一種適于Marc-145細(xì)胞生長的低血清無蛋白培養(yǎng)基及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種適于Marc-145細(xì)胞生長的低血清無蛋 白培養(yǎng)基及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome， PRRS)，俗稱豬藍(lán)耳病，自二十世紀(jì)八十年代末期開始流行，1992年國際獸醫(yī)局正式命名，是 由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的以母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道癥狀為特征的一種接觸 性傳染病。主要感染豬，尤其是母豬，該病嚴(yán)重影響其生殖功能，臨床主要特征為流產(chǎn)、產(chǎn)死 胎、木乃伊胎、弱胎、呼吸困難等，在發(fā)病過程中會(huì)出現(xiàn)短暫性的兩耳皮膚紫紺，曾經(jīng)迅速傳 遍世界各個(gè)養(yǎng)豬國家，在豬群密集、流動(dòng)頻繁的地區(qū)更易流行，常造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。近幾 年，該病在國內(nèi)呈現(xiàn)明顯的高發(fā)趨勢，對養(yǎng)豬業(yè)造成了重大損失，已成為嚴(yán)重威脅我國養(yǎng)豬 業(yè)發(fā)展的重要傳染病之一。
[0003] 接種豬繁殖與呼吸綜合征疫苗是控制豬繁殖與呼吸綜合征的重要手段。而豬繁殖 與呼吸綜合征病毒對Marc-145細(xì)胞尤為敏感，因此，Marc-145細(xì)胞是目前豬繁殖與呼吸綜 合征疫苗的生產(chǎn)用的細(xì)胞株。Marc-145細(xì)胞來源于猴腎細(xì)胞，是成上皮樣細(xì)胞，從母細(xì)胞 (Ma-104細(xì)胞）克隆而得到，可連續(xù)傳代培養(yǎng)。
[0004] 目前，Marc-145細(xì)胞的傳統(tǒng)的培養(yǎng)方式是采用最基礎(chǔ)的合成細(xì)胞培養(yǎng)基、甚至天 然培養(yǎng)基（如水解乳蛋白）加入10%左右的新生牛血清來培養(yǎng)。但是這些動(dòng)物來源成分 帶來明顯的問題，大用量的血清造成細(xì)胞生長對其依賴性大，而血清的成分十分復(fù)雜，不明 確，血清的組分在各個(gè)批次之間都存在一定差異，會(huì)直接影響實(shí)驗(yàn)生產(chǎn)的穩(wěn)定性與連續(xù)性。 血清來源于動(dòng)物，可能含有未知的傳染源，給生物制品帶來極大威脅。最關(guān)鍵的是血清的價(jià) 格十分昂貴，所以，控制血清的使用量是生物制品發(fā)展的趨勢。
[0005] 而現(xiàn)有技術(shù)常通過添加牛血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、重組表皮生長因子等動(dòng) 物源成分以及大豆水解蛋白等植物源蛋白成份，從而來降低血清的使用量。然后這些添加 的蛋白往往對生物制品（如疫苗）造成很大影響，增加下游產(chǎn)品的分離提純的難度，從而降 低產(chǎn)率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明主要提供了一種適于Marc-145細(xì)胞生長的低血清無蛋白培養(yǎng)基及其制備 方法，具有無蛋白、無動(dòng)物源成份、化學(xué)成份明確幾大優(yōu)點(diǎn)，在科研上可減少血清對實(shí)驗(yàn)過 程和結(jié)果的干擾。其技術(shù)方案如下：一種適于Marc-145細(xì)胞生長的低血清無蛋白培養(yǎng)基， 其包括以下組分：
[0007] 氨基酸部分包括以下組分：
[0008] CN 105176915 A 說明書 2/17 頁
CN 105176915 A 說明書 3/17 頁
CN 105176915 A I兄明書 4/17 頁
[0017] 還包括以下其他組分：
[0019] 優(yōu)選的，一種適于Marc-145細(xì)胞生長的低血清無蛋白培養(yǎng)基的組分如下：
[0020] 氨基酸部分：
[0021] 氨基酸部分包括以下組分：
CN 105176915 A 說明書 6/17 頁
CN 105176915 A I兄明書 7/17 頁
[0033] -種適于Marc-145細(xì)胞生長的低血清無蛋白培養(yǎng)基的制備方法，包括如下步驟：
[0034] (1)取干燥后的各組分分別裝入球磨罐內(nèi)，球磨1. 5-3小時(shí)，得培養(yǎng)基干粉；
[0035] (2)將步驟（1)制得的培養(yǎng)基干粉溶解于超純水中，并進(jìn)行定容，用濾菌膜過濾滅 菌，即得適于Marc-145細(xì)胞生長的低血清無蛋白液態(tài)培養(yǎng)基。
[0036] 優(yōu)選的，步驟（1)中球磨時(shí)間為2小時(shí)，步驟（2)中濾菌膜的孔徑為0. 22 μ m。
[0037] 采用上述培養(yǎng)基及其制備方法，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0038] (1)本發(fā)明的培養(yǎng)基，不需要添加動(dòng)物來源蛋白以及植物蛋白、酵母水解物等，血 清使用量又可減少至2% -3%，同時(shí)還能維持細(xì)胞貼壁生長良好，保證了提高細(xì)胞產(chǎn)品生 產(chǎn)的穩(wěn)定性，減少了各種雜蛋白帶來的風(fēng)險(xiǎn)，提高了下游產(chǎn)品的分離純化的效率，本發(fā)明提 供的培養(yǎng)基適用于細(xì)胞的貼壁培養(yǎng)，與微載體等其它技術(shù)結(jié)合，可在搖瓶、生物反應(yīng)器等進(jìn) 行規(guī)?；囵B(yǎng)，從而廣泛用于工業(yè)化生產(chǎn)中；
[0039] (2)本發(fā)明的Marc-145細(xì)胞低血清無蛋白培養(yǎng)基添加2%小牛血清與基礎(chǔ)培養(yǎng)基 添加10%小牛血清進(jìn)行了細(xì)胞培養(yǎng)比較，二者細(xì)胞培養(yǎng)的生長曲線及病毒接毒增殖能力相 近，無顯著差別，本發(fā)明的培養(yǎng)基不改變傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝，不需更換新的生產(chǎn)設(shè)備，就能用低 血清培養(yǎng)出高密度生長的Marc-145細(xì)胞，可用于現(xiàn)有的國內(nèi)生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0040] 圖1為DMEM高糖+10%血清濃度培養(yǎng)的Marc-145細(xì)胞顯微鏡下狀態(tài)圖；
[0041]圖2為使用本發(fā)明的低血清培養(yǎng)基在添加2%小牛血清濃度條件下連續(xù)培養(yǎng)兩個(gè) 月的Marc-145細(xì)胞顯微鏡下狀態(tài)圖；
[0042]圖3為使用本發(fā)明的低血清培養(yǎng)基在添加2%小牛血清濃度條件下培養(yǎng)的 Marc-145細(xì)胞的生長曲線與使用現(xiàn)有的10%小牛血清DMEM高糖培養(yǎng)的Marc-145細(xì)胞的 生長曲線對比圖。
【具體實(shí)施方式】
[0043] 實(shí)施例1
[0044] 本實(shí)施例用于制備適于Marc-145細(xì)胞生長的低血清無蛋白細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0045] 1.培養(yǎng)基的配方
[0046] 表1培養(yǎng)基配方
CN 105176915 A 說明書 9/17 頁
CN 105176915 A ^ ^ Ij 川/17 貝
[0050] 2.制備方法
[0051] (1)取配方中干燥后的各組分分別裝入球磨罐內(nèi)，球磨2小時(shí)，得培養(yǎng)基干粉；
[0052] (2)將步驟（1)制得的培養(yǎng)基干粉共計(jì)16. 53g溶解于900ml超純水中，然后用超 純水定容至1L，用孔徑為0. 22 μ m的濾菌膜過濾滅菌，即得適于Marc-145細(xì)胞生長的低血 清無蛋白液態(tài)培養(yǎng)基，在6°C下冷藏備用。
[0053] 實(shí)施例2
[0054] 本實(shí)施例用于制備適于Marc-145細(xì)胞生長的低血清無蛋白細(xì)胞培養(yǎng)基。1.培養(yǎng) 基的配方
[0055] 表2培養(yǎng)基配方
CN 105176915 A 說明書 12/17 頁
CN 105176915 A 說明書 13/17 頁
[0059] 2.制備方法
[0060] (1)取配方中干燥后的各組分分別裝入球磨罐內(nèi)，球磨1. 5小時(shí)，得培養(yǎng)基干粉；
[0061] (2)將步驟（1)制得的培養(yǎng)基干粉溶解于900ml超純水中，然后用超純水定容至 1L，用孔徑為0. 22 μ m的濾菌膜過濾滅菌，即得適于Marc-145細(xì)胞生長的低血清無蛋白液 態(tài)培養(yǎng)基，在8 °C下冷藏備用。
[0062] 實(shí)施例3
[0063] 本實(shí)施例用于制備適于Marc-145細(xì)胞生長的低血清無蛋白細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0064] 1.培養(yǎng)基的配方
[0065] 表3培養(yǎng)基配方
CN 105176915 A 說明書 14/17 頁
CN 105176915 A 說明書 15/17 頁
CN 105176915 A I兄明"fb 16/17 頁
[0070] 2.制備方法
[0071] (1)取配方中干燥后的各組分分別裝入球磨罐內(nèi)，球磨3小時(shí)，得培養(yǎng)基干粉；
[0072] (2)將步驟⑴制得的培養(yǎng)基干粉溶解于900ml超純水中，然后用超純水定容至 1L，用孔徑為0. 22 μ m的濾菌膜過濾滅菌，即得適于Marc-145細(xì)胞生長的低血清無蛋白液 態(tài)培養(yǎng)基，在4°C下冷藏備用。
[0073] 實(shí)施例4
[0074] 本實(shí)施例用于說