一種原位實時檢測活細胞中過氧化氫濃度的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測活細胞中過氧化氫濃度的方法，所述方法為利用電化學測試得到活細胞受藥物刺激后的電流?時間曲線，同時進行電子順磁共振波譜測試，得到電化學池中活細胞在紫外光照射后的ESR譜圖，建立ESR信號強度?電流關(guān)系曲線；同樣對過氧化氫標準溶液進行電子順磁共振波譜測試，得到過氧化氫標準溶液在紫外光照射后的ESR譜圖，建立ESR信號強度?過氧化氫濃度標準曲線，綜合上述建立的三種曲線得到任意時間下的活細胞受刺激后所釋放出的過氧化氫的濃度，完成活細胞中過氧化氫濃度的實時檢測。本發(fā)明使得活細胞釋放的過氧化氫濃度的定量檢測更加準確，能實現(xiàn)原位實時監(jiān)測活細胞所釋放過氧化氫的濃度，具有廣泛的應(yīng)用前景。
【專利說明】
一種原位實時檢測活細胞中過氧化氫濃度的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于檢測分析技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種檢測活細胞中過氧化氫濃度的方法，尤其涉及一種原位實時檢測活細胞中過氧化氫濃度的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]活性氧不僅包括一些氧自由基，如超氧陰離子，羥基自由基等，還包括具有較高活性的一些分子如過氧化氫和單線態(tài)氧。與其他活性氧相比，過氧化氫性質(zhì)相對穩(wěn)定、容易在細胞與細胞周圍環(huán)境之間擴散。一方面，人體內(nèi)自發(fā)產(chǎn)生的適量的過氧化氫是相當重要的，在信號傳導、神經(jīng)傳遞、血小板凝集、免疫系統(tǒng)控制、學習和記憶、細胞常規(guī)生長、重要的生命化合物的合成和機體的新陳代謝中，都發(fā)揮了重要的作用。然而，當過氧化氫產(chǎn)生過量，或是機體自身的抗氧化劑的量大量減少時，過氧化氫就變得相當有害了。它們通過氧化一些功能性生物分子，使得細胞脂質(zhì)膜，蛋白質(zhì)組織、酶、碳水化合物和DNA等發(fā)生氧化損傷，造成細胞損壞或死亡，與癌癥、炎癥以及一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)。總之，在正常生理環(huán)境中，一定量的過氧化氫對于生命體是必不可少的，但過量的活性氧就會造成危害。因此，原位實時準確監(jiān)測細胞產(chǎn)生過氧化氫的濃度對細胞信號傳導研究、疾病診斷具有重要意義。
[0003]目前，大多數(shù)的過氧化氫檢測方法，如色譜法、滴定法、紫外-可見光譜法、熒光法等，總的來說都比較耗時，易受干擾物影響，且難以原位實時檢測。電化學方法，特別是基于納米材料和酶修飾電極的電流型傳感器由于實驗過程簡單、靈敏度高、選擇性高而受到廣泛關(guān)注。在通過電化學的方法對細胞外產(chǎn)生的過氧化氫做定量檢測的工作中，目前主要是先用修飾電極構(gòu)建安培電流與過氧化氫的濃度的標準曲線，然后通過實際細胞體系產(chǎn)生的安培電流曲線在標準曲線上讀取或者計算出細胞產(chǎn)生的過氧化氫的濃度。這種方法經(jīng)常被用作定量分析的手段，但是在活細胞體系中，這種制作標準曲線的方法存在一定缺陷。一方面，如果在將細胞接種到工作電極表面之后構(gòu)建標準曲線，加入的標準溶液中的部分過氧化氫會擴散到細胞內(nèi)部并被細胞內(nèi)的酶等代謝分解掉，這樣實際體系中測試得到的過氧化氫濃度往往是偏高的。另一方面，如果在將細胞接種到工作電極表面之前構(gòu)建標準曲線，也就是說構(gòu)建標準曲線時電極表面是不含有細胞的，這在電極活性面積、導電性方面與實際檢測體系中所用的生長有貼壁細胞的工作電極不一致，因此所測試得到的過氧化氫濃度也是不準確的。
[0004]因此，在本領(lǐng)域需要開發(fā)一種能夠原位實時檢測活細胞中過氧化氫濃度的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測活細胞中過氧化氫濃度的方法，尤其是提供一種原位實時檢測活細胞中過氧化氫濃度的方法。
[0006]為達到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0007]—方面，本發(fā)明提供一種檢測活細胞中過氧化氫濃度的方法，所述方法為利用電化學測試得到活細胞受藥物刺激后的電流-時間曲線，與此同時進行電子順磁共振波譜測試，得到電化學池中活細胞在紫外光照射后的ESR譜圖，建立ESR信號強度-電流關(guān)系曲線；同樣對過氧化氫標準溶液進行電子順磁共振波譜測試，得到過氧化氫標準溶液在紫外光照射后的ESR譜圖，建立ESR信號強度-過氧化氫濃度標準曲線，綜合上述建立的三種曲線得到任意時間下的活細胞受刺激后所釋放出的過氧化氫的濃度，完成活細胞中過氧化氫濃度的實時檢測。
[0008]本發(fā)明所述方法將電子順磁共振波譜技術(shù)與電化學分析相結(jié)合來實現(xiàn)活細胞中過氧化氫濃度的原位實時檢測，使得定量檢測更加準確，解決了現(xiàn)有技術(shù)無法實現(xiàn)活細胞中過氧化氫濃度的原位實時檢測的問題。
[0009]在本發(fā)明中，所述檢測活細胞中過氧化氫濃度的方法包括以下步驟:
[0010](I)將三電極工作體系插入到電解液中形成三電極電化學測試系統(tǒng)，所述三電極工作體系的工作電極上接種有活細胞，以開始加入藥物刺激活細胞產(chǎn)生過氧化氫為起始時間，采用記時安培法得到活細胞受藥物刺激后的電流-時間曲線；
[0011](2)在進行步驟(I)的同時，取電化學池中的活細胞培養(yǎng)液，加入羥基自由基捕獲劑，經(jīng)紫外光照射后，記錄ESR譜圖，利用該步驟得到的ESR譜圖和步驟(I)得到的電流-時間曲線中同一時間點對應(yīng)的ESR信號強度和電流大小建立ESR信號強度-電流關(guān)系曲線；
[0012](3)配制過氧化氫(H2O2)標準溶液，加入羥基自由基捕獲劑，經(jīng)紫外光照射后，記錄ESR譜圖，建立ESR信號強度-過氧化氫濃度標準曲線；
[0013](4)通過步驟(I)得到的時間-電流曲線得到任意時間下的電流值，然后通過步驟
(2)得到的ESR信號強度-電流關(guān)系曲線讀出相應(yīng)的ESR信號強度，最后利用步驟(3)得到的ESR信號強度-過氧化氫濃度標準曲線得到任意時間下活細胞受刺激后所釋放出的過氧化氫的濃度。
[0014]本發(fā)明通過將對過氧化氫有靈敏準確響應(yīng)但原位實時性檢測稍差的電子順磁共振波譜技術(shù)與電化學相結(jié)合，利用電子自旋共振法(ESR)輔助電化學分析法進行標準曲線的構(gòu)建，這個方法不涉及電極和活細胞之間的矛盾，可以實現(xiàn)活細胞外產(chǎn)生的過氧化氫的準確定量檢測，而電化學分析則可對活細胞產(chǎn)生過氧化氫的過程原位實時檢測。本發(fā)明提供的檢測方法，避免了單純使用電化學方法和電子順磁共振檢測的缺陷，使得定量檢測更加準確，尤其適用于對活細胞體系產(chǎn)生過氧化氫濃度的原位實時準確監(jiān)測，在疾病檢測等生物醫(yī)學領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價值。
[0015]優(yōu)選地，步驟(I)所述三電極工作體系是以Ag/AgCl電極作為參比電極，采用鉑片或鉑絲作為對電極，表面修飾并接種有活細胞的氧化銦錫(ITO)電極作為工作電極。
[0016]優(yōu)選地，所述表面修飾的氧化銦錫(ITO)電極從靠近氧化銦錫電極的一側(cè)起表面逐層分別修飾有石墨烯、貴金屬納米顆粒、過氧化氫分解酶和細胞粘附劑。
[0017]優(yōu)選地，所述表面修飾的氧化銦錫(ITO)電極的制備方法如下:
[0018]A、利用氧等離子體對氧化銦錫玻璃進行表面處理；
[0019]B、將氧化石墨烯溶液旋涂到步驟A得到的氧化銦錫玻璃表面，置于肼蒸汽中進行原位還原，得到表面修飾有石墨烯的氧化銦錫玻璃；
[0020]C、將貴金屬納米顆粒溶液加至步驟B得到的氧化銦錫玻璃表面，干燥，而后將其在過氧化氫分解酶溶液中浸潤，得到修飾有貴金屬納米顆粒和酶的氧化銦錫(ITO)電極；
[0021]D、將細胞粘附劑溶液加至步驟C得到的電極表面，干燥得到所述表面修飾的氧化銦錫電極。
[0022]優(yōu)選地，在表面修飾的氧化銦錫(ITO)電極的制備中，在利用氧等離子體對氧化銦錫玻璃進行表面處理前，先將氧化銦錫玻璃分別置于丙酮、乙醇和超純水中依次超聲10-30分鐘，例如10分鐘、13分鐘、15分鐘、18分鐘、20分鐘、23分鐘、25分鐘、28分鐘或30分鐘。
[0023]在本發(fā)明中，利用氧等離子體對氧化銦錫玻璃進行表面處理的目的是增加親水性和鋪展性有利于其后續(xù)修飾。
[0024]優(yōu)選地，步驟13所述氧化石墨稀溶液的濃度為0.01-0.lmg/mL，例如0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.03mg/mL、0.04mg/mL、0.05mg/mL、0.06mg/mL、0.07mg/mL、0.08mg/mL、0.09mg/mL或0.lmg/mL。
[0025]優(yōu)選地，步驟8所述原位還原的溫度為50-70°(:，例如51°(:、52°(:、53°(:、54°(:、561€、58°C、60°C、62°C、64°C、66°C、68°C或70°C。
[0026]優(yōu)選地，步驟B所述原位還原的時間為4-12小時，例如4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時或12小時。
[0027]優(yōu)選地，步驟C所述貴金屬納米顆粒為銀納米顆粒、金納米顆粒或鈾納米顆粒中的任意一種或至少兩種的組合，優(yōu)選金納米顆粒。
[0028]優(yōu)選地，步驟C所述金貴金屬納米顆粒溶液中貴金屬納米顆粒的質(zhì)量百分數(shù)為0.01-0.05%，例如0.01%、0.015%、0.02%、0.025%、0.03%、0.035%、0.04%、0.045%或
0.05%。
[0029 ] 優(yōu)選地，步驟(3所述貴金屬納米顆粒溶液與步驟B所述氧化石墨稀溶液的體積比為1:2-2:1;例如1:2、1:1.8、1:1.5、1:1.3、1:1、1.2:1、1.5:1、1.8:1或2:1。
[0030]優(yōu)選地，步驟C所述過氧化氫分解酶為辣根過氧化物酶。
[0031 ] 優(yōu)選地，步驟C所述過氧化氫分解酶溶液的濃度為l_5mg/mL，例如lmg/mL、1.3mg/mL、I.5mg/mL、I.8mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL、2.8mg/mL、3mg/mL、3.5mg/mL、3.8mg/mL、4mg/mL、4.5mg/mL、4.8mg/mL或 5mg/mL。
[0032]優(yōu)選地，步驟D所述細胞粘附劑為由精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列組成的環(huán)狀短肽(簡稱RGD環(huán)肽)。
[0033]優(yōu)選地，所述細胞粘附劑溶液的濃度為l_5mg/mL，例如lmg/mL、1.3mg/mL、1.5mg/mL、I.8mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL、2.8mg/mL、3mg/mL、3.5mg/mL、3.8mg/mL、4mg/mL、4.5mg/mL、4.8mg/mL或 5mg/mL。
[0034]優(yōu)選地，步驟D所述細胞粘附劑溶液與步驟C所述金納米顆粒溶液的體積比為1:2-2:1，例如1:2、1:1.8、1:1.5、1:1.3、1:1、1.2:1、1.5:1、1.8:1或2:1。
[0035]優(yōu)選地，步驟(I)所述電解液為磷酸鹽緩沖溶液。
[0036]優(yōu)選地，步驟(I)所述藥物為佛波醇12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)。
[0037]優(yōu)選地，步驟(I)所述活細胞為能夠在工作電極上貼壁生長的活細胞，對活細胞種類沒有限制，只要是貼壁生長即可，具體的可以是Hela或其它腫瘤細胞。
[0038]優(yōu)選地，在本發(fā)明的檢測活細胞中過氧化氫濃度的方法中，步驟(2)所述羥基自由基捕獲劑為5，5-二甲基-1-吡咯啉氮氧化物。
[0039]優(yōu)選地，步驟(2)所述加入羥基自由基捕獲劑使其在活細胞培養(yǎng)液中的濃度為20-80mM，例如 20mM、25mM、30mM、3 5mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM 或 80mM，優(yōu)選40-50mM。
[0040]優(yōu)選地，步驟(2)所述紫外光的波長范圍為280-320nm，例如280nm、290nm、300nm、305nm、308nm、31 Onm、315nm、318nm 或 320nm。
[0041]在本發(fā)明中，步驟(3)所述ESR信號強度-過氧化氫濃度標準曲線，是以過氧化氫濃度的對數(shù)值(log值)為橫坐標，以ESR信號強度為縱坐標建立的關(guān)系曲線。
[0042]在本發(fā)明中，步驟(3)所述過氧化氫標準溶液的濃度為10—9-10—3mol/L，例如10一9mol/L、8 X 10—Vol/L、5 X 10—Vol/L、3 X 10—Vol/L、8 X 10—7mol/L、5 X 10—7mol/L、3 X 10—7mol/L、5 X 10—W/L、I X 10—6mol/L、8 X 10—W/L、4 X 10—W/L、I X 10—W/L、8 X 10—4mol/L、5 X 10—4mol/L或I X 10—3mol/L。
[0043]優(yōu)選地，步驟(3)所述配制過氧化氫標準溶液時所選定的過氧化氫的濃度梯度為IX 10—6、5 X 10—6、I X 10—5、2 X 10—5、5 X 10—5mol/L。當然也可以選擇其他濃度梯度的過氧化氫標準溶液，只要該標準溶液中每個樣品的濃度在10—9-10—3mol/L即可。
[0044]優(yōu)選地，步驟(3)所述羥基自由基捕獲劑為5，5_二甲基-1-吡咯啉氮氧化物。
[0045]優(yōu)選地，步驟(3)所述加入羥基自由基捕獲劑使其在過氧化氫標準溶液中的濃度等于步驟(2)所述羥基自由基捕獲劑在活細胞培養(yǎng)液中的濃度。
[0046]優(yōu)選地，步驟(3)所述紫外光的波長范圍為280-320nm，例如280nm、290nm、300nm、305nm、308nm、31 Onm、315nm、318nm 或 320nm。
[0047]優(yōu)選地，在本發(fā)明中，利用電子順磁共振波譜儀記錄ESR譜圖。
[0048]作為優(yōu)選技術(shù)方案，本發(fā)明所述檢測活細胞中過氧化氫濃度的方法具體包括以下步驟:
[0049](I)以Ag/AgCl電極作為參比電極，鉑片或鉑絲作為對電極，表面修飾并接種有活細胞的氧化銦錫電極作為工作電極組成三電極工作體系，將其插入到電解液中形成三電極電化學測試系統(tǒng)，以開始加入藥物刺激活細胞產(chǎn)生過氧化氫為起始時間，采用記時安培法得到活細胞受藥物刺激后的電流-時間曲線；
[0050](2)在進行步驟(I)的同時，取電化學池中的活細胞培養(yǎng)液，加入羥基自由基捕獲劑5，5-二甲基-1-吡咯啉氮氧化物，經(jīng)波長范圍為280-320nm的紫外光照射后，記錄ESR譜圖，利用該步驟得到的ESR譜圖和步驟(I)得到的電流-時間曲線中同一時間點對應(yīng)的ESR信號強度和電流大小建立ESR信號強度-電流關(guān)系曲線；
[0051 ] (3)配制10—4、10—5、10—6、10—7和10—8mol/L濃度的過氧化氫溶液，加入羥基自由基捕獲劑5，5-二甲基-1-吡咯啉氮氧化物，經(jīng)波長范圍為280-320nm的紫外光照射后，記錄ESR譜圖，建立ESR信號強度-過氧化氫濃度標準曲線；
[0052](4)通過步驟(I)得到的時間-電流曲線得到任意時間下的電流值，然后通過步驟
(2)得到的ESR信號強度-電流關(guān)系曲線讀出相應(yīng)的ESR信號強度，最后利用步驟(3)得到的ESR信號強度-過氧化氫濃度標準曲線得到任意時間下活細胞受刺激后所釋放出的過氧化氫的濃度。
[0053]相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下有益效果:
[0054]與單一電化學分析方法相比，本發(fā)明將電子順磁共振波譜技術(shù)與電化學方法結(jié)合，將利用電子順磁共振波譜技術(shù)所得到的信號強度作為一個中間量，所建立的標準曲線能更加準確的反映活細胞測試體系中過氧化氫的濃度;與單一電子順磁共振方法相比，本發(fā)明利用電子順磁共振波譜技術(shù)與電化學方法結(jié)合可以原位實時監(jiān)測活細胞所釋放過氧化氫的濃度。本發(fā)明將電子順磁共振波譜技術(shù)與電化學方法完美結(jié)合，使得活細胞釋放的過氧化氫濃度的定量檢測更加準確，解決了現(xiàn)有技術(shù)無法實現(xiàn)活細胞中過氧化氫濃度的原位實時檢測的問題，具有廣泛的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0055]圖1是本發(fā)明中工作電極的制備過程示意圖。
[0056]圖2是本發(fā)明實施例1得到的電流-時間關(guān)系曲線，曲線I為細胞接種到工作電極上后加入PMA刺激下產(chǎn)生的電流-時間關(guān)系曲線，曲線2為細胞接種到工作電極上后但是無PMA刺激情況下產(chǎn)生的電流-時間關(guān)系曲線；曲線3為僅有PMA刺激但是未接種細胞到工作電極情況下產(chǎn)生的電流-時間關(guān)系曲線。
[0057]圖3是本發(fā)明實施例1步驟(3)測試得到的活細胞培養(yǎng)液的ESR譜圖.
[0058]圖4是本發(fā)明實施例1建立的ESR信號強度-電流的關(guān)系曲線。
[0059]圖5是本發(fā)明實施例1步驟(4)測試得到的不同濃度的過氧化氫標準溶液的ESR譜圖。
[0060]圖6是本發(fā)明實施例1建立的ESR信號強度-過氧化氫濃度標準曲線。
【具體實施方式】
[0061]下面通過【具體實施方式】來進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明了，所述實施例僅僅是幫助理解本發(fā)明，不應(yīng)視為對本發(fā)明的具體限制。
[0062]實施例1
[0063](I)工作電極(即表面修飾有石墨烯、金納米顆粒、辣根過氧化物酶和細胞粘附劑RGD環(huán)肽的ITO電極并在其表面接種有活細胞)的制備，具體包括以下步驟(其制備過程如圖1所示):
[0064]A、將ITO玻璃置于丙酮、乙醇、超純水中依次超聲20分鐘，然后使用氧等離子體對其表面進行處理，以增加親水性和鋪展性有利于后續(xù)修飾；
[0065]B、將濃度為0.06mg/mL的氧化石墨烯溶液旋涂到上述ITO玻璃表面，然后置于肼蒸汽中于60 0C原位還原1小時；
[0066]C、將10微升金納米顆粒溶液滴加到上述修飾有石墨烯的ITO表面，室溫下自然干燥，而后在4°C條件下，將上述電極浸潤到辣根過氧化物酶溶液中至少24小時，然后用磷酸鹽緩沖溶液沖洗表面三次，得到修飾有金納米顆粒和酶的氧化銦錫(ITO)電極；
[0067]D、10微升RGD環(huán)肽溶液滴加到步驟C得到的電極表面，4°C下自然干燥，得到所述表面修飾的氧化銦錫電極，而后Hela細胞接種到表面修飾的氧化銦錫電極表面，得到工作電極。
[0068](2)電流-時間關(guān)系曲線的建立
[0069]以Ag/AgCl電極作為參比電極，采用鉑片或鉑絲作為對電極，利用上述得到的表面修飾并接種有活細胞的氧化銦錫電極作為工作電極，將上述三電極插入到0.0lmol/L的磷酸鹽緩沖溶液中，形成一個三電極電化學測試系統(tǒng)，以開始加入PMA藥物刺激活細胞產(chǎn)生過氧化氫為起始時間(Omin)，采用記時安培法得到活細胞受藥物刺激后O到60分鐘內(nèi)的電流-時間曲線，結(jié)果如圖2所示。
[0070](3)ESR信號強度-電流關(guān)系曲線的建立
[0071]在進行步驟(2)的同時，每隔5或10分鐘，即分別于0、10、20、25、30、35、40、5011^11時用毛細管取電化學池中的活細胞培養(yǎng)液，加入羥基自由基捕獲劑5，5-二甲基-1-吡咯啉氮氧化物，使其在活細胞培養(yǎng)液中的濃度為50mM，經(jīng)280-320nm波段的紫外光照射30min后，使活細胞培養(yǎng)液中的過氧化氫充分分解為羥基自由基，采用X-band電子順磁共振波譜儀(FA200，日本JEOL公司)記錄ESR譜圖，結(jié)果如圖3所示。
[0072]對得到的ESR譜圖以及步驟(2)得到的電流-時間曲線進行分析，取相同時間點的ESR信號強度(譜圖中間兩個信號峰強度的平均值)和電流值(某時間點的電流值減掉起始時間的電流值)，以電流值作為橫坐標，以ESR信號強度作為縱坐標，擬合得到如圖4中的關(guān)系曲線，線性回歸方程為y = 60.3+731.5x，ESR信號強度與電流值呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.995。
[0073](4)ESR信號強度-過氧化氫濃度標準曲線的建立
[0074]配制濃度分別為IX 10—6、5 X 10—6、1 X 10—5、2 X 10—5、5 X 10—5moVL的過氧化氫標準溶液，加入羥基自由基捕獲劑5，5-二甲基-1-吡咯啉氮氧化物，使其在過氧化氫標準溶液中的濃度為50mM，經(jīng)280-320nm波段的紫外光照射30min后，使過氧化氫標準溶液中的過氧化氫充分分解為羥基自由基，采用X-band電子順磁共振波譜儀記錄ESR譜圖，結(jié)果如圖5所示。利用該步驟得到的ESR譜圖和步驟(I)得到的電流-時間曲線中同一時間點對應(yīng)的ESR信號強度和電流大小，以過氧化氫濃度的對數(shù)值作為橫坐標，以ESR信號強度作為縱坐標，得到如6所示的ESR信號強度-過氧化氫濃度標準曲線，線性回歸方程為y = 1995.3+273.0x，線性相關(guān)系數(shù)為0.997。
[0075](5)根據(jù)如上建立的曲線，可以從圖2讀出加入藥物刺激后任意時間點的電流值；根據(jù)圖4將電流值換算成ESR信號強度;最后，從圖6讀出這一 ESR信號強度所對應(yīng)的過氧化氫的濃度值，由此完成對活細胞中過氧化氫濃度的實時檢測。
[0076]
【申請人】聲明，本發(fā)明通過上述實施例來說明本發(fā)明的工藝方法，但本發(fā)明并不局限于上述工藝步驟，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述工藝步驟才能實施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進，對本發(fā)明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護范圍和公開范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種檢測活細胞中過氧化氫濃度的方法，其特征在于，所述方法為利用電化學測試得到活細胞受藥物刺激后的電流-時間曲線，與此同時進行電子順磁共振波譜測試，得到電化學池中活細胞在紫外光照射后的ESR譜圖，建立ESR信號強度-電流關(guān)系曲線；同樣對過氧化氫標準溶液進行電子順磁共振波譜測試，得到過氧化氫標準溶液在紫外光照射后的ESR譜圖，建立ESR信號強度-過氧化氫濃度標準曲線，綜合上述建立的三種曲線得到任意時間下的活細胞受刺激后所釋放出的過氧化氫的濃度，完成活細胞中過氧化氫濃度的實時檢測。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (1)將三電極工作體系插入到電解液中形成三電極電化學測試系統(tǒng)，所述三電極工作體系的工作電極上接種有活細胞，以開始加入藥物刺激活細胞產(chǎn)生過氧化氫為起始時間，采用記時安培法得到活細胞受藥物刺激后的電流-時間曲線； (2)在進行步驟(I)的同時，取電化學池中的活細胞培養(yǎng)液，加入羥基自由基捕獲劑，經(jīng)紫外光照射后，記錄ESR譜圖，利用該步驟得到的ESR譜圖和步驟(I)得到的電流-時間曲線中同一時間點對應(yīng)的ESR信號強度和電流大小建立ESR信號強度-電流關(guān)系曲線； (3)配制過氧化氫標準溶液，加入羥基自由基捕獲劑，經(jīng)紫外光照射后，記錄ESR譜圖，建立ESR信號強度-過氧化氫濃度標準曲線； (4)通過步驟(I)得到的時間-電流曲線得到任意時間下的電流值，然后通過步驟(2)得到的ESR信號強度-電流關(guān)系曲線讀出相應(yīng)的ESR信號強度，最后利用步驟(3)得到的ESR信號強度-過氧化氫濃度標準曲線得到任意時間下活細胞受刺激后所釋放出的過氧化氫的濃度。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟(I)所述三電極工作體系是以Ag/AgCl電極作為參比電極，鉑片或鉑絲作為對電極，表面修飾并接種有活細胞的氧化銦錫電極作為工作電極； 優(yōu)選地，所述表面修飾的氧化銦錫電極從靠近氧化銦錫電極的一側(cè)起表面逐層分別修飾有石墨稀、貴金屬納米顆粒、過氧化氫分解酶和細胞粘附劑。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于，所述表面修飾的氧化銦錫電極的制備方法如下: A、利用氧等離子體對氧化銦錫玻璃進行表面處理； B、將氧化石墨烯溶液旋涂到步驟A得到的氧化銦錫玻璃表面，置于肼蒸汽中進行原位還原，得到表面修飾有石墨烯的氧化銦錫玻璃； C、將貴金屬納米顆粒溶液加至步驟B得到的氧化銦錫玻璃表面，干燥，而后將其在過氧化氫分解酶溶液中浸潤，得到修飾有貴金屬納米顆粒和酶的氧化銦錫電極； D、將細胞粘附劑溶液加至步驟C得到的電極表面，干燥得到所述表面修飾的氧化銦錫電極。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法，其特征在于，在步驟A所述利用氧等離子體對氧化銦錫玻璃進行表面處理前，先將氧化銦錫玻璃分別置于丙酮、乙醇和超純水中依次超聲10-30分鐘； 優(yōu)選地，步驟B所述氧化石墨稀溶液的濃度為0.01-0.lmg/mL； 優(yōu)選地，步驟B所述原位還原的溫度為50-70 °C ； 優(yōu)選地，步驟B所述原位還原的時間為4-12小時； 優(yōu)選地，步驟(^所述貴金屬納米顆粒為銀納米顆粒、金納米顆?；蜮櫦{米顆粒中的任意一種或至少兩種的組合，優(yōu)選金納米顆粒； 優(yōu)選地，步驟C所述金貴金屬納米顆粒溶液中貴金屬納米顆粒的質(zhì)量百分數(shù)為0.01-0.05% ； 優(yōu)選地，步驟(^所述貴金屬納米顆粒溶液與步驟B所述氧化石墨稀溶液的體積比為1:2-2:1； 優(yōu)選地，步驟C所述過氧化氫分解酶為辣根過氧化物酶； 優(yōu)選地，步驟0所述過氧化氫分解酶溶液的濃度為l-5mg/mL ； 優(yōu)選地，步驟D所述細胞粘附劑為由精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸序列組成的環(huán)狀短肽； 優(yōu)選地，所述細胞粘附劑溶液的濃度為l_5mg/mL; 優(yōu)選地，步驟D所述細胞粘附劑溶液與步驟C所述金納米顆粒溶液的體積比為1:2-2:1。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法，其特征在于，步驟(I)所述電解液為磷酸鹽緩沖溶液； 優(yōu)選地，步驟(I)所述藥物為佛波醇12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯； 優(yōu)選地，步驟(I)所述活細胞為能夠在工作電極上貼壁生長的活細胞。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述羥基自由基捕獲劑為5，5-二甲基-1-吡咯啉氮氧化物； 優(yōu)選地，步驟(2)所述加入羥基自由基捕獲劑使其在活細胞培養(yǎng)液中的濃度為20-80mM，優(yōu)選40-50mM; 優(yōu)選地，步驟(2)所述紫外光的波長范圍為280-320nm。8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述過氧化氫標準溶液的濃度為10—9-10—3mol/L; 優(yōu)選地，步驟(3)所述配制過氧化氫標準溶液時所選定的過氧化氫的濃度梯度為I X 10—6、5 X 10—6、I X 10—5、2 X 10—5、5 X 10—W/L ； 優(yōu)選地，步驟(3)所述羥基自由基捕獲劑為5，5-二甲基-1-吡咯啉氮氧化物； 優(yōu)選地，步驟(3)所述加入羥基自由基捕獲劑使其在過氧化氫標準溶液中的濃度等于步驟(2)所述羥基自由基捕獲劑在活細胞培養(yǎng)液中的濃度； 優(yōu)選地，步驟(3)所述紫外光的波長范圍為280-320nm。9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的方法，其特征在于，利用電子順磁共振波譜儀記錄ESR譜圖。10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項所述的方法，其特征在于，所述檢測活細胞中過氧化氫濃度的方法包括以下步驟: (1)以Ag/AgCl電極作為參比電極，鉑片或鉑絲作為對電極，表面修飾并接種有活細胞的氧化銦錫(ITO)電極作為工作電極組成三電極工作體系，將其插入到電解液中形成三電極電化學測試系統(tǒng)，以開始加入藥物刺激活細胞產(chǎn)生過氧化氫為起始時間，采用記時安培法得到活細胞受藥物刺激后的電流-時間曲線； (2)在進行步驟(I)的同時，取電化學池中的活細胞培養(yǎng)液，加入羥基自由基捕獲劑5，5-二甲基-1-吡咯啉氮氧化物，經(jīng)波長范圍為280-320nm的紫外光照射后，記錄ESR譜圖，利用該步驟得到的ESR譜圖和步驟(I)得到的電流-時間曲線中同一時間點對應(yīng)的ESR信號強度和電流大小建立ESR信號強度-電流關(guān)系曲線； (3)配制10—4、10—5、10—6、10—7和10—Vol/L濃度梯度的過氧化氫溶液，加入羥基自由基捕獲劑5，5-二甲基-1-吡咯啉氮氧化物，經(jīng)波長范圍為280-320nm的紫外光照射后，記錄ESR譜圖，建立ESR信號強度-過氧化氫濃度標準曲線； (4)通過步驟(I)得到的時間-電流曲線得到任意時間下的電流值，然后通過步驟(2)得到的ESR信號強度-電流關(guān)系曲線讀出相應(yīng)的ESR信號強度，最后利用步驟(3)得到的ESR信號強度-過氧化氫濃度標準曲線得到任意時間下活細胞受刺激后所釋放出的過氧化氫的濃度。
【文檔編號】G01N24/10GK105866206SQ201610227973
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月13日
【發(fā)明人】宮建茹, 劉倩, 辛琪
【申請人】國家納米科學中心