明本發(fā)明的適用于Marc-145細(xì)胞生長的低血清無蛋白細(xì)胞培養(yǎng) 基液體的實(shí)驗(yàn)室使用方法。
[0075] I. Marc-145 細(xì)胞培養(yǎng)
[0076] a)在現(xiàn)有的DMEM高糖培養(yǎng)基（DMEM高糖培養(yǎng)基為已知且成分確定的含各種氨基 酸和葡萄糖的培養(yǎng)基）中加入10%濃度小牛血清培養(yǎng)的Marc-145細(xì)胞，生長至鋪滿T25方 瓶底部約80-90 %后，去掉培養(yǎng)液，用不含鈣鎂的無菌PBS液（0. 2ml/cm2)漂洗細(xì)胞；
[0077] b)加入含 0· 25% (w/v)胰蛋白酶和 0· 02% (w/v)EDTA 的無菌消化液（0· 2ml/cm2) 后，置于5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱，37°C孵育至細(xì)胞收縮變圓，吸出消化液，加入培養(yǎng)基吹 打均勻后傳代，接種密度為1~2X105cells/ml。
[0078] 2.用本發(fā)明的培養(yǎng)基對(duì)Marc-145細(xì)胞進(jìn)行低血清馴化
[0079] 采用直接法或逐步降血清適應(yīng)法進(jìn)行Marc-145細(xì)胞低血清培養(yǎng)的適應(yīng)和馴化。
[0080] a)直接法：將上述穩(wěn)定生長的細(xì)胞直接接種到實(shí)施例1、2、或3制備完成的低血清 無蛋白培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)添加2%的小牛血清，待其生長狀態(tài)穩(wěn)定且能連 續(xù)傳代后即代表馴化成功。
[0081] b)逐步降血清適應(yīng)法：將上述穩(wěn)定生長的細(xì)胞接種于含10%小牛血清濃度的本 發(fā)明的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，逐步降低培養(yǎng)基中的血清含量，即血清含量分別從1〇%、5%最 終降至2%，進(jìn)行細(xì)胞持續(xù)的2 %低血清培養(yǎng)，在每一血清濃度下，細(xì)胞進(jìn)行持續(xù)傳代，待狀 態(tài)穩(wěn)定后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含更低濃度血清的培養(yǎng)基中，直至完全適應(yīng)低血清無蛋白培養(yǎng)基， 上述使用的本發(fā)明的培養(yǎng)基均為實(shí)施例1、2或3中制備完成的培養(yǎng)基。
[0082] 結(jié)果分析：在含有10%小牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)的Marc-145細(xì)胞，采用 直接法和逐步降血清適應(yīng)法均能成功地將Marc-145細(xì)胞從10 %小牛血清培養(yǎng)適應(yīng)到本發(fā) 明中的2%低血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
[0083] 直接法馴化過程時(shí)間短，但適應(yīng)過程初期細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)明顯的不適應(yīng)性，而在逐步 降血清適應(yīng)過程中細(xì)胞并未出現(xiàn)太明顯的不適應(yīng)現(xiàn)象。不管是直接或者是間接的方法降 血清培養(yǎng)馴化，本發(fā)明中的低血清無蛋白培養(yǎng)基在2%小牛血清濃度條件下都能很好地為 Marc-145細(xì)胞提供了一個(gè)合適的生長環(huán)境。
[0084] 圖1為DMEM高糖+10%小牛血清濃度培養(yǎng)的Marc-145細(xì)胞圖片，圖2為使用本發(fā) 明的低血清培養(yǎng)基在添加2 %小牛血清條件下連續(xù)培養(yǎng)兩個(gè)月的Marc-145細(xì)胞圖片。由圖 1和圖2對(duì)比可知，采用本發(fā)明的培養(yǎng)基在2%小牛血清條件下更適于Marc-145細(xì)胞的生 長。
[0085] 實(shí)施例5
[0086] 本實(shí)施例用于說明本發(fā)明的適于Marc-145細(xì)胞生長的低血清無蛋白細(xì)胞培養(yǎng)基 培養(yǎng)細(xì)胞更優(yōu)于常規(guī)使用10 %小牛血清濃度培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。
[0087] 細(xì)胞生長曲線測(cè)定：將現(xiàn)有的加入10%小牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞、 加入2%小牛血清的實(shí)施例1中培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞分別接種于12孔板中，I X IO5ceIls/孔， 并用對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)，每隔24h測(cè)一次細(xì)胞密度，每種細(xì)胞每次取3孔，胰酶消化后，用臺(tái)盼 藍(lán)染色計(jì)數(shù)。
[0088] 結(jié)果分析：兩種培養(yǎng)體系培養(yǎng)的細(xì)胞生長動(dòng)力曲線，如圖3所顯示，2%低血清 培養(yǎng)的Marc-145細(xì)胞的生長速度與10 %小牛血清DMEM高糖培養(yǎng)的Marc-145細(xì)胞形態(tài) 沒有明顯差異，2 %低血清培養(yǎng)的Marc-145細(xì)胞相較于10 %小牛血清DMEM高糖培養(yǎng)的 Marc-145細(xì)胞生長速度和細(xì)胞數(shù)量也稍有優(yōu)勢(shì)。由此可知，采用本發(fā)明制備的培養(yǎng)基適用 于2%低血清培養(yǎng)環(huán)境，能夠減少血清用量，節(jié)約成本。
[0089] 對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，可根據(jù)以上描述的技術(shù)方案以及構(gòu)思，做出其它各種 相應(yīng)的改變以及形變，而所有的這些改變以及形變都應(yīng)該屬于本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍 之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種適于Marc-145細(xì)胞生長的低血清無蛋白培養(yǎng)基，其特征在于：其包括以下組 分： 氨基酸部分包括以下組分：? 維生素部分包括以下組分：無機(jī)鹽部分：微量元素部分包括以下組分：還包括以下其他組分： 胸苷 0· 1-lmg/L 次黃嘌呤l-10mg/L 亞油酸 0· Ol-lmg/L D-葡萄糖 3000-5000mg/L 酚紅 l-20mg/L HEPES 1000-4000mg/L〇2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種適于Marc-145細(xì)胞生長的低血清無蛋白培養(yǎng)基，其特征 在于：其包括以下組分： 氨基酸部分包括以下組分： L-天冬氨酸3.33mg/L L-精氨酸鹽酸鹽136.75 mg/L L-天冬酰胺3.75 mg/L L-半胱氨酸鹽酸鹽31 mg/L L-谷氨酸3,5 mg/L L-谷氨酰胺584 mg/L L-甘氨酸10.06mg/L L-組氨酸鹽酸鹽36.71mg/L L-異亮氨酸53.2 mg/L L-亮氨酸53.2 mg/L L-蛋氨酸16.68mg/L L-賴氨酸鹽酸鹽86.56mg/L .L-苯丙氨酸34.6 mg/L L-脯氨酸8.63mg/L L-絲氨酸 12.5mg/L L-蘇氨酸 58.5mg/L L-色氨酸 9.8mg/L L-酪氨酸 37.45 mg/L L-綴氣酸 _S0.14._mg/L L-丙氣酸 2.45m_g/L L-羥脯氨酸4.09 mg/L L-胱氨酸鹽酸鹽17.62 mg/L， 維生素部分包括以下組分： 丙酮酸鈉 llOmg/L 生物素0.002625 mg/L 煙酰胺 1,56 mg/L 硫摩酸 0,:0525 mg/L 腐胺0.0405 mg/L 鹽酸吡哆醇0.0155 mg/L 鹽酸吡多醛1.5 mg/L D-泛酸鈣1.83 mg/L 核黃素0.23 mg/L 氯化膽堿4.98 mg/L 鹽酸硫胺3,87 mg/L_ 葉酸2,3_mg/L i-肌醇 9.90 mg/L VB12 0.515 mg/L, 無機(jī)鹽部分包括以下組分： 無水氯化鈣158.3 mg/L 氯化鉀355.9 mg/L :硝遊鉀().062 mg/L Λ：水硫酸鎊 73.26 mg/L 無水磷酸氫二鈉53,51 mg/L 無水磷酸二氫鈉88.05 mg/L M化鈉6900 mg/L 八水氣化鎂21.32 mg/L, 微量元素部分包括以下組分：還包括以下其他組分： 胸苷 0· 17mg/L 次黃嘌呤L 02mg/L 亞油酸 0· 022mg/L D-葡萄糖 4500mg/L 酚紅 9. 57mg/L HEPES 2979mg/L〇3. -種如權(quán)利要求1所述的適于Marc-145細(xì)胞生長的低血清無蛋白培養(yǎng)基的制備方 法，其特征在于：包括如下步驟： (1) 取干燥后的各組分分別裝入球磨罐內(nèi)，球磨1. 5-3小時(shí)，得培養(yǎng)基干粉； (2) 將步驟（1)制得的培養(yǎng)基干粉溶解于超純水中，并進(jìn)行定容，用濾菌膜過濾滅菌， 即得適于Marc-145細(xì)胞生長的低血清無蛋白液態(tài)培養(yǎng)基。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的適于Marc-145細(xì)胞生長的低血清無蛋白培養(yǎng)基的制備方法， 其特征在于：步驟（1)中球磨時(shí)間為2小時(shí)，步驟（2)中濾菌膜的孔徑為0. 22 μ m。
【專利摘要】本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種適于Marc-145細(xì)胞生長的低血清無蛋白培養(yǎng)基及其制備方法，所述培養(yǎng)基包括氨基酸、維生素、無機(jī)鹽、微量元素及其他組分。本發(fā)明制備的適于Marc-145細(xì)胞生長的低血清無蛋白培養(yǎng)基及其制備方法，具有無蛋白、無動(dòng)物源成份、化學(xué)成份明確幾大優(yōu)點(diǎn)，在工業(yè)上減少了血清對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)過程的干擾，降低了生產(chǎn)成本，為細(xì)胞的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)帶來極大方便。
【IPC分類】C12N5/071
【公開號(hào)】CN105176915
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】陳文均, 徐念沁, 陳巧云
【申請(qǐng)人】南京三生生物技術(shù)有限公司
【公開日】2015年12月23日
【申請(qǐng)日】2015年10月15日