一種胺苯吡唑酮?dú)埩袅康膅c-ms/ms測(cè)定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種胺苯吡唑酮?dú)埩袅康腉C-MS/MS測(cè)定方法，更具體地說是采用氣相 色譜串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)定性定量測(cè)定糧谷、豬肉、牛肉、羊肉、雞肉等動(dòng)物肌肉及制品等 復(fù)雜基質(zhì)的動(dòng)植物源性食品中殘留的胺苯吡唑酮含量的方法，屬于農(nóng)藥殘留量的測(cè)定技術(shù) 領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 胺苯吡唑酮(Fenpyrazamine)是日本住友化學(xué)株式會(huì)社研究開發(fā)的基于吡啶的雜 環(huán)類殺真菌劑，通過抑制麥角留醇生物合成途徑的作用機(jī)制的病原體，顯示出對(duì)菌絲生長(zhǎng) 和孢子萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)的抑制作用。CAS號(hào)為:473798-59-3，分子式為CnifeNsOsS，分子量 為331.43，胺苯吡唑酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：
[0003] 胺苯吡菌酮是住友化學(xué)獨(dú)立開發(fā)的新殺菌劑，具有新穎化學(xué)結(jié)構(gòu)，能迅速滲入作 物體內(nèi)，對(duì)感染的真菌能快速發(fā)揮藥效，主要用于控制葡萄、石果、蔬菜作物中的灰霉病、菌 核病和鏈核盤菌。另外，胺苯吡菌酮對(duì)哺乳類動(dòng)物高度安全，在環(huán)境中能迅速降解，可在多 種作物采收前應(yīng)用。胺苯吡菌酮最初在韓國(guó)推出，在胺苯吡菌酮原藥獲得第一個(gè)全球登記 后，住友化學(xué)又在韓國(guó)推出其含胺苯吡菌酮原藥的殺菌劑新品，并以Botrycide商標(biāo)名進(jìn)行 銷售，該產(chǎn)品為30%的懸浮劑型，用于水果和蔬菜作物。2009年，住友化學(xué)于申請(qǐng)歐盟登記 用于溫室栽培的西紅柿、茄子、辣椒和萌蘆等蔬菜作物，還有葡萄的田間應(yīng)用，但當(dāng)時(shí)僅在 波蘭獲得為期三年的臨時(shí)登記，商品名為Pr 〇leCtU(32012年6月，歐盟食品與動(dòng)物健康常務(wù) 委員會(huì)已投票通過了其登記申請(qǐng)，胺苯吡菌酮已經(jīng)獲得歐盟批準(zhǔn)登記，將于2013年1月1日 起正式列入歐盟農(nóng)藥1107/2009法規(guī)下的已登記有效成分名單，有效期為十年。胺苯吡菌酮 在歐盟取得登記后，將用于葡萄和一些溫室作物，如番茄、茄子、辣椒和萌蘆等。胺苯吡菌酮 對(duì)葡萄孢菌具有優(yōu)異防控能力，住友化學(xué)將進(jìn)一步于2012/13年度向意大利和智利市場(chǎng)推 廣該產(chǎn)品，其全球商品名為Prolectus。現(xiàn)已在美國(guó)和很多亞洲國(guó)家進(jìn)行了登記，具有很廣 闊的應(yīng)用前景。
[0004] 隨著胺苯吡唑酮的登記、推廣和使用，作為我國(guó)主要出口市場(chǎng)的歐盟、美國(guó)、加拿 大等國(guó)家制定了其在疏采、水果、糧谷和畜廣品等食品農(nóng)廣品中的最大允許殘留量(MRL)， 歐盟制定殺菌劑胺苯吡菌酮在多種作物上的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。該標(biāo)準(zhǔn)已于2012年5月7日 生效。胺苯吡菌酮在馬鈴薯、辣椒、茄子中的最大殘留限量為3mg/kg;在萌蘆、黃瓜、小黃瓜、 綠皮南瓜中的最大殘留限量為〇.7mg/kg;在柑橘、葡萄柚、檸檬等水果及各種干果中的殘留 限量最為嚴(yán)格，為〇. 〇lmg/kg。美國(guó)規(guī)定胺苯吡唑酮在杏仁中的最大殘留限量為0.02mg/kg; 在杏仁外殼中的最大殘留限量為1.5mg/kg;在開心果中的最大殘留限量為0.02mg/kg;在萬 苣頭中的最大殘留限量為1.5mg/kg;在萬苣葉中的最大殘留限量為2mg/kg;在蔓越莓亞組 13-07A中的最大殘留限量為5mg/kg;在灌木漿果類亞組13-07B中的最大殘留限量為5mg/ kg;在小型蔓生水果13-07F亞組中（除獼猴桃外）的最大殘留限量為3mg/kg;在葡萄汁中的 最大殘留限量為4mg/kg;在矮生漿果類亞組13-07G中的最大殘留限量為3mg/kg;在人參中 的最大殘留限量為〇.7mg/kg。加拿大規(guī)定胺苯吡唑酮在葡萄汁、生菜、萵苣、人參根、杏仁堅(jiān) 果、開心果中的M RL分別為4 · Omg/kg、2 · Omg/kg、1 · 5mg/kg、0 · 7mg/kg和0 · 02mg/kg;歐盟、日 本等國(guó)家規(guī)定沒有制定相應(yīng)農(nóng)藥的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，出口至其國(guó)家的食品農(nóng)產(chǎn)品包括畜禽 肉等動(dòng)物源性食品中殘留限量均實(shí)行〇.〇lmg/L的"一律標(biāo)準(zhǔn)"。
[0005] 現(xiàn)階段，對(duì)胺苯吡唑酮?dú)埩袅繙y(cè)定方法的研究較少，報(bào)道的檢測(cè)方法主要為蔬菜 和水果中胺苯吡唑酮?dú)埩魴z測(cè)方法，這些檢測(cè)方法均采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)測(cè) 定蔬菜和水果中胺苯吡唑酮?dú)埩袅康臋z測(cè)方法，使用LC-MS/MS測(cè)定食品農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留 具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，但由于其價(jià)格較昂貴，很多檢測(cè)機(jī)構(gòu)、企業(yè)或科研院所未 配置該儀器或配置臺(tái)數(shù)較少，由于不同的化合物采用LC-MS/MS檢測(cè)時(shí)，需使用不同的流動(dòng) 相或色譜柱，這樣需要不斷更換色譜柱、流動(dòng)相并耗費(fèi)比較長(zhǎng)的時(shí)間對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行平衡，這一 定程度上制約了 LC-MS/MS的應(yīng)用。使用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)分析食品農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng) 藥殘留具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高、選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)幾百種農(nóng)藥的多殘留分析，但迄 今為止未見食品農(nóng)產(chǎn)品中胺苯吡唑酮?dú)埩袅康腉C-MS/MS檢測(cè)方法的報(bào)道，由于糧谷、動(dòng)物 源性食品等食品農(nóng)產(chǎn)品基質(zhì)比較復(fù)雜，須建立凈化效果良好的樣品前處理方法和儀器分析 條件才能滿足檢測(cè)要求，因此，建立氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)定性和定量分析糧谷和 動(dòng)物源性食品中胺苯吡唑酮?dú)埩袅康臋z測(cè)方法具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種胺苯吡唑酮?dú)埩袅康腉C-MS/MS測(cè)定方法，主要用于測(cè)定 糧谷、動(dòng)物源性食品等復(fù)雜基質(zhì)食品農(nóng)產(chǎn)品中胺苯吡唑酮?dú)埩袅俊?br>[0007] 為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:一種胺苯吡唑酮?dú)埩袅康腉C-MS/ MS測(cè)定方法，包括如下步驟：
[0008] (1)提取 稱取混勻樣品于具塞離心管中，加入適量水復(fù)蘇后，定量加入乙腈或含1 %乙酸的乙腈 溶液均質(zhì)或振蕩超聲提取，然后加入氯化鈉或乙酸鈉中的一種和無水硫酸鎂，劇烈渦旋 lmin后離心。
[0009] (2)凈化 移取一定體積樣品提取液，濃縮至lmL左右，經(jīng)C18/PSA固相萃取柱凈化，乙腈洗脫，收 集洗脫液，取部分洗脫液濃縮至干后，用體積比為1/1的丙酮/正己烷混合溶劑溶解定容，過 膜后，待氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)檢測(cè)。
[0010] (3)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制 將不含胺苯吡唑酮的同種類基質(zhì)空白樣品按上述步驟（1)、（2)處理時(shí)，得樣品提取凈 化殘?jiān)?，加入適量溶劑和標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋混勻，配制成至少3個(gè)濃度的胺苯吡唑酮系列標(biāo)準(zhǔn) 工作液。
[0011] (4)氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)測(cè)定 將步驟(3)中的各濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行GC-MS/MS測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)工作液的色譜峰 面積對(duì)其相應(yīng)濃度進(jìn)行回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線;在相同條件下將步驟(2)中凈化后的 樣品液注入GC-MS/MS進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得樣品液中胺苯吡唑酮的色譜峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)工作曲 線，得到樣品液中胺苯吡唑酮含量，然后根據(jù)樣品液所代表試樣的質(zhì)量計(jì)算得到樣品中胺 苯吡唑酮?dú)埩袅俊Ｈ羯蠙C(jī)溶液中胺苯吡唑酮?dú)埩袅砍^線性范圍上限，需用定容溶劑將上 機(jī)溶液濃度稀釋至線性范圍之內(nèi)。
[0012] 步驟(1)中樣品若為含水量較少的樣品，提取前須加適量水充分浸潤(rùn)。
[0013] 步驟（1)中采用乙腈提取時(shí)加入氯化鈉鹽析，采用含1%乙酸的乙腈溶液提取時(shí)加 入乙酸鈉鹽析。
[0014] 步驟(2)中進(jìn)行C18/PSA固相萃取凈化，乙腈洗脫時(shí)，洗脫體積為6~8mL。
[0015] 步驟(4)中氣相色譜條件為:色譜柱:HP-5MS毛細(xì)管色譜柱，柱長(zhǎng)30m，內(nèi)徑0.25mm， 膜厚0.25μπι;進(jìn)樣口溫度250°C ;載氣：He，不分流模式進(jìn)樣，進(jìn)樣量：lyL;恒流模式，流速 1.2mL/min;升溫程序:初溫60°C保持2min，以每分鐘20°C的速度升至200°C，然后以每分鐘2 °C的速度升至220°C，再以每分鐘20°C的速度升至280°C，保持lOmin;傳輸線溫度:290°C。
[0016] 步驟(4)中質(zhì)譜條件為：電離模式：電子轟擊電離(EI，70eV);離子源溫度280°C;碰 撞氣：氣氣：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描方式MRM，監(jiān)測(cè)參數(shù)為：
[0017」步驟(4)中測(cè)定樣液和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液時(shí)，若樣液中農(nóng)藥色譜峰保留時(shí)間與標(biāo) 準(zhǔn)溶液中相應(yīng)農(nóng)藥保留時(shí)間相一致，并且在扣除背景后的樣品質(zhì)譜圖中，所選擇的離子均 出現(xiàn)，而且離子豐度比與標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子豐度比相一致，則可判斷樣液中存在這種農(nóng)藥;若 上述兩個(gè)條件不能同時(shí)滿足，則判斷不含該種農(nóng)藥。
[0018] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0019] 本發(fā)明利用分散固相萃取技術(shù)，建立了簡(jiǎn)便、快速并能有效避免樣品中基質(zhì)干擾 的樣品前處理方法，將此前處理方法結(jié)合GC-MS/MS應(yīng)用于糧谷、動(dòng)物源性食品中胺苯吡唑 酮定性確證和定量檢測(cè)，平均回收率為88.8%~97.8%，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為6.3% ~8.2%，檢出限低于0.42yg/kg，具有操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高及重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。 能滿足美國(guó)、歐盟、日本等國(guó)家對(duì)相應(yīng)產(chǎn)品安全檢測(cè)的技術(shù)要求，為保障我國(guó)人民食品安全 及對(duì)外出口貿(mào)易健康發(fā)展提供有力的技術(shù)支撐。
【附圖說明】
[0020] 圖1為添加在空白豬肉基質(zhì)中的胺苯吡唑酮標(biāo)液的GC-MS/MS選擇離子色譜圖。
[0021] 圖2為不含胺苯吡唑酮的豬肉空白樣品的GC-MS/MS選擇離子色譜圖。
[0022]圖3為以不含胺苯吡唑酮的豬肉空白樣品為基質(zhì)配制的胺苯吡唑酮標(biāo)準(zhǔn)工作曲 線。
【具體實(shí)施方式】
[0023]現(xiàn)以以下實(shí)施實(shí)例來說明本發(fā)明，但并不是限制本發(fā)明的范圍。
[0024]實(shí)施例中使用的儀器與試劑
[0025] T18 Basic均質(zhì)器（IKA，Germany) ;CR21GHI離心機(jī)（日立，Japan) ;MS3基本型旋禍 混合器（IKA，Germany) ;TurboVap LV型樣品自動(dòng)濃縮儀（Caliper，USA) ;7890N氣相色譜-5977C質(zhì)譜儀(Agilent，USA);C18/PSA固相萃取柱(6mL，500mg/500mg)購(gòu)于天津博納艾杰爾 科技有限公司。
[0026] 試劑
[0027] 乙腈、丙酮、正己燒（HPLC級(jí)，Merke，Germany);乙酸（HPLC級(jí)，CNW，Germany);無水 硫酸鎂、氯化鈉和乙酸鈉為分析純，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
[0028] 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):純度98.0%，購(gòu)自日本和光純農(nóng)工業(yè)株式會(huì)社。
[0029] 實(shí)施例1:小麥中胺苯吡唑酮?dú)埩袅康臋z測(cè)
[0030] (1)樣品前處理
[0031] 提取 稱取經(jīng)充分混勾的5g小麥樣品（研磨成面粉)于50mL離心管中，加入20mL水復(fù)蘇30min 后，準(zhǔn)確加入20mL含1 %乙酸的乙腈溶液，振蕩提取20min，超聲提取5min，加入3g無水硫酸 鎂和2g乙酸鈉，禍旋lmin后，7000r/min離心5min。離心后，取8mL乙腈提取液于40°C旋蒸或 氮?dú)獯抵两?，加入lmL乙腈渦旋后，待凈化。
[0032] 凈化 用5mL乙腈預(yù)洗C18/PSA固相萃取柱，當(dāng)液面到達(dá)吸附劑的頂部時(shí)，將上述提取溶液轉(zhuǎn) 入柱中，用2mL乙腈洗滌試管，并將洗滌液移入SPE柱中，待溶液達(dá)到吸附劑