一種氨芐西林分子印跡傳感器的制備方法及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明實(shí)施例公開了一種氨芐西林分子印跡傳感器的制備方法及應(yīng)用，其中氨芐西林分子印跡傳感器的制備方法包括：(1)對(duì)惰性電極預(yù)處理；(2)將共聚合單體吡咯、魯米諾及模板分子氨芐西林溶于pH值為4～7的緩沖溶液中，得到聚合液，其中，共聚合單體吡咯與魯米諾的物質(zhì)的量的比為(1～8)：1；吡咯與氨芐西林的物質(zhì)的量的比為1：(1～6)；(3)將預(yù)處理后的惰性電極置于聚合液中采用循環(huán)伏安法進(jìn)行電聚合，在所述惰性電極表面得到結(jié)合有氨芐西林的吡咯?魯米諾共聚物膜；(4)用洗脫劑去除共聚物膜所結(jié)合的氨芐西林，得到氨芐西林分子印跡傳感器。所制備的氨芐西林分子印跡傳感器具有檢測(cè)靈敏度高、發(fā)光效率高等特點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】
一種氨芐西林分子印跡傳感器的制備方法及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及抗生素檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及一種氨芐西林分子印跡傳感器的制備方法 及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 分子印跡聚合物(Molecularly imprinted polymer，簡(jiǎn)稱MIP)是利用分子印跡技 術(shù)制備的具有與模板分子在空間結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點(diǎn)上完全匹配的高分子聚合物。MIP的制備 是通過(guò)以下方法實(shí)現(xiàn)的：首先模板分子與功能單體在反應(yīng)混合溶液中通過(guò)化學(xué)鍵或氫鍵結(jié) 合形成配合物;然后進(jìn)行共聚形成聚合物，使功能單體上的功能基團(tuán)在空間排列和空間定 向上固定下來(lái);再用物理或化學(xué)方法洗去模板分子，得到具有一定大小和形狀的空穴及確 定空間排列的功能基團(tuán)的分子印跡聚合物。常用的制備方法有恒電位法、恒電流法及循環(huán) 伏安法等。
[0003] 近年來(lái)，利用具有特異選擇性、環(huán)境耐受性強(qiáng)、結(jié)構(gòu)可控以及樣品處理簡(jiǎn)單的分子 印跡聚合物作為識(shí)別元件構(gòu)建分子印跡傳感器實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分析物的分析測(cè)定成為一種非常 有發(fā)展前景的檢測(cè)方法。電化學(xué)發(fā)光(ECL)將電化學(xué)技術(shù)的電位可控性與化學(xué)發(fā)光分析的 高靈敏度相結(jié)合，具有檢測(cè)靈敏度高、線性范圍寬、光電信號(hào)同時(shí)采集、儀器構(gòu)造及操作簡(jiǎn) 單、便于檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。利用選擇性良好的MIP與檢測(cè)靈敏度高的ECL檢測(cè)方法結(jié)合構(gòu)建分子 印跡電化學(xué)發(fā)光傳感器，可利用模板分子重結(jié)合前后引起的ECL信號(hào)變化對(duì)模板分子進(jìn)行 定量測(cè)定。根據(jù)模板分子識(shí)別后引起的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)變化的不同趨勢(shì)，又可將分子印跡 電化學(xué)發(fā)光傳感器分為Turn-on型（即信號(hào)增強(qiáng)型)及Turn-off型（即信號(hào)減弱型）Jurn-on 型分子印跡電化學(xué)發(fā)光傳感器具有更高的檢測(cè)靈敏度，但是現(xiàn)已報(bào)道的分子印跡電化學(xué)發(fā) 光傳感器多為Turn-off型。此外，根據(jù)ECL試劑的狀態(tài)又可將ECL傳感器分為液相ECL及固相 ECL傳感器，液相ECL傳感器即直接利用ECL試劑的水溶液進(jìn)行測(cè)定，具有背景干擾難以消除 及試劑消耗量大等缺點(diǎn)。固相ECL將ECL試劑固定在電極表面，具有發(fā)光效率高，背景干擾 小，可重復(fù)使用等特點(diǎn)。
[0004] 現(xiàn)階段，將高靈敏度的ECL檢測(cè)方法與特異性強(qiáng)的MIP結(jié)合構(gòu)建分子印跡電化學(xué)發(fā) 光傳感器的報(bào)道很少，構(gòu)建的分子印跡電化學(xué)發(fā)光傳感器多利用液相ECL進(jìn)行測(cè)定，且多為 Turn-off型。至今為止，僅有一篇文獻(xiàn)報(bào)道利用納米材料將ECL試劑三聯(lián)吡啶釕固定在電極 表面，并以可以增強(qiáng)三聯(lián)吡啶釕ECL響應(yīng)的異煙肼作為模板分子構(gòu)建了 Turn-on型固相分子 印跡電化學(xué)發(fā)光傳感器。但是三聯(lián)吡啶釕的固定過(guò)程及MIP的聚合過(guò)程分兩步進(jìn)行，使傳感 器的構(gòu)建過(guò)程更加繁瑣耗時(shí)。
[0005] 氨芐西林(AM)又名氨芐青霉素，是一種抗感染能力較強(qiáng)的β內(nèi)酰胺類抗生素，具有 廣譜抗菌作用。AM常用于敏感細(xì)菌所致的呼吸道感染、皮膚感染、肺炎、傷寒、支氣管炎和腸 胃炎等疾病的治療，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中有廣泛的應(yīng)用，導(dǎo)致了其在動(dòng)物源食品中的殘留。人們 長(zhǎng)期使用AM或食用含AM殘留的肉、蛋、奶制品會(huì)造成AM在體內(nèi)累積，引起人體內(nèi)微生物的耐 藥性及過(guò)敏反應(yīng)等問(wèn)題，對(duì)人體健康產(chǎn)生了安全隱患。
[0006] 目前國(guó)內(nèi)外常用的檢測(cè)AM的方法主要有高效液相色譜法、熒光法和紫外吸收分光 光度法等。但高效液相色譜法存在著儀器操作耗時(shí)、樣品處理繁瑣等缺點(diǎn)，熒光法具有選擇 性不高的缺點(diǎn)，紫外吸收分光光度法的檢測(cè)靈敏度及選擇性均不夠高。因此進(jìn)一步發(fā)展簡(jiǎn) 便、靈敏、快速的AM檢測(cè)方法具有非常重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明實(shí)施例公開了一種氨芐西林分子印跡傳感器的制備方法及應(yīng)用，用于制備 出能夠簡(jiǎn)便、靈敏、快速的檢測(cè)氨芐西林的氨芐西林分子印跡傳感器。技術(shù)方案如下：
[0008] 本發(fā)明首先提供了一種氨芐西林分子印跡傳感器的制備方法，包括：
[0009] (1)對(duì)惰性電極預(yù)處理；
[0010] (2)將共聚合單體啦咯、魯米諾及模板分子氨芐西林溶于pH值為4~7的緩沖溶液 中，得到聚合液，其中，共聚合單體吡咯與魯米諾的物質(zhì)的量的比為（1~8): 1;吡咯與氨芐 西林的物質(zhì)的量的比為1: (1~6);
[0011] (3)將預(yù)處理后的惰性電極置于聚合液中采用循環(huán)伏安法進(jìn)行電聚合，在所述惰 性電極表面得到結(jié)合有氨芐西林的吡咯-魯米諾共聚物膜；
[0012] (4)用洗脫劑去除共聚物膜所結(jié)合的氨芐西林，得到氨芐西林分子印跡傳感器。
[0013] 在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，所述惰性電極選自于金電極、鉑電極、玻碳電極或石 墨電極，優(yōu)選為金電極。
[0014] 在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，所述緩沖溶液為磷酸緩沖溶液，pH值為6。
[0015] 在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，所述采用循環(huán)伏安法進(jìn)行電聚合的聚合條件包括： 掃描電位為〇~IV;掃速為30~80mV 中的任一值，循環(huán)掃描圈數(shù)為3~10圈中的任一值。
[0016] 在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，所述洗脫劑為9:l(v/v)的甲醇-乙酸溶液、0.01M的 NaOH溶液或0.01M的HC1溶液。
[0017] 在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，吡咯在緩沖溶液中的濃度為(10~30)mM。
[0018] 本發(fā)明還提供了由前述的方法制備的氨芐西林分子印跡傳感器。
[0019] 本發(fā)明進(jìn)一步還提供了上述的氨芐西林分子印跡傳感器在檢測(cè)氨芐西林分子中 的應(yīng)用。
[0020] 在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，所述檢測(cè)氨芐西林分子的步驟包括：
[0021] (a)配制不同已知濃度的氨芐西林標(biāo)準(zhǔn)品溶液及不含氨芐西林的空白樣品 溶液；
[0022] (b)將氨芐西林分子印跡傳感器分別在所配制的氨芐西林標(biāo)準(zhǔn)品溶液中及空白樣 品溶液中浸泡指定時(shí)間后，分別置于檢測(cè)底液中測(cè)定結(jié)合了不同濃度氨芐西林的氨芐西林 分子印跡傳感器的ECL強(qiáng)度；
[0023] (c)計(jì)算&~Cn濃度氨芐西林標(biāo)準(zhǔn)品溶液對(duì)應(yīng)的氨芐西林分子印跡傳感器的ECUS 度差值A(chǔ)ECLi-AECU，其中，AECLFECLi-ECLQ，！ < i <n，ECL〇為空白樣品溶液對(duì)應(yīng)的氨 節(jié)西林分子印跡傳感器的ECL強(qiáng)度；
[0024] (d)以氨芐西林濃度為橫坐標(biāo)或縱坐標(biāo)，以強(qiáng)度差值Δ ECU為縱坐標(biāo)或橫坐 標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到氨芐西林濃度與強(qiáng)度差值A(chǔ)ECU的線性方程；
[0025] (e)以未知濃度的氨芐西林溶液代替氨芐西林標(biāo)準(zhǔn)品溶液，執(zhí)行步驟(b)及(c);確 定未知濃度的氨芐西林溶液所對(duì)應(yīng)的ECL強(qiáng)度差值;根據(jù)步驟(d)中的線性方程即可得到未 知濃度的氨芐西林溶液中的氨芐西林濃度。
[0026] 在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，步驟(b)中的檢測(cè)底液中含有電活性物質(zhì)1，1'_二茂 鐵雙羧酸。
[0027] 通過(guò)上述技術(shù)方案可知，本發(fā)明以吡咯、魯米諾為共聚單體，在惰性電極的表面聚 合得到對(duì)氨芐西林具有特異選擇性及化學(xué)發(fā)光特性的吡咯-魯米諾共聚物膜，從而獲得氨 節(jié)西林分子印跡傳感器;該傳感器屬于Turn-on型傳感器，具有檢測(cè)靈敏度高的特點(diǎn)；同時(shí) 由于將ECL試劑魯米諾固定于共聚物膜中形成固相ECL傳感器，因而該傳感器又具有發(fā)光效 率高，背景干擾小，可重復(fù)使用等特點(diǎn)。
[0028] 采用本發(fā)明提供的氨芐西林分子印跡傳感器，可以實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)便、靈敏、快速的檢測(cè)氨 芐西林，可以廣泛應(yīng)用于各領(lǐng)域，尤其適用于食品中氨芐西林的檢測(cè)。
【附圖說(shuō)明】
[0029] 為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本 發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以 根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0030] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1步驟(3)中電聚合的循環(huán)伏安曲線，圖中由上至下的曲線1到 5分別為聚合第一圈至第五圈的曲線；
[0031] 圖2為4種物質(zhì)的紅外光譜圖，其中a為AM的紅外光譜圖，b為PPY的紅外光譜圖，c為 PL的紅外光譜圖，d為AM-MIP的紅外光譜圖；
[0032] 圖3為裸金電極、覆蓋有AM-MIP膜的金電極、脫除AM的氨芐西林分子印跡傳感器及 重新結(jié)合有50μΜ AM后的氨芐西林分子印跡傳感器的ECL曲線，其中曲線a為裸金電極的ECL 曲線，曲線b為覆蓋有AM-MIP膜的金電極的ECL曲線，曲線c為脫除AM的氨芐西林分子印跡傳 感器的ECL曲線，曲線d為重新結(jié)合有50μΜ AM后的氨芐西林分子印跡傳感器的ECL曲線； [0033]圖4A為實(shí)施例5中為結(jié)合有不同濃度AM的氨芐西林分子印跡傳感器的ECL曲線，圖 中由下至上的曲線a-h分別為結(jié)合有AM的濃度為0 (即空白樣品溶液）、0.07、0.5、0.7、3、10、 20及50μΜ的氨芐西林分子印跡傳感器的ECL曲線；
[0034]圖4Β為實(shí)施例5建立的氨節(jié)西林分子印跡傳感器的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0035]圖5為洗脫了氨芐西林或結(jié)合0.7μΜ氨芐西林的氨芐西林分子印跡傳感器分別在 不包含F(xiàn)c(C00H)2或包含2mM Fc(C00H)2的pH 8.0磷酸緩沖液中的ECL曲線，其中，曲線a為洗 脫了氨芐西林的氨芐西林分子印跡傳感器在不包含F(xiàn)c(C00H)2的pH 8.0磷酸緩沖液中的 ECL曲線；曲線b為洗脫了氨芐西林的氨芐西林分子印跡傳感器在包含2mM Fc(⑶0H)2的pH 8.0磷酸緩沖液中的ECL曲線；曲線c為結(jié)合0.7μΜ氨芐西林的氨芐西林分子印跡傳感器在不 包含F(xiàn)c(C00H) 2的pH 8.0磷酸緩沖液中的ECL曲線；曲線d為結(jié)合0.7μΜ氨芐西林的氨芐西林 分子印跡傳感器在包含2mM Fc(C00H)2的pH 8.0磷酸緩沖液中的ECL曲線；
[0036]圖6為實(shí)施例7中結(jié)合有不同濃度AM的氨芐西林分子印跡傳感器的ECL曲線，圖中 由下至上的曲線a-f分別為結(jié)合有AM的濃度為0(即空白樣品溶液）、0.7、9、20、500&700nM 的氨芐西林分子印跡傳感器的ECL曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0037]本發(fā)明首先提供了一種氨芐西林分子印跡傳感器的制備方法，包括：
[0038] (1)對(duì)惰性電極預(yù)處理；
[0039] (2)將共聚合單體吡咯、魯米諾及模板分子氨芐西林溶于pH值為4~7的緩沖溶液 中，得到聚合液，其中，共聚合單體吡咯與魯米諾的物質(zhì)的量的比為（1~8): 1;吡咯與氨芐 西林的物質(zhì)的量的比為1: (1~6);
[0040] (3)將預(yù)處理后的惰性電極置于聚合液中采用循環(huán)伏安法進(jìn)行電聚合，在所述惰 性電極表面得到結(jié)合有氨芐西林的吡咯-魯米諾共聚物膜；
[0041] (4)用洗脫劑去除共聚物膜所結(jié)合的氨芐西林，得到氨芐西林分子印跡傳感器。 [0042]在現(xiàn)有技術(shù)中，一般在制備分子印跡傳感器時(shí)均需要先對(duì)惰性電極進(jìn)行預(yù)處理， 以便得到更光滑潔凈的電極表面。
[0043] 在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，步驟(1)可以采用如下方案實(shí)現(xiàn):先將惰性電極用不 同粒度的拋光粉進(jìn)行拋光處理，然后再用乙醇和蒸餾水進(jìn)行清洗。優(yōu)選地，可以先后采用 1.0、0.5、0.05μπι的氧化鋁粉對(duì)惰性電極進(jìn)行拋光處理，然后分別用乙醇和蒸餾水超聲振蕩 5分鐘，最后用蒸餾水沖洗后干燥。
[0044] 在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，惰性電極選自于金電極、鉑電極、玻碳電極或石墨電 極中的一種，優(yōu)選為金電極。
[0045] 在步驟（2)中，用于聚合的單體魯米諾，也稱為3-氨基苯二甲酰肼，英文名稱為 luminolo
[0046] 在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，步驟(2)中的緩沖溶液為0.1M磷酸緩沖液(pH 6.0)。
[0047] 在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，共聚合單體吡咯與魯米諾的物質(zhì)的量的比為（2~ 6): 1;吡咯與氨芐西林的物質(zhì)的量的比為1: (2~4)，吡咯在緩沖溶液中的濃度為（10~30) mM〇
[0048] 在步驟(2)獲得聚合液后，即可進(jìn)行步驟(3)，本發(fā)明采用循環(huán)伏安法進(jìn)行電聚合； 在現(xiàn)有技術(shù)中，循環(huán)伏安法是一種常用的電聚合方法，其操作方法、及所用的聚合裝置，例 如所構(gòu)建的三電極體系(例如以Ag/AgCl電極作為參比電極，以鉑電極作為對(duì)電極，以本發(fā) 明所用的惰性電極作為工作電極）、及用于聚合的電解池、電化學(xué)工作站等均為現(xiàn)有技術(shù)， 本發(fā)明在此不進(jìn)行限定，電聚合的聚合條件可以包括:掃描電位為〇~IV，掃速為30~80mV f 1中的任一值，循環(huán)掃描圈數(shù)為3~1 〇圈中的任一值。
[0049] 在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，步驟(4)具體可以采用下述方案實(shí)施：
[0050] 將步驟(3)中聚合后的惰性電極置于預(yù)先配制的洗脫劑中，攪拌10-30分鐘后，便 可以將模板分子氨芐西林從步驟(3)中獲得的吡咯-魯米諾共聚物膜中脫除，然后用水沖洗 后，室溫晾干即可。其中，所用的洗脫劑可以為9: l(v/v)的甲醇-乙酸溶液（即甲醇、乙酸體 積比為9:1)、0.01M的NaOH溶液或0.01M的HC1溶液。
[0051] 在經(jīng)過(guò)步驟(4)將模板分子洗脫后，即可得到對(duì)氨芐西林具有特異選擇性并具有 化學(xué)發(fā)光特性的氨芐西林分子印跡傳感器。
[0052] 應(yīng)用本發(fā)明所制備的氨芐西林分子印跡傳感器，可以簡(jiǎn)便、靈敏、快速的檢測(cè)氨芐 西林分子。
[0053]在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，檢測(cè)氨芐西林分子的步驟包括：
[0054] (a)配制不同已知濃度的氨芐西林標(biāo)準(zhǔn)品溶液及不含氨芐西林的空白樣品 溶液;配制溶液的方法均可以采用本領(lǐng)域常用的方法，本發(fā)明在此不進(jìn)行限定。
[0055] (b)將氨芐西林分子印跡傳感器分別在所配制的氨芐西林標(biāo)準(zhǔn)品溶液中及空白樣 品溶液中浸泡指定時(shí)間后，分別測(cè)定結(jié)合了不同濃度氨芐西林的氨芐西林分子印跡傳感器 的ECL強(qiáng)度；
[0056] 在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，步驟(b)中的浸泡時(shí)間可以在10-30分鐘內(nèi)；
[0057] 在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，步驟(b)測(cè)定結(jié)合了不同濃度氨芐西林的氨芐西林 分子印跡傳感器的ECL強(qiáng)度，可以采用如下方案實(shí)施：
[0058]將浸泡過(guò)氨芐西林標(biāo)準(zhǔn)品溶液及空白樣品溶液的氨芐西林分子印跡傳感器作為 工作電極，分別與參比電極、對(duì)電極組成三電極體系，將三電極體系置于檢測(cè)底液中，采用 電化學(xué)工作站及電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)不同濃度氨芐西林標(biāo)準(zhǔn)品溶液及空白樣品溶液對(duì) 應(yīng)的氨芐西林分子印跡傳感器的ECL強(qiáng)度，所獲得檢測(cè)結(jié)果通過(guò)安裝有電化學(xué)分析儀工作 軟件的計(jì)算機(jī)輸出；需要說(shuō)明的是，在【具體實(shí)施方式】中，每檢測(cè)完一個(gè)濃度的氨芐西林溶液 后，需要對(duì)氨芐西林分子印跡傳感器中所結(jié)合的氨芐西林進(jìn)行脫除處理，可以采用制備方 法中的步驟(4)的方案來(lái)實(shí)現(xiàn)，本發(fā)明在此不在進(jìn)行贅述。在脫除了氨芐西林后，再將氨芐 西林分子印跡傳感器浸泡于其它濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液中，然后再進(jìn)行檢測(cè)。
[0059] (c)計(jì)算&~Cn濃度氨芐西林標(biāo)準(zhǔn)品溶液對(duì)應(yīng)的氨芐西林分子印跡傳感器的ECUS 度差值A(chǔ)ECLi-AECU，其中，AECLFECLi-ECLQ，！ < i <n，ECL〇為空白樣品溶液對(duì)應(yīng)的氨 節(jié)西林分子印跡傳感器的ECL強(qiáng)度；
[0060] (d)以氨芐西林濃度為橫坐標(biāo)或縱坐標(biāo)，以強(qiáng)度差值Δ ECU為縱坐標(biāo)或橫坐 標(biāo)建立檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到氨芐西林濃度與強(qiáng)度差值A(chǔ)ECU的線性方程；
[0061] (e)以未知濃度的氨芐西林溶液代替步驟(a)中的氨芐西林標(biāo)準(zhǔn)品溶液，執(zhí)行步驟 (b)及(c);確定未知濃度的氨芐西林溶液所對(duì)應(yīng)的ECL強(qiáng)度差值;根據(jù)步驟(d)中的線性方 程即可得到未知濃度的氨芐西林溶液中的氨芐西林濃度。
[0062] 另外，發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在檢測(cè)氨芐西林的過(guò)程中，在檢測(cè)底液中加入電活性物 質(zhì)1，Γ-二茂鐵雙羧酸，可以顯著增強(qiáng)本發(fā)明提供的氨芐西林分子印跡傳感器的ECL強(qiáng)度。 在本發(fā)明的一種【具體實(shí)施方式】中，1，Γ -二茂鐵雙羧酸在檢測(cè)底液中的濃度為1~4mM。
[0063] 在本發(fā)明，所說(shuō)的1，Γ-二茂鐵雙羧酸，其結(jié)構(gòu)式如下：
[0065] 在本發(fā)明中，所提及的濃度單位Μ表示mol/L;
[0066] 在本發(fā)明中，所說(shuō)的"氨節(jié)西林分子印跡傳感器"及"脫除了氨節(jié)西林的氨節(jié)西林 分子印跡傳感器"具有相同的含義，均是指沒(méi)有結(jié)合氨芐西林的分子印跡傳感器。
[0067] 下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完 整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；?本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他 實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0068] 在下述各實(shí)施例及全文中，AM代表氨芐西林;PY代表吡咯；luminol代表魯米諾。 [0069]儀器和材料
[0070] 電化學(xué)工作站CHI 660A CH Instruments，上海辰華儀器公司；
[0071] 傅里葉變換紅外光譜儀IRAff inity-Ι型，日本島津公司；
[0072]電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀MPI-E型，西安瑞邁分析儀器有限責(zé)任公司；
[0073]所需試劑皆市售可得。
[0074] 實(shí)施例1
[0075]制備氨芐西林分子印跡傳感器
[0076] 步驟（1)先后采用1.0,0.5和0.05以!11的氧化鋁粉對(duì)金電極進(jìn)行拋光處理，將處理后 的金電極分別用乙醇和蒸餾水超聲振蕩5分鐘，最后用蒸餾水沖洗后干燥；
[0077]步驟（2)將吡咯、魯米諾及氨芐西林溶于0.1M磷酸緩沖液(pH 6.0)中，得到含有 20mM吡略，5mM魯米諾及60mM氨芐西林的聚合液；
[0078]步驟(3)以Ag/AgCl電極作為參比電極，鉑電極作為對(duì)電極，金電極作為工作電極， 使用CHI 660A型電化學(xué)工作站（CH Instruments，上海辰華儀器公司）進(jìn)行循環(huán)伏安法掃 描，電壓范圍為0~IV，掃速為50mV ?Γ1，掃描圈數(shù)為5圈，在金電極表面獲得了結(jié)合有氨芐西 林的吡咯-魯米諾共聚物膜，簡(jiǎn)稱為ΑΜ-ΜΙΡ膜，并在室溫下干燥處理，電聚合過(guò)程中的循環(huán) 伏安曲線圖如圖1所示；
[0079] 從圖1中可以看出，電聚合第一圈時(shí)，在0.55及0.9V左右分別得到魯米諾單體及吡 咯單體的氧化峰。隨著聚合圈數(shù)逐漸增加，魯米諾單體及吡咯單體的氧化峰電流逐漸降低。 結(jié)果說(shuō)明：結(jié)合有模板分子的ΑΜ-ΜΙΡ膜已成功聚合在金電極表面，并且阻礙了luminol單體 及PY單體進(jìn)一步到達(dá)電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)。
[0080] 為進(jìn)一步證明步驟(3)聚合得到了 ΑΜ-ΜΙΡ膜，利用傅里葉變換紅外光譜法對(duì)AM，聚 吡咯（簡(jiǎn)稱PPY)，聚luminol (簡(jiǎn)稱PL，通過(guò)電化學(xué)聚合方法在含有5mM luminol的0 · 1M pH 6.0磷酸緩沖液中進(jìn)行CV掃描5圈制備而成，掃描電位0~IV，掃速50mV ?Γ1)及ΑΜ-ΜΙΡ膜進(jìn)行 了表征，如圖2所示。在ΑΜ-ΜΙΡ薄膜的紅外譜圖中可以發(fā)現(xiàn)AM在1773cm- 1處的羧基伸縮振動(dòng) 峰(V-CQQH)及1384~1398(^1附近的甲基C-H彎曲振動(dòng)雙峰(〇 c-η)，說(shuō)明在電聚合過(guò)程中模板 分子AM已被成功結(jié)合在ΑΜ-ΜΙΡ薄膜中。在ΑΜ-ΜΙΡ薄膜的紅外譜圖中可以發(fā)現(xiàn)PPY在1529CHT 1 處的C-N不對(duì)稱環(huán)拉伸振動(dòng)(vasC-N)特征峰，說(shuō)明電聚合過(guò)程中，ΑΜ-ΜΙΡ薄膜中形成了聚吡咯 結(jié)構(gòu)。此外，無(wú)法用FTIR證實(shí)在ΜΙΡ薄膜中成功合成PL。但后續(xù)的ECL(電化學(xué)發(fā)光)實(shí)驗(yàn)可進(jìn) 一步證實(shí)PL也成功聚合到ΜΙΡ薄膜中。
[0081] 步驟（4)，將步驟（3)中聚合后的金電極置于20mL預(yù)先配制的甲醇-乙酸溶液（甲 醇、乙酸體積比為9:1)中，磁力攪拌20分鐘后，將AM脫除，然后用水沖洗后，室溫晾干即可。 [0082] 實(shí)施例2
[0083]制備氨芐西林分子印跡傳感器
[0084] 實(shí)施例2與實(shí)施例1相比，步驟（1)和(4)完全相同；步驟(2)、步驟(3)與實(shí)施例1的 區(qū)別在于：
[0085]步驟(2)，將吡咯、魯米諾及模板分子氨芐西林溶于0.1M磷酸緩沖液(pH 6.0)中， 得到含有30mM吡咯，4mM魯米諾及30mM氨芐西林的聚合液；
[0086] 步驟(3)，電壓范圍為0~IV，掃速為80mV S4,掃描圈數(shù)為3圈。
[0087] 實(shí)施例3
[0088]制備氨芐西林分子印跡傳感器
[0089] 實(shí)施例3與實(shí)施例1相比，步驟（1)和(4)完全相同；步驟(2)、步驟(3)與實(shí)施例1的 區(qū)別在于：
[0090] 步驟(2)，將吡咯、魯米諾及模板分子氨芐西林溶于0.1M磷酸緩沖液(pH 6.0)中， 得到含有10mM吡咯，10mM魯米諾及80mM氨芐西林的聚合液；
[0091] 步驟(3)，電壓范圍為0~IV，掃速為30mV s4,掃描圈數(shù)為10圈。
[0092] 實(shí)施例4
[0093] 檢測(cè)實(shí)施例1制備的氨芐西林分子印跡傳感器對(duì)AM的特異性識(shí)別作用
[0094] 將實(shí)施例1制備過(guò)程中，步驟（1)中電聚合前的金電極(簡(jiǎn)稱為裸金電極）、步驟(3) 中制得的覆蓋有AM-MIP膜的金電極、步驟(4)中脫除AM的氨芐西林分子印跡傳感器以及重 新結(jié)合有50μΜ AM后的氨節(jié)西林分子印跡傳感器分別作為工作電極，并以Ag/AgCl為參比電 極，Pt為對(duì)電極，組成三電極體系，進(jìn)行ECL檢測(cè)，以pH 8.0的磷酸緩沖液作為檢測(cè)底液，所 獲得檢測(cè)結(jié)果通過(guò)安裝有電化學(xué)分析儀工作軟件的計(jì)算機(jī)輸出，結(jié)果如圖3所示；
[0095] 從圖3中可以看出，與裸金電極相比（圖3中曲線a)，在金電極表面電聚合AM-MIP膜 后，電極的ECL強(qiáng)度明顯增強(qiáng)（圖3中曲線b)。這是因?yàn)檫量?魯米諾共聚物膜中的聚吡咯結(jié) 構(gòu)促進(jìn)了膜中聚魯米諾結(jié)構(gòu)的電子傳遞。同時(shí)，電聚合得到AM-MIP膜后，膜中的模板分子AM 可以與檢測(cè)底液中的溶解氧作用產(chǎn)生超氧陰離子自由基。超氧陰離子自由基與膜中的聚魯 米諾結(jié)構(gòu)的氧化中間態(tài)反應(yīng)生成大量激發(fā)態(tài)中間體，從而增強(qiáng)了 ECL強(qiáng)度。當(dāng)模板分子AM被 洗脫掉后，脫除AM的氨芐西林分子印跡傳感器的ECL強(qiáng)度明顯降低（圖3中曲線c)。重新結(jié)合 有50μΜ AM后的氨芐西林分子印跡傳感器的ECL強(qiáng)度又明顯增強(qiáng)（圖3中曲線d)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié) 果不僅表明步驟(4)中脫除AM的氨芐西林分子印跡傳感器對(duì)模板分子AM具有識(shí)別作用，而 且AM-MIP膜中所結(jié)合的AM能夠增強(qiáng)聚魯米諾結(jié)構(gòu)的ECL強(qiáng)度，因此本發(fā)明提供的氨芐西林 分子印跡傳感器為Turn-on型固相分子印跡電化學(xué)傳感器，并可以利用重結(jié)合AM后的氨芐 西林分子印跡傳感器的ECL強(qiáng)度增強(qiáng)值對(duì)被測(cè)溶液中的AM含量進(jìn)行定量測(cè)定。
[0096] 實(shí)施例5
[0097] 應(yīng)用實(shí)施例1制備的氨芐西林分子印跡傳感器檢測(cè)未知濃度的氨芐西林溶液中的 氨芐西林含量，步驟如下：
[0098] (a)以蒸餾水為溶劑分別配制氨芐西林濃度為0.07、0.5、0.7、3、10、20、50μΜ的氨 芐西林標(biāo)準(zhǔn)品溶液;并配制不含氨芐西林的空白樣品溶液；
[0099] (b)將經(jīng)過(guò)洗脫氨芐西林的氨芐西林分子印跡傳感器分別在所配制的氨芐西林標(biāo) 準(zhǔn)品溶液中及空白樣品溶液中浸泡15分鐘，然后置于檢測(cè)底液(pH 8.0的磷酸緩沖溶液）中 進(jìn)行ECL測(cè)定;獲得結(jié)合了各濃度氨芐西林的氨芐西林分子印跡傳感器的ECL曲線，如圖4A 所示；圖4A中各曲線的最高點(diǎn)為重結(jié)合各濃度氨芐西林的氨芐西林分子印跡傳感器的ECL 強(qiáng)度，重結(jié)合0、0.07、0.5、0.7、3、10、20、50μM的氨芐西林的ECL強(qiáng)度分別為106(即空白樣品 溶液對(duì)應(yīng)的ECL強(qiáng)度為106)、131、146、159、201、269、360、651;其中，以浸泡過(guò)氨芐西林標(biāo)準(zhǔn) 品溶液或空白樣品溶液的氨芐西林分子印跡傳感器作為工作電極，以Ag/AgCl為參比電極， Pt為對(duì)電極，組成三電極體系；
[0100] (C)根據(jù)公式 AECLi = ECLi-ECL〇，l < i <n,計(jì)算0.07、0.5、0.7、3、10、20、5(^]\1的氨 芐西林標(biāo)準(zhǔn)品溶液的ECL強(qiáng)度差值Δ ECL，分別為25、40、53、95、163、254、545;
[0101] (d)以所獲得的各濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液的ECL強(qiáng)度差值Δ ECL為縱坐標(biāo)，以氨芐西林標(biāo) 準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)建立氨芐西林分子印跡傳感器的檢測(cè)線性方程；A ECL = 46.23+ 10.1以以]\〇& = 0.995)(該方程對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖48所示），線性范圍為0.07~5(^]\1，檢測(cè) 靈敏度為336.67μΜ-Vm- 2，最低檢測(cè)限(L0D)為18nM。
[0102] (e)配制某一未知濃度氨芐西林溶液，將實(shí)施例1制得的氯霉素分子印跡電化學(xué)發(fā) 光傳感器浸泡在此氨芐西林溶液，浸泡時(shí)間為15分鐘。執(zhí)行步驟(b)及(c)，得到未知濃度氨 芐西林對(duì)應(yīng)的強(qiáng)度差值126,根據(jù)步驟(d)中的線性方程即可得到得出氨芐西林溶液的物質(zhì) 的量濃度為7.9μΜ。
[0103] 實(shí)施例6
[0104] 確定1，Γ-二茂鐵雙羧酸對(duì)氨芐西林檢測(cè)的放大作用
[0105] 將洗脫了氨芐西林的氨芐西林分子印跡傳感器分別在不包含F(xiàn)c(C00H)2的pH 8.0 磷酸緩沖液中以及在包含2mM Fc (C00H)2的pH 8.0磷酸緩沖液中進(jìn)行ECL檢測(cè)，將重新結(jié)合 有0.7μΜ氨芐西林的氨芐西林分子印跡傳感器分別在不包含F(xiàn)c(C00H) 2的pH 8.0磷酸緩沖 液中以及在包含2mM Fc(C00H)2的pH 8.0磷酸緩沖液中進(jìn)行ECL檢測(cè);檢測(cè)結(jié)果如圖5所示；
[0106] 從圖5中可以看出，在檢測(cè)底液(pH 8.0磷酸緩沖液）中加入2mM Fc(⑶0H)2后，洗 脫后的氨芐西林分子印跡傳感器的ECL強(qiáng)度增強(qiáng)了近3倍，這是因?yàn)镕c(C00H) 2的電化學(xué)氧 化產(chǎn)物可以催化聚魯米諾結(jié)構(gòu)在金電極表面的電化學(xué)氧化過(guò)程，從而增加聚魯米諾結(jié)構(gòu)氧 化中間體的含量，有效增強(qiáng)其ECL響應(yīng)。Fc(C00H) 2對(duì)聚魯米諾結(jié)構(gòu)的ECL信號(hào)放大作用可用 于提高該傳感器對(duì)AM的檢測(cè)靈敏度。例如，將重結(jié)合0.7μΜ AM后的氨芐西林分子印跡傳感 器置于含有2mM Fc(⑶0H)2的pH 8.0磷酸緩沖液中進(jìn)行ECL測(cè)定（圖3中曲線d)，得到的ECL 強(qiáng)度是沒(méi)有加Fc(C00H)2的ECL強(qiáng)度（圖3中曲線c)測(cè)定結(jié)果的近3倍。由此可知，利用Fc (C00H) 2對(duì)聚魯米諾結(jié)構(gòu)的電催化作用可以成倍放大AM重結(jié)合前后氨芐西林分子印跡傳感 器的ECL強(qiáng)度變化，有望提高傳感器的檢測(cè)靈敏度。
[0107] 實(shí)施例7
[0108] 確定檢測(cè)底液中含有Fc (C00H) 2作為電活性探針的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0109] 采用與實(shí)施5相同的步驟確定氨芐西林分子印跡傳感器的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，與實(shí)施5 的區(qū)別在于，本實(shí)施例配制的氨芐西林標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度分別為0.7、9、20、500及700nM;并且 檢測(cè)底液為包含2mM Fc(⑶0H)2的pH 8.0磷酸緩沖液;所獲得的結(jié)合了不同濃度氨芐西林 的氨芐西林分子印跡傳感器的ECL強(qiáng)度曲線圖6所示；以氨芐西林標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo) 建立氨芐西林分子印跡傳感器的的檢測(cè)線性方程；Δ ECL = 30.93+0.31C(nM) (r = 0.996)， 線性范圍為0.7~700nM，檢測(cè)靈敏度為10.33mM-Vm-2，L0D為0.58nM?？梢?jiàn)，在Fc(C00H) 2的電 催化放大作用下，該傳感器的檢測(cè)靈敏度放大為無(wú)Fc(C00H)2時(shí)(實(shí)施例5)的31倍，L0D比無(wú) Fc (C00H) 2時(shí)(實(shí)施例5)的L0D低了兩個(gè)數(shù)量級(jí)。
[0110] 以上對(duì)本發(fā)明所提供的種氨芐西林分子印跡傳感器的制備方法及應(yīng)用進(jìn)行了詳 細(xì)介紹。本文中應(yīng)用了具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的原理及實(shí)施方式進(jìn)行了闡述，以上實(shí)施例的 說(shuō)明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其中心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和 修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種氨芐西林分子印跡傳感器的制備方法，其特征在于，包括： (1) 對(duì)惰性電極預(yù)處理； (2) 將共聚合單體吡咯、魯米諾及模板分子氨芐西林溶于pH值為4~7的緩沖溶液中，得 到聚合液，其中，共聚合單體吡咯與魯米諾的物質(zhì)的量的比為（1~8): 1;吡咯與氨芐西林的 物質(zhì)的量的比為1:(1~6); (3) 將預(yù)處理后的惰性電極置于聚合液中采用循環(huán)伏安法進(jìn)行電聚合，在所述惰性電 極表面得到結(jié)合有氨芐西林的吡咯-魯米諾共聚物膜； (4) 用洗脫劑去除共聚物膜所結(jié)合的氨芐西林，得到氨芐西林分子印跡傳感器。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述惰性電極選自于金電極、鉑電極、玻碳電 極或石墨電極，優(yōu)選為金電極。3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述緩沖溶液為磷酸緩沖溶液，pH值為6。4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述采用循環(huán)伏安法進(jìn)行電聚合的聚合條件 包括:掃描電位為〇~IV;掃速為30~80mV 中的任一值，循環(huán)掃描圈數(shù)為3~10圈中的任 一值。5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗脫劑為9: l(v/v)的甲醇-乙酸溶液、 0.01M的NaOH溶液或0.01M的HC1溶液。6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，吡咯在緩沖溶液中的濃度為（10~30 )mM。7. 由權(quán)利要求1~6中任一項(xiàng)所述的方法制備的氨節(jié)西林分子印跡傳感器。8. 權(quán)利要求7所述的氨節(jié)西林分子印跡傳感器在檢測(cè)氨節(jié)西林分子中的應(yīng)用。9. 如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述檢測(cè)氨芐西林分子的步驟包括： (a) 配制不同已知濃度(^~(^的氨芐西林標(biāo)準(zhǔn)品溶液及不含氨芐西林的空白樣品溶液； (b) 將氨芐西林分子印跡傳感器分別在所配制的氨芐西林標(biāo)準(zhǔn)品溶液中及空白樣品溶 液中浸泡指定時(shí)間后，分別置于檢測(cè)底液中測(cè)定結(jié)合了不同濃度氨芐西林的氨芐西林分子 印跡傳感器的ECL強(qiáng)度； (c) 計(jì)算&~(：η濃度氨芐西林標(biāo)準(zhǔn)品溶液對(duì)應(yīng)的氨芐西林分子印跡傳感器的ECL強(qiáng)度差 值A(chǔ)ECLi-AECU，其中，AECLFECLi-ECLhl < i <n，ECL〇為空白樣品溶液對(duì)應(yīng)的氨芐西 林分子印跡傳感器的ECL強(qiáng)度； (d) 以氨芐西林濃度^~匕為橫坐標(biāo)或縱坐標(biāo)，以強(qiáng)度差值Δ ECLi為縱坐標(biāo)或橫坐標(biāo)建 立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到氨芐西林濃度與強(qiáng)度差值A(chǔ)ECU的線性方程； (e) 以未知濃度的氨芐西林溶液代替氨芐西林標(biāo)準(zhǔn)品溶液，執(zhí)行步驟(b)及(c);確定未 知濃度的氨芐西林溶液所對(duì)應(yīng)的ECL強(qiáng)度差值;根據(jù)步驟(d)中的線性方程即可得到未知濃 度的氨芐西林溶液中的氨芐西林濃度。10. 如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟(b)中的檢測(cè)底液中含有電活性物質(zhì)1， Γ-二茂鐵雙羧酸。
【文檔編號(hào)】G01N33/15GK105866211SQ201610371665
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年5月30日
【發(fā)明人】劉紅云, 廉文靜
【申請(qǐng)人】北京師范大學(xué), 北京師大科技園科技發(fā)展有限責(zé)任公司