細胞集落。
[0034]在建立永生化的奶牛乳腺上皮細胞系時，具體包括如下步驟:
[0035](I)將奶牛乳腺組織放入含約4?5倍青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中。
[0036](2)將乳腺組織剪碎，反復(fù)清洗，直至上清液清亮，均勻接種在培養(yǎng)瓶中，放入5%C02、37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天。通過細胞刮除、相差消化、相差貼壁法來純化奶牛乳腺上皮細胞，在細胞增殖過程中一些細胞開始衰老。
[0037](3)采用上述實施例1中描述的病毒法，使用HPV16型E6和E7病毒感染原代奶牛乳腺上皮細胞，使該細胞永生化。
[0038](4)待步驟3)中永生化過后的細胞密度匯合至80%，用Iml的胰酶分離消化奶牛乳腺上皮細胞群落，2ml培養(yǎng)基終止消化，吹打懸浮細胞，細胞計數(shù)。通過連續(xù)稀釋使細胞的最終濃度為5?10個/ml。吸取200 μ I細胞懸液接種到96孔板中，使每孔只有I個細胞，總共接種5個96孔板。培養(yǎng)一周后，每個96孔板都會出現(xiàn)克隆。換液，繼續(xù)培養(yǎng)一周。待孔內(nèi)細胞密度匯合至50%時，胰酶消化分離奶牛乳腺上皮細胞，轉(zhuǎn)移到25cm2培養(yǎng)瓶中擴大培養(yǎng)并進一步傳代培養(yǎng)。
[0039]對培養(yǎng)的永生化奶牛乳腺上皮細胞的生長規(guī)律研究和細胞形態(tài)學鑒定:
[0040]在進行細胞生長規(guī)律的研究中，以IX 14個永生化細胞/cm2來接種奶牛乳腺上皮細胞，3天之后奶牛乳腺上皮細胞的密度為60?80%。適合在6孔板和25cm2、75cm2等培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)3天之后，細胞密度仍然是70 %，此結(jié)果說明了細胞在生長過程中，符合一般的細胞生長曲線規(guī)律。
[0041]在進行細胞形態(tài)學特征觀察時，經(jīng)過本發(fā)明病毒感染方法永生化的奶牛乳腺上皮細胞形態(tài)呈現(xiàn)島嶼狀集落生長，有些呈現(xiàn)鋪路石生長。永生化的奶牛乳腺上皮細胞形態(tài)(圖1a)與前10代的未永生化的奶牛乳腺上皮細胞形態(tài)類似，然而其與15代之后的未永生化的奶牛乳腺上皮細胞形態(tài)有些差異。15代之后的未永生化的細胞開始衰老，由此而增大的細胞質(zhì)(細胞體積)可以在圖1b中明顯辨認出來。
[0042]奶牛乳腺上皮細胞角蛋白18的鑒定:
[0043](I)按 IX 14個/cm2細胞密度接種在 4 孔 Chamber Slide ；
[0044](2)待細胞密度為60?80%，PBS洗3次。用4% PFA固定約30min，然后PBS洗3次；
[0045](3) 3%血清室溫封閉20?30min，然后移除血清；
[0046](4)加細胞角蛋白18 一抗(1:200稀釋)，4°C孵育過夜，PBS洗3次；
[0047](5)加熒光素二抗室溫避光孵育lh，PBS洗3次；
[0048](6)核進行DAPI染色，室溫7min ；
[0049](7) PBS洗3次，然后蒸餾水洗I次；
[0050](8)封固劑封片，避光24?48h ；
[0051](9)熒光顯微鏡觀察細胞角蛋白18在奶牛乳腺上皮細胞膜中的表達(圖2):圖中細胞形態(tài)呈現(xiàn)鋪路石和鱗狀等，此結(jié)果說明了單克隆細胞是上皮型。
[0052]奶牛乳腺上皮細胞核型分析:
[0053](I)加秋水仙素:取對數(shù)生長期的奶牛乳腺上皮細胞，加秋水仙素到培養(yǎng)液內(nèi)，終濃度為0.05?0.1 μ g/ml ο 37 °C培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4?5h ;
[0054](2)酶消化分離細胞，轉(zhuǎn)入15ml離心管，室溫1000rpm/min，離心lOmin，收集細胞；
[0055](3)吸去上清液，加入37°C預(yù)熱、0.075mol/L KCl溶液7ml，輕輕吹打均勻，38.5°C水浴鍋中溫育18min ;
[0056](4)懸液中加入新鮮固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)，打勻(輕輕吹打防止細胞破裂)；立即室溫1000rpm/min，離心lOmin，棄上清；
[0057](5)加入新鮮固定液，輕輕吹打混勾，固定30min ；
[0058](6)室溫 1000rpm/min，離心 lOmin，棄上清；
[0059](7)重復(fù)(5)和(6)；
[0060](8)視離心管中細胞量加入固定液，吹打均勻；
[0061](9)立即取出擦鏡紙擦干凈后于冰上預(yù)冷的載玻片。在載玻片上方約Im高處用吸管迅速滴上I?3滴細胞懸液，用嘴輕輕吹散，室溫涼干；
[0062](1)Giemsa工作液染色20min，自來水沖洗室溫晾干。用自來水緩慢從玻片一端沖洗(注意勿先倒去染液或直接對血膜沖洗)，涼干后鏡檢
[0063](11)先用低倍鏡尋找良好的分裂相，再使用高倍油鏡觀察拍照(圖3):
[0064]在圖3中，可以觀察到奶牛乳腺上皮細胞仍然保持著二倍體核型，此結(jié)果說明了采用本發(fā)明方法永生化后的奶牛乳腺上皮細胞依然具有生物學功能和遺傳穩(wěn)定性。
[0065]Western blot檢測HPV16E6E7病毒蛋白在奶牛乳腺上皮細胞中的表達:
[0066](I)細胞總蛋白樣品制備:待陽性奶牛乳腺上皮細胞大量生長，提取奶牛乳腺上皮細胞提取細胞總蛋白。同時，提取原代奶牛乳腺上皮細胞總蛋白(陰性對照)和Caski細胞的總蛋白(陽性對照)，進行Western blot驗證E6和E7病毒基因是否在奶牛乳腺上皮細胞中表達。吸棄培養(yǎng)基用PBS清洗3次，胰酶消化分離奶牛乳腺上皮細胞，4°C 100rpm離心5min，使細胞沉淀，棄上清。根據(jù)細胞數(shù)量加入RIPA裂解液(RIPA:蛋白酶抑制劑=50:1), 一般加入200 μ I的RIPA裂解液，放冰上裂解30min，每隔1min在漩渦振蕩器上漩渦30s，4°C 12000g離心lOmin。小心吸取上清，即細胞總蛋白。測定各個樣品的蛋白濃度，加入RIPA裂解液和蛋白上樣緩沖液使各組間的蛋白濃度一致。沸水浴變性lOmin，使蛋白充分變性。
[0067]⑵SDS-PAGE電泳:安裝好B1_rad制膠架。根據(jù)目的蛋白的分子量大小，配置所需分離膠濃度。按各組分的比例配置12%的分離膠，上下顛倒混勻10次，使之充分反應(yīng)。將液體膠加入玻璃板之間，并用酒精封閉，室溫下分離膠聚合40min。再配置5%濃縮膠，將分離膠上方的殘留酒精用濾紙吸盡，加5%濃縮膠插梳子，禁止泳道間氣泡產(chǎn)生，室溫下聚合40min。將膠放入電泳槽中，小心拔出梳子。將樣品和標準品分別加到樣品孔內(nèi)。100V恒壓跑電泳，直到溴酚藍跑到前沿為止。
[0068](3)轉(zhuǎn)膜:將NC膜和濾紙裁成和膠大小一樣略大的小塊。NC膜和濾紙放入預(yù)冷轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡20min。轉(zhuǎn)膜順序為陰極碳板，海綿，濾紙，膠，膜，濾紙，海綿，陽極碳板。100V，80min在冰浴中進行轉(zhuǎn)膜。
[0069](4)封閉和雜交:根據(jù)目的蛋白和β -actin分子量大小，用剪刀剪下所需NC膜條帶，放入5%脫脂奶粉的封閉液封閉90min。加入β -actin、E6和E7 —抗(1:250稀釋)，4°C慢搖孵育過夜。TBST清洗液清洗6次，每次lOmin。加入二抗(1:3000稀釋)室溫慢搖孵育90min。TBST清洗液清洗6次，每次lOmin。
[0070](5)特異性條帶的檢測:一般使用辣根過氧化物酶HRP-ECL發(fā)光法來檢測目的蛋白。將A液和B液按1:1混合，用濾紙吸干膜上的液體，加發(fā)光液，置于凝膠成像系統(tǒng)曝光(圖4):此結(jié)果說明了 HPV16E6和E7基因被整合至基因組上并穩(wěn)定表達E6E7蛋白，這對奶牛乳腺上皮細胞的永生化具有重要作用。
[0071]以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，本發(fā)明要求保護范圍由所附的權(quán)利要求書、說明書及其等效物界定。
【主權(quán)項】
1.一種奶牛乳腺上皮細胞永生化方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)接種奶牛乳腺上皮細胞； 2)待細胞生長至密度大約為50%-70%時，棄上清液，用PBS清洗細胞； 3)將泛嗜性和兼嗜性的HPV16E6和E7病毒液加入步驟2)中的奶牛乳腺上皮細胞中； 4)將步驟3)中獲得的混合液離心，留取上清液； 5)將步驟4)中獲得的上清液放置37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24h ; 6)吸棄步驟5)中獲得混合液的上清液，加DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)； 7)待細胞密度匯合至70%-80%時，用抗生素篩選陽性克隆。2.如權(quán)利要求1所述的一種奶牛乳腺上皮細胞永生化方法，其特征在于，在步驟3)中的泛嗜性和兼嗜性的HPV16E6和E7病毒液中加入聚凝胺。3.如權(quán)利要求2所述的一種奶牛乳腺上皮細胞永生化方法，其特征在于，所述聚凝胺的濃度為6 μ g/mlo4.如權(quán)利要求1或3所述的一種奶牛乳腺上皮細胞永生化方法，其特征在于，在步驟4)中獲得的上清液中加入刺激因子。5.如權(quán)利要求4所述的一種奶牛乳腺上皮細胞永生化方法，其特征在于，所述刺激因子為表皮生長因子、氫化可的松、催乳素和胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-砸。6.如權(quán)利要求5所述的一種奶牛乳腺上皮細胞永生化方法，其特征在于，所述刺激因子的加入量分別為:終濃度為20ng/ml表皮生子因子、I μ g/mL氫化可的松、和4ug/ml催乳素和I倍胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-砸。7.一種建立永生化奶牛乳腺上皮細胞系的方法，其特征在于，包括以下步驟: a)將采集到的奶牛乳腺組織在培養(yǎng)基中剪碎后，將其上清液接種在培養(yǎng)瓶中進行組織塊原代培養(yǎng)； b)采用權(quán)利要求1所述的方法永生化法奶牛乳腺上皮細胞； c)篩選陽性克隆，進行細胞系的培養(yǎng)。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種奶牛乳腺上皮細胞永生化方法，其特征在于，在采用HPV？E6和E7病毒感染原代奶牛乳腺上皮細胞使其永生化時，添加泛嗜性和兼嗜性病毒顆粒，從而增加病毒感染效率。本發(fā)明還提供了一種建立永生化奶牛乳腺上皮細胞系的方法，包括以下步驟：1)對奶牛乳腺組織在培養(yǎng)瓶中進行組織塊原代培養(yǎng)；2)采用上述的病毒法感染原代奶牛乳腺上皮細胞，以使其永生化；3)篩選陽性克隆，進行細胞系的培養(yǎng)。使用這些方法可以高效率地對奶牛乳腺上皮細胞進行永生化，并且建立生長速度快和穩(wěn)定連續(xù)傳代的奶牛乳腺上皮細胞系，從而獲得具有生理功能的奶牛乳腺上皮細胞，為奶牛乳腺上皮細胞的泌乳營養(yǎng)調(diào)控和奶牛乳房炎的發(fā)病機制研究提供實驗細胞素材。
【IPC分類】C12N5/071
【公開號】CN105176913
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】趙國琦, 詹康, 霍永久, 林淼, 劉明美, 郭靜
【申請人】揚州大學
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年9月23日