本發(fā)明涉及一種評估抗菌肽之抗菌力之系統(tǒng)及其使用方法，其是通過規(guī)律移動抗菌肽上的氨基酸而產生的具有不同抗菌效果的多肽，并用新創(chuàng)的計算機平臺來評估/預測抗菌肽的抗菌效果。

技術背景

抗生素可分為二種，一為是由天然微生物(包括細菌、真菌、放線菌屬)所產生的一種具有抑制其它微生物生長、生存的次級代謝產物，另一類系通過化學方法合成或半合成的類似化合物。其可包括抗細菌抗生素、抗真菌抗生素以及抑制其他微小病原的抗生素；但臨床實驗中，抗生素通常是指抗細菌抗生素。自從抗生素被發(fā)現(xiàn)至今，已被大量使用乃至濫用，使得具有抗藥性的病菌越來越多，人類用來對抗病菌的抗生素武器中持續(xù)有效的已愈來愈少，因此積極開發(fā)新的、更有效的“抗生素”藥物為目前制藥產業(yè)亟待發(fā)展的目標之一。

據美國數(shù)據庫公司FierceBiotech發(fā)布的數(shù)據顯示，全球抗生素市場，預計從2013年到2018年之間，以1.41％的年復合成長率擴大；雖然抗生素的抗藥性問題引起了國際社會的高度關注，部分國家采取了一定的限抗措施，但是由于其特定的功效，全球抗生素市場規(guī)模仍將延續(xù)增長的態(tài)勢，根據IMS統(tǒng)計，抗感染藥品2014年將全球市場規(guī)模403億美元(約2.67千億人民幣)。

抗菌肽，普遍稱為抗微生物多肽(Antimicrobial Peptides,AMPs)，其長度大約是由10～80個不等的氨基酸所組成，是許多生物體中一種對抗病原的微小物質。它的功能主要就是幫助生物體對抗體內的有害物質，其作用大致有滲透細菌之細胞膜、穿孔、干擾細菌增殖與促進傷口愈合等功能，未來具有取代抗生素的潛力。

然而，現(xiàn)今大部分的研究皆是對單一抗菌肽的抗菌能力進行研究，并通過置換抗菌肽上的氨基酸提高抗菌能力，然而此種方法需耗費大量時間評估置換哪個氨基酸及位置可提高抗菌能力，且多肽抗菌能力是一個復雜的殘基協(xié)同現(xiàn)象，而以往僅能通過疏水力矩、非鍵結作用位能以及接觸表面積預測多肽的抗菌效果，且無法準確地預測多肽的抗菌效果，需進行額外實驗才能證明多肽的抗菌效果。因此，若不通過分子動力學模擬是難以提供一種系統(tǒng)性并快速的評估設計抗菌肽的方法。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種通過“逐步循環(huán)重排”(stepwise circular reshuffling)的方式依序移動已知有抗菌效果之抗菌肽上的氨基酸序列，來設計具有不同抗菌效果、溶血性及抗鹽性之多肽，再通過計算機模擬及自由能計算的平臺來評估這些抗菌肽的抗菌效果及溶血性。

本發(fā)明提供了一個新的分子動力學模擬系統(tǒng)來評估任意一種抗菌肽的抗菌活性及溶血性。此套分子動力學模擬系統(tǒng)，特色在于透過“下沉而上浮”的方式，將抗菌肽快速地拉入仿細菌的仿真生物膜內，并且相較于自然插入大幅縮短所需的平衡時間達10倍左右。根據其模擬軌跡可計算一個新設計出的分配自由能，ΔGp。此分配自由能ΔGp可作為一個更好的物理指標來預測某一種多肽的抗菌活性。

有鑒于此，本發(fā)明提供一種評估抗菌肽抗菌力的系統(tǒng)，其包括：

(a)第一輸入單元，用于多肽的建構；

(b)第二輸入單元，用于磷酸雙脂層的建構；

(c)第一處理單元，其與所述第一輸入單元以及所述第二輸入單元連接，該第一處理單元用于將所述第一輸入單元建構的多肽與第二輸入單元建構的磷酸雙脂層置于水溶液環(huán)境中進行分子動力學模擬；

(d)第二處理單元，其與該第一處理單元相連接，用于計算所述多肽在每格模擬快照(snapshot)中與膜內脂鏈尾有碰觸的重原子數(shù)N_i及與膜內脂鏈尾未碰觸的重原子數(shù)N_O，對模擬平衡后4納秒中所收集的快照做平均，得到<N_i>與<N_O>，進而計算分配自由能ΔGp，其中所述重原子系指氫原子之外的所有原子；

(e)輸出單元，其與該第二處理單元連接，用于將預測信息輸出；

其中，所述第一輸入單元、所述第二輸入單元、所述第一處理單元、所述

第二處理單元及所述輸出單元通過計算機操作。

本發(fā)明又提供一種利用本發(fā)明系統(tǒng)，來評估/預測抗菌肽抗菌力的方法，其包含以下步驟：

I.利用第一輸入單元建構多肽，將該多肽置于水溶液環(huán)境中持續(xù)第一時間，進行模擬平衡；

II.利用第二輸入單元建構磷酸雙脂層，將該磷酸雙脂層置于水溶液環(huán)境中持續(xù)第二時間，進行模擬平衡；

III.利用第一處理單元，將所述第一輸入單元所建構的多肽與第二輸入單元建構的磷酸雙脂層于水溶液環(huán)境中進行分子動力學模擬；

IV.利用第二處理單元，計算該多肽在每格模擬快照(snapshot)中與膜內脂鏈尾有碰觸的重原子數(shù)N_i及與膜內脂鏈尾未碰觸的重原子數(shù)N_O，對模擬平衡后4納秒中所收集的快照做平均，得到<N_i>與<N_O>，進而計算分配自由能ΔGp，其中所述重原子是指氫原子之外的所有原子；

V.利用輸出單元，該輸出單元與該第二處理單元連接，將預測信息輸出；

其中，所述第一輸入單元、所述第二輸入單元、所述第一處理單元、所述第二處理單元及該輸出單元通過計算機操作。

較佳地，該多肽構型為α-螺旋。

較佳地，該第一輸入單元可包含軟件(如PyMol或Discovery Studio Visualizer)創(chuàng)造的模擬多肽，或由實驗結果(如從X-ray crystallography或NMR)得知的多肽。模擬平衡的多肽包含利用模擬軟件(如NAMD、VMD、AMBER、GROMACS)以及常用力場(如CHARMM、AMBER、GROMOS、OPLS)來達到多肽在類生理環(huán)境下的平衡狀態(tài)。

較佳地，所述第二輸入單元系包含以“CHARMM-GUI”服務器及相似軟件來建膜(磷酸雙脂層)。模擬平衡的磷酸雙脂層包含利用模擬軟件(如NAMD、VMD、AMBER、GROMACS)以及常用力場(如CHARMM、AMBER、GROMOS、OPLS)來達到磷酸雙脂層在類生理環(huán)境下的平衡狀態(tài)。

較佳地，所述第一處理單元系包含利用模擬軟件(如NAMD、VMD、AMBER、GROMACS)以及常用力場(如CHARMM、AMBER、GROMOS、OPLS)來達到多肽穩(wěn)定插入磷酸雙脂層的平衡狀態(tài)。

較佳地，所述第二處理單元的輸入元素(多肽與膜內脂鏈尾有碰觸及碰觸之重原子數(shù))是依據第一處理單元所輸出的模擬軌跡得到的。

較佳地，所述磷酸雙脂層是由十六酰油酰磷脂酰膽堿(palmitoyloleoyl Phosphatidylcholine,簡稱POPC)及/或十六酰油酰磷脂酰甘油酰甘油(palmitoyloleoyl-phosphatidyl glycerol,簡稱POPG)構成。

較佳地，所述第一時間為數(shù)百皮秒(ps)。

其中，所述預測信息為所述多肽的抗菌效果。

其中，所述分子動力學模擬為，使所述多肽疏水面朝向預先平衡好的磷酸雙脂層，而親水面(即帶正電端)朝向另一端，然后當兩者的質心投影到與膜垂直的軸上相距為時，再展開“下沉而上浮表面”模擬。

其中，所述“下沉而上浮表面”模擬為所述螺旋構型的多肽被微弱的拉力拖至膜內磷酸雙脂上層磷原子之平均坐標下方的位置并維持數(shù)納秒，接著去除對螺旋構型多肽的限制力，再進行10～35納秒的模擬，使其上浮至膜表面并且平衡。

較佳地，所述計算分配自由能ΔGp＝-k_BTln(<N_i>/<N_o>)或ΔGp＝-k_BT(<lnN_i>/<lnN_o>)(當N_i及N_o均不為零時)，其中k_B為波茲曼常數(shù)、T為溫度、N_i與N_o分別為每格模擬快照(snapshot)中與膜內脂鏈尾有碰觸(視為已插入)和未碰觸(視為未插入)的多肽內重原子之數(shù)量，<>表示4納秒的移動平均。

較佳地，在本發(fā)明抗菌肽中，經計算該ΔGp與其對應的抗菌效果(MIC)彼此間的相關系數(shù)(R)大于0.84(“1”代表完美的相關)。在此系列中，MIC＝13.49*ΔGp-5.79。

附圖說明

附圖1為分子模擬系統(tǒng)的簡單示意圖。

附圖2為分子模擬系統(tǒng)的流程圖。

附圖3為分子模擬結果的示意圖。

附圖4為表示多肽溶血性的效果圖

【實施方式】

利用本發(fā)明系統(tǒng)所設計出的具低溶血性的抗菌肽，該抗菌肽如下列式I所示：

xAP1yBP2zCn(P3vD)；

其中x、y、z、v以及n均為正整數(shù)；

且x＝0～6、y＝0或4、z＝0～6、v＝0～4以及n＝0或1；

其中P1、P2以及P3系指-Trp-Leu-Lys-；

其中A、B以及C系選自由Trp、Leu以及Lys所組成之群組；

其中D系指Lys。

于較佳實施例中，抗菌肽于分子動力學模擬系統(tǒng)的結果如表1所示：

表1本發(fā)明抗菌肽的模擬結果

于較佳實施例中，抗菌肽的抗菌效果如表2所示。

最低抑菌濃度測試

抗菌活性的最低抑菌濃度值被定義為能抑制90％的細菌生長的最低蛋白濃度，而大腸桿菌(ATCC 25922)被選作為此次WLK異構多肽系列(SEQ ID NO:1～13)的最低抑菌濃度測試的代表菌株。蛋白濃度由紫外光/可見光光譜儀(Ultrospec 1100pro from Amersham Biosciences)在波長280nm的吸光值搭配消光系數(shù)計算(Gill S.C.&Von Hippel P.H.,Analytical biochemistry1989,182(2),319-326)得到，然后被配置為以下七個初始濃度：5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078mg/ml。將處于對數(shù)生長中期、濃度為每毫升5×10⁵菌落形成單位(CFU)的細菌培養(yǎng)液與上述濃度的蛋白溶液于96孔盤中均勻混和(每孔中含有1微升的蛋白溶液與99微升的菌液)。在37℃環(huán)境下震蕩培養(yǎng)16小時后，由微量孔盤儀(Thermo Max,Molecular Devices)在波長600nm環(huán)境下的吸光值來偵測該細菌生長抑制情形。最后，最低抑菌濃度值將通過三次上述重復實驗結果來確定。

溶血活性測試

溶血活性是由受測多肽對于人類紅血球的溶血性測定。新鮮的紅血球和PBS緩沖溶液(pH 7.4)均勻混和后在相對離心力(RCF)800g環(huán)境下采用離心10分鐘進行，然后再由PBS緩沖溶液依體積百分比濃度(v/v)稀釋至10％。各個受測多肽預先配置好不同濃度(800、400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56μg/ml)，分別與PBS緩沖溶液依1：1的體積比例混合(100μL：100μL)。而紅血球溶液依體積比例1：1，分別與包含或不包含2％聚乙二醇辛基苯基醚X-100(Triton X-100)(v/v)的PBS緩沖液混合，用來作為正、負控制組樣本。然后所有受測樣品在37℃環(huán)境下靜置1小時。接著將樣品在RCF 800g環(huán)境下再離心10分鐘，取其上清液并測其波長450nm下的吸光值，溶血活性將依照以下公式而測定：

溶血性(％)＝[A_樣本-A_PBS]/[A_TritonX100-A_PBS]

表2本發(fā)明之抗菌肽的溶血性、抗鹽性及抗菌效果

針對原先為螺旋構型的SEQ ID NO:1，經”序列逐步位移置換”過程中新設計的12段異構多肽(SEQ ID NO:2～13)，其抗菌效果、溶血性及其鹽類耐受性如表2所示，進一步運用上述“下沉而上浮”模擬策略與ΔGp計算方式來衡量其抗菌活性，并分析該13段多肽(含原始序列)的分配自由能(ΔGp)與實驗抗菌性(MIC)之間的相關性，得到其相關系數(shù)大于0.8(MIC＝13.50*ΔGp-5.79,R＝0.84)，表2的結果更說明該13段多肽在高鹽濃度中仍然具有抑制效果，且在本發(fā)明提供的這12段異構多肽中有3段的抗菌活性比原先序列更佳，其中SEQ ID NO:12同時表現(xiàn)出對人類紅血球更低的溶血性。本發(fā)明明顯地提供了一個新的平臺，運用已知的抗菌肽來合理地設計更有效的抗菌肽，并且利用計算機模擬來預測新抗菌肽的活性。