)經(jīng)胰酶消化離心后，獲得4.6X 17的成纖維細(xì)胞，用4.6ml生理鹽水重懸，計(jì)數(shù)，即獲得成纖維細(xì)胞，放置冰箱4°C存放備用。圖1為成纖維細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察生長(zhǎng)圖片，圖1A中為成纖維細(xì)胞第I代時(shí)生長(zhǎng)形態(tài)，成纖維細(xì)胞成長(zhǎng)梭形；圖1B中成纖維細(xì)胞第5代時(shí)生長(zhǎng)形態(tài)，成纖維細(xì)胞成長(zhǎng)梭形更加明現(xiàn)。
[0060]實(shí)施例3人自體表皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞特異蛋白表達(dá)檢測(cè)
[0061]取實(shí)施例1中制備的自體表皮細(xì)胞和實(shí)施例2中制備的成纖維細(xì)胞懸液各I份50yL(2X106個(gè))加入500 μ L預(yù)冷即用型總蛋白提取裂解液(RIPA，北京百泰克公司)(含體積比1%蛋白酶抑制劑，瑞士 Roche公司)，冰上孵育20分鐘后，每分鐘13000轉(zhuǎn)，4°C離心20分鐘。取上清，分裝-80°C保存?zhèn)溆谩０凑斩姿?BCA)蛋白定量試劑盒(武漢博士德公司)使用說明操作，測(cè)定蛋白濃度。以RIPA調(diào)整蛋白濃度，樣品終濃度為l.0yg/μ L，加入5 X蛋白樣品緩沖液，95°C下5分鐘。
[0062]根據(jù)目的蛋白的分子量，配制10%分離膠，濃縮膠濃度為5%。待檢測(cè)蛋白樣品上樣量:20 μ g/孔。電泳條件:濃縮膠丨旦壓90V，約20分鐘；分離膠丨旦壓120V，通過標(biāo)準(zhǔn)分子量預(yù)染蛋白來確定電泳停止時(shí)間。濕轉(zhuǎn)法，轉(zhuǎn)膜條件:300mA恒流；0.45 μπι孔徑PVDF膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間80分鐘。轉(zhuǎn)膜完成后麗春紅染色試劑對(duì)膜進(jìn)行染色，觀察轉(zhuǎn)膜效果。封閉:將膜完全浸沒于5% (mg/mL)牛血清白蛋白(BSA)的轉(zhuǎn)膜緩沖液(含體積比3%吐溫-20，TBST)中，室溫下水平搖床孵育I小時(shí)。
[0063]一抗孵育:5% (mg/mL)BSA-TBST分別稀釋一抗EGF和bFGF(均購(gòu)自美國(guó)Santa公司肌動(dòng)蛋白，Beta actin為內(nèi)參對(duì)照)，4°C水平搖床孵育過夜。
[0064]次日，洗膜:TBST洗3次，每次10分鐘。二抗孵育:5 % (mg/mL) BSA-TBST稀釋二抗，山羊抗兔IgG (H+L)辣根過氧化酶(HRP)和山羊抗鼠IgG (H+L) HRP I: 10000，室溫孵育40分鐘。洗膜:TBST洗膜3次，每次10分鐘?；瘜W(xué)發(fā)光底物ECL滴加到膜的蛋白面，反應(yīng)3-5分鐘；膠片曝光:10秒-5分鐘(曝光時(shí)間隨不同光強(qiáng)度而調(diào)整)，顯影2分鐘，定影。膠片用掃描儀掃描為大于300DPI的TIF格式圖片。
[0065]圖2中為人自體表皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞特異蛋白western blotting檢測(cè)圖片。圖2A為實(shí)施例1中制備的自體表皮細(xì)胞I及其凍存復(fù)蘇后的自體表皮細(xì)胞2的westernblotting檢測(cè)，顯色發(fā)現(xiàn)存在人EGF蛋白分子量6.2kD的條帶，結(jié)果表明兩者均表達(dá)EGF蛋白；圖2B為實(shí)施例2中制備的自體成纖維細(xì)胞I及其凍存復(fù)蘇后的自體成纖維細(xì)胞2的western blotting檢測(cè)，顯色發(fā)現(xiàn)存在人bFGF蛋白分子量17kD的條帶，結(jié)果表明兩者均高表達(dá)bFGF蛋白；陰性對(duì)照為293T細(xì)胞(人腎上皮細(xì)胞系)。
[0066]使用Quantity One分析軟件(B1-Rad公司)進(jìn)行灰度分析，經(jīng)灰度分析結(jié)果顯示EGF蛋白灰度值達(dá)到10900，bFGF蛋白灰度值達(dá)到21300。
[0067]實(shí)施例4自體表皮細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞生物美容產(chǎn)品的制備
[0068]所述自體血漿由抽取人70ml肝素或EDTA抗凝外周血，經(jīng)1000轉(zhuǎn)每分鐘離心10分鐘得到的30ml血漿，再次3000轉(zhuǎn)每分鐘離心10分鐘獲得30ml富含血小板血漿，放置4°C冰箱存放備用。
[0069]分別取5 X 16實(shí)施例1中制備的自體表皮細(xì)胞和實(shí)施例2中制備的成纖維細(xì)胞，加入到5ml自體富含血小板的血漿中，混勻，分別加入10ng靈芝多糖和胎盤提取多肽素，裝入1ml無菌可密封的針管中，制備成含自體表皮細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞的生物美容產(chǎn)品，放置冰箱4°C中保存，保質(zhì)期為48小時(shí)。
[0070]實(shí)施例5白癜風(fēng)皮膚修復(fù)
[0071]白癜風(fēng)患者躺臥在手術(shù)臺(tái)上，使用白癜風(fēng)皮膚進(jìn)行清潔，清水擦洗干凈；麻醉達(dá)成后，以皮膚磨削機(jī)磨削創(chuàng)面達(dá)點(diǎn)狀滲血，盡可能使皮膚磨削厚度均勻一致，腎上腺素鹽水紗布等合適止血后，將通過本發(fā)明實(shí)施例4中制備6ml的含自體表皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的生物美容產(chǎn)品涂抹在皮膚磨削機(jī)磨削創(chuàng)面，納米銀敷料覆蓋，無菌敷料包扎固定，注意適當(dāng)加壓。
[0072]患者減少局部活動(dòng)，患肢抬高