一種奶牛乳腺上皮細胞永生化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及細胞原代培養(yǎng)、單克隆細胞獲得、western blot檢測E6、E7病毒在奶牛乳腺上皮細胞的表達和建立奶牛乳腺上皮細胞系的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]奶牛乳腺上皮細胞(BMEC, Bovine mammary epithelial cell)具有合成和分泌乳蛋白的功能，對微生物入侵乳腺組織具有防御作用。同時，它是乳腺組織重要的反應(yīng)細胞。因此，進行奶牛乳腺上皮細胞的原代培養(yǎng)和細胞永生化被視為奶牛泌乳營養(yǎng)調(diào)控和奶牛乳房炎發(fā)病機制研究重要細胞模型。
[0003]國內(nèi)外基本上采用酶消化法分離培養(yǎng)原代培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細胞(Wang M Z, Xu BL, Wang H R, et al./‘Effects of arginine concentrat1n on the in vitro express1nof casein and mTOR pathway related genes in mammary epithelial cells from dairycattle”，PLos One, 2014(5):e95985)，此方法能夠快速獲得原代奶牛乳腺上皮細胞且成纖維細胞較少。然而，獲得的奶牛乳腺上皮細胞由于經(jīng)過高濃度酶長時間消化，細胞膜的受體蛋白受到嚴重的破壞，導致一系列的信號轉(zhuǎn)導通路受阻，無法很好地實現(xiàn)奶牛乳腺上皮細胞的生理功能。
[0004]在國內(nèi)進行的奶牛乳腺上皮細胞的培養(yǎng)相關(guān)試驗(陳建暉，佟慧麗，李慶章等，“奶牛乳腺上皮細胞系的建立”2009，40 (5):743-747)中，這些細胞只能進行有限的傳代培養(yǎng)，并不能很好的保存奶牛乳腺上皮細胞系。與之相比，國外的奶牛乳腺上皮細胞系傳代次數(shù)較多。然而，在利用奶牛乳腺上皮細胞系進行傳代過程中，隨著細胞傳代數(shù)的增加，奶牛乳腺上皮細胞系將會失去乳腺組織生理功能，如:染色體的核型改變，呈現(xiàn)單倍體或多倍體。染色體數(shù)目改變都將造成試驗數(shù)據(jù)的誤差，甚至使得有些奶牛乳腺上皮細胞系根本不能表達乳蛋白，這樣就失去了利用奶牛乳腺上皮細胞來研究泌乳營養(yǎng)調(diào)控及其泌乳機制的意義。因此，建立功能性的永生化奶牛乳腺上皮細胞系迫在眉睫。
[0005]病毒法是使得細胞永生化的方法之一，能夠有效地將靶基因整合到宿主細胞的基因組中。與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染和電穿孔轉(zhuǎn)基因方法相比，此方法對細胞沒有毒害、感染效率高且能穩(wěn)定表達。目前使細胞永生化的病毒基因較多，如，hTERT、SV40、HPV16E6E7等病毒基因。其中，HPV E6和E7病毒基因是來自于女性宮頸癌細胞表達的產(chǎn)物，能夠使人上皮細胞永生化(Tsao S A, Wang X H, Liu Y, “Establishment of two immortalized nasopharyngealepithelial cell lines using SV401arge T and HPV16E6/E7viral oncogenes，，.B1chimica et B1physica Acta, 2002 (1590): 150-158)。HPV E6 和 E7 病毒基因分別使得人類上皮細胞永生化的兩個重要信號通路pRb_pl6INK4a和p53失活，從而使細胞分別繞過Ml和M2期，最終使細胞具有無限增值的能力。然而，目前尚無HPV E6和E7能夠使奶牛乳腺上皮細胞永生化的報道。因而，將上述人上皮細胞的永生化方法應(yīng)用到奶牛乳腺上皮細胞具有以下幾點難點和疑點:1)在利用病毒法將目的基因轉(zhuǎn)導進入奶牛乳腺上皮細胞內(nèi)時，病毒骨架上的包膜糖蛋白Vsvg是否能夠結(jié)合奶牛乳腺上皮細胞脂質(zhì)，雖然目前研究中，Vsvg蛋白能夠結(jié)合大多數(shù)人或小鼠上皮細胞膜上的脂質(zhì)，但是尚未見其能夠結(jié)合奶牛乳腺上皮細胞膜上的脂質(zhì)的報道；2)由于病毒的滴度低，加上原代奶牛乳腺上皮細胞“無法快速分離導致細胞繁殖慢”的特點，會造成感染細胞效率低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對上述現(xiàn)有技術(shù)中的難點和疑點，本發(fā)明提供了一種高效率地利用HPV E6和E7病毒基因?qū)δ膛Ｈ橄偕掀ぜ毎M行永生化的方法，以及一種建立生長速度快和穩(wěn)定連續(xù)傳代的奶牛乳腺上皮細胞系的方法，從而獲得具有生理功能的奶牛乳腺上皮細胞，為奶牛乳腺上皮細胞的泌乳營養(yǎng)調(diào)控和奶牛乳房炎的發(fā)病機制研究提供實驗細胞素材。
[0007]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0008]本發(fā)明提供了一種奶牛乳腺上皮細胞永生化方法，其特征在于，在采用HPV E6和E7病毒感染原代奶牛乳腺上皮細胞使其永生化時，添加泛嗜性和兼嗜性的病毒顆粒。與增加單一嗜性的病毒顆粒相比，這樣能夠與奶牛乳腺上皮細胞表面結(jié)合更多的跨膜分子，從而增加病毒感染效率。
[0009]其中，采用以下病毒法永生化原代奶牛乳腺上皮細胞，包括以下步驟:
[0010]I)接種奶牛乳腺上皮細胞；
[0011]2)待細胞生長至密度大約為50% -70%時，棄上清液，用PBS清洗細胞；
[0012]3)將泛嗜性和兼嗜性的HPV16E6和E7病毒液加入步驟2)中的奶牛乳腺上皮細胞中；
[0013]4)將步驟3)中獲得的混合液離心，留取上清液；
[0014]5)將步驟4)中獲得的上清液放置37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24h ;
[0015]6)吸棄步驟5)中獲得混合液的上清液，加DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；
[0016]7)待細胞密度匯合至70% -80%時，用抗生素篩選陽性克隆。
[0017]可選地，可以在步驟3)中的泛嗜性和兼嗜性的HPV16E6和E7病毒液中添加聚凝胺以消除混合后病毒和細胞之間產(chǎn)生電荷排斥，使得病毒能夠更好地接觸細胞膜表面，增加感染效率。
[0018]可選地，可以在步驟4)中獲得的上清液中加入表皮生長因子、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-砸元、催乳素和氫化可的松等刺激因子，促進原代奶牛乳腺上皮細胞能夠快速進入細胞的分裂期。由于處于分裂期的細胞更容易被病毒感染，從而最終實現(xiàn)提高病毒轉(zhuǎn)基因效率的目的。
[0019]本發(fā)明還提供了一種建立永生化奶牛乳腺上皮細胞系的方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0020](I)將采集到的奶牛乳腺組織在培養(yǎng)基中剪碎后，將其上清液接種在培養(yǎng)瓶中進行組織塊原代培養(yǎng)。與目前常用的酶消化法相比，這樣培養(yǎng)的細胞有較強的細胞活力，增殖速度快，是一種獲得類似于奶牛體內(nèi)的原代乳腺細胞方法；
[0021](2)采用本發(fā)明上面敘述的病毒法感染原代奶牛乳腺上皮細胞，以使得奶牛乳腺上皮細胞永生化；
[0022](3)篩選陽性克隆，使細胞在形態(tài)、遺傳、染色體穩(wěn)定性和生物學功能上保持一致，進行細胞系的培養(yǎng)。
[0023]優(yōu)選地，在步驟(2)中，當原代奶牛乳腺上皮細胞密度達到50%時就進行病毒感染。與人的乳腺上皮細胞達到70%才進行感染的情況相比，當細胞密度達到50%進行病毒感染，能夠產(chǎn)生更多的陽性克隆，為下一步成功進行單克隆細胞創(chuàng)造條件。
[0024]本發(fā)明的技術(shù)方案實現(xiàn)了如下的有益效果:
[0025](I)在病毒感染奶牛乳腺上皮細胞過程中，由于原代細胞增值緩慢，并且不能夠快速分裂，細胞處于靜息期，這使得病毒很難感染細胞。在本發(fā)明提供的奶牛乳腺上皮細胞永生化方法中，使用泛嗜性和兼嗜性病毒顆粒同時感染奶牛乳腺上皮細胞。由于這兩種病毒顆?？梢愿腥炯毎け砻娌煌目缒し肿?，進而增加泛嗜性以及兼嗜性病毒顆粒的包膜糖蛋白結(jié)合細胞膜表面的脂質(zhì)受體以及GALV和RAMl受體，從而提高病毒感染效率。同時，在本發(fā)明的技術(shù)方案中，也可以在病毒的上清液內(nèi)加入表皮生長因子、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-砸元、催乳素和氫化可的松，從而使原代奶牛乳腺上皮細胞能夠快速進入細胞的分裂期。由于處于分裂期的細胞更容易被病毒感染，從而達到增加轉(zhuǎn)基因效率的目的。
[0026](2)本發(fā)明提供的建立永生化奶牛乳腺上皮細胞系的方法采用組織塊原代培養(yǎng)的方式，使得培養(yǎng)出來的細胞具有較強的細胞活力，增殖速度快。此外，由于在此培養(yǎng)的過程中無需添加細胞生長因子，大大地節(jié)省了成本。
[0027](6)采用本發(fā)明的方法建立的永生化奶牛乳腺上皮細胞系可以永久性保存，避免了多次采集乳腺組織帶來的麻煩，可作為商品化的細胞系。
【附圖說明】
[0028]圖1是奶牛乳腺上皮細胞的細胞形態(tài)電子顯微鏡圖(放大100倍)。其中，(a)是通過HPV16E6和E7永生化的奶牛乳腺上皮細胞；(b)是未轉(zhuǎn)入HPV16E6和E7的第15代的奶牛乳腺上皮細胞。
[0029]圖2是奶牛乳腺上皮細胞角蛋白18免疫熒光顯微鏡照片(放大200倍)。
[0030]圖3是奶牛乳腺上皮細胞染色體核型分析。
[0031]圖4是檢測HPV16E6和HPV16E7病毒蛋白在奶牛乳腺上皮細胞中的表達的Western blot結(jié)果。其中，BMEC:奶牛乳腺上皮細胞；Cask1:女性宮頸癌細胞；BMEC_E6E7:轉(zhuǎn)染入HPV16E6和E7的奶牛乳腺上皮細胞；β -actin: β -肌動蛋白。
【具體實施方式】
[0032]為了闡明本發(fā)明的技術(shù)方案及技術(shù)目的，下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明做進一步的介紹。
[0033]采用病毒法感染原代奶牛乳腺上皮細胞，將HPV16E6和Ε7病毒基因?qū)肽膛Ｈ橄偕掀ぜ毎?1)接種I X 15個奶牛乳腺上皮細胞于6孔板中，2)待細胞生長至密度大約為50%時，棄上清液，用2ml的PBS清洗細胞3次；3)將Iml的泛嗜性病毒液和Iml兼嗜性病毒液加入含有奶牛乳腺上皮細胞6孔板中；4)加入6 μ g/ml聚凝胺，以消除病毒和細胞之間的電荷差異，使病毒能夠更好地接觸細胞膜表面，增加感染效率。雖然聚凝胺對某些細胞有毒，但是對奶牛乳腺上皮細胞毒性并不大，左右擺動6孔板，混合均勻；5)將六孔板放入離心機中，36°C離心90min ；6)在離心后的病毒上清液中加入終濃度為20ng/ml表皮生子因子、I μ g/mL氫化可的松、和4ug/ml催乳素(Sigma)和I倍胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-砸(Invitrigen) ;7)將6孔板放置37°C、5% Co2培養(yǎng)箱中孵育24h ;8)感染過夜之后，將上清液吸棄，加DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；9)待細胞密度匯合至70%時，用300?500 μ g/ml的G 418抗生素篩選陽性克隆，連續(xù)篩選15天。根據(jù)培養(yǎng)基的顏色變化進行換液，一般每隔5天換液。I?3天奶牛乳腺上皮細胞在G 418抗生素作用下死亡不明顯，第4天之后，在G 418抗生素作用奶牛乳腺上皮細胞開始慢慢死亡。第10天，未導入病毒基因的奶牛乳腺上皮細胞全部死亡。然而，培養(yǎng)瓶內(nèi)還有一些奶牛乳腺上皮細胞開始增殖且速度較快，出現(xiàn)