Augurin免疫試驗的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于免疫分析領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及體液樣品或組織樣品中Augurin 或其前體或片段含量的測定。
【背景技術(shù)】
[0002] Augurin，是一種新近鑒定到的分泌肽，由食道癌相關(guān)基因-4(ECRG4)編碼，該肽在 脊椎動物間保守(Mirabeau等2007.基因組石開究(Genome Research) 17:320-327)。人ECRG4 編碼一個148氨基酸的蛋白質(zhì)，該蛋白含有位于殘基1-30的前導(dǎo)肽。ECRG4編碼蛋白的一種 加工形式被命名為Augur in (殘基31-148 )，但是，位于殘基68-71的一個推定激素原剪切位 點會產(chǎn)生兩條推定激素肽:其一按ECRG4的EC部分命名為ecilin(殘基31-70)，另一為片段 71-148,按ECRG4的RG部分命名為argilin(Gonzalez等2011.CNS液體與屏障（Fluids and Barriers of the CNS).8:6)。供凝血酶剪切的第二個推定蛋白水解共有序列位點在與凝 血酶共育時會產(chǎn)生C-末端Δ 16序列（氨基酸殘基134-148)。此外，Augurin二聚體也已有記 載(Gonzalez等2011 .CNS液體與屏障(Fluids and Barriers of the CNS). 8:6) 〇
[0003] 對小鼠垂體瘤和人結(jié)腸癌細胞內(nèi)Augur in翻譯后修飾的研究發(fā)現(xiàn)，它經(jīng)弗林蛋白 酉每剪切，經(jīng)組成型分泌途徑分泌（Ozawa等2011 .Molecular Endocrinology 25(5):776-784)。此外，Augurin在轉(zhuǎn)運和蛋白酶解切割過程中發(fā)生硫(酸)化(在R41E42和/或R 7QQ71)，這 是Augur in抑制細胞繁殖所必需的一個翻譯后修飾。
[0004] Dang等2012發(fā)現(xiàn)ECRG4位于人細胞上皮表面(Dang等2012.Cell Tissue Research 348(3) :505-514)，并推測ECRG4釋放具有細胞特異性，且組織特異性加工可調(diào)控不同組織 中不同的ECRG4活性。
[0005] ECRG4表現(xiàn)出人心臟、腦、胎盤、肺、肝、骨骼肌、腎和胰內(nèi)的組織特異性表達，據(jù)測， 心臟和腎內(nèi)表達最強（Steck等2002 · Biochemical and Biophysical Research Communications 299:109-115)。腦內(nèi)各區(qū)中，ECGR4主要存在于下丘腦和脈絡(luò)叢上皮細胞 (Tadross等2010·British Journal of Pharmacology 159:1663-1671;Donahue等 2010. Cerebrospinal Fluid Research7(Suppl 1):S32;Gonzalez等2011·Fluids and Barriers of the CNS 8:6)。大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS)受損后，觀察到脈絡(luò)叢上皮內(nèi) Augurin和ECRG4基因表達快速減少，伴有CNS損傷后Augurin立即動員，可能釋放進了腦脊 液（CSF)(Podvin等2011.PL〇S One 6(9):e24609)。人CSF中，前Augurin被認為是一種內(nèi)源 月太（Hoelttae等2012.PL〇S One 7(8):e42555)〇
[0006] 據(jù)信，Augurin刺激經(jīng)由下丘腦CRF釋放的ACTH釋放，可作為調(diào)節(jié)丘腦-垂體-腎上 腺軸的新型治療革巴標(Tadross等2010·British Journal of Pharmacology 159:1663-1671)。并且，ECRG4表達在軟骨細胞和軟骨中特別豐富，軟骨分化期間顯著升高，骨關(guān)節(jié)炎 性軟骨中則降低，這提示ECRG4是已分化關(guān)節(jié)軟骨細胞和軟骨毀損的標記(Huh等2009.基因 448:7-15)。
[0007] 似乎，ECRG4還與成年小鼠腦內(nèi)神經(jīng)細胞衰老和老化有關(guān)(Kujuro等2010.PNAS 107(18):8259-8264)。
[0008] ECRG4基因在不同癌癥(例如食管鱗狀細胞癌[ESCC]，前列腺癌，結(jié)直腸癌，惡性膠 質(zhì)瘤和胃癌）中高甲基化而下調(diào)，這提示其表觀遺傳控制參與了正常細胞的癌變(Yue等 2003.World Journal of Gastroenterology 9(6):1174-1178;Vanaja等2009·Cancer Investigation 27(5):549-560;Goetze等2009·BMC Cancer 9:447;Wang等 2012. Hepatogastroenterology 59( 118): 1696-1698) 〇ECRG4基因的高甲基化被關(guān)耳關(guān)至lj前 列腺癌復(fù)發(fā)的預(yù)測(Vanaja等2009. Cancer Investigation 27(5): 549-560)，并可用于監(jiān) 測早期胃癌和預(yù)測病理分期(Wang等2012 · Hepatogastroenterology 59(118): 1696-1698)。并且，ECRG4mRNA表達水平可作為ESCC患者獨立預(yù)后因子的一個候選，因為該水平與 局部浸潤程度、病理階段和患者預(yù)后相關(guān)(Mori等Oncology Reports 18: 981-985; Li等 2009. International Journal of Cancer :125,1505-1513) 〇Mori及其同事進一步假設(shè)，這 對于為手術(shù)挑選能夠從中獲益的患者來說可能也很重要。浸潤性乳腺癌樣本中，ECRG4mRNA 表達降低，且與癌癥階段和大小相關(guān)(Sabatier等2011PL〇S ONE 6(ll):e27656)。并且，它 被提作預(yù)后因子，因為它與乳腺癌患者的無病存活和整體存活相關(guān)。
[0009] 人外周血細胞中ECRG4 mRNA升高，但脂多糖(LPS)孵育顯著降低多形核細胞和單 核細胞的細胞表面ECRG4(Baird等2012 . Journal of Leucocyte Biology 91(5) :773-781)。在經(jīng)LPS-處理白細胞的條件培養(yǎng)基中檢測到了 14kDa的ECRG4和8kDa的ECRG4(對應(yīng)于 ECRG471-148)。白細胞上ECRG4表達水平低下可關(guān)聯(lián)TBSA燒傷、系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征 [SIRS]和鈍性外傷患者的損傷，這提示ECRG4在損傷生物學(xué)中具有臨床相關(guān)性，并參與炎性 反應(yīng)。然而，血液中沒有測到ECRG4表達(Baird等2012.Journal of Leucocyte Biology91 (5): 773-781)。此外，大鼠中耳感染實驗中，大鼠粘膜組織中，ECRG4表達在感染后3-48小時 迅速下降（Kurabi等2013-PLoS One 8(4):e61394)。
[0010] 已有檢測人前原_(71-107)-Augur in (prepr〇-( 71-107)-Augur in)的競爭性酶學(xué) 免疫試驗，由菲尼克斯制藥公司（Phoenix Pharmaceuticals Inc，美國加州伯林蓋姆）出 品。然而，Augurin及其片段和前體檢測仍然需要高靈敏度、高特異性、高再現(xiàn)且低實驗間偏 差的更好試驗。本發(fā)明提供了這樣的試驗，它可用作（例如)研究工具來高特異性地檢測低 濃度Augur in 〇

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明主題是一種免疫試驗的方法，用于檢測Augurin或其前體或片段。就某一方 面而言，所述方法包括以下步驟：
[0012] (a)令疑有Augurin或其前體或片段的樣品接觸對Augurin或其前體或片段特異性 的第一抗體或其抗原結(jié)合性片段或衍生物和對Augurin或其前體或片段特異性的第二抗體 或其抗原結(jié)合性片段或衍生物，接觸的條件允許:在允許所述兩抗體與Augurin或其前體或 片段結(jié)合的條件下形成與Augurin或其前體或片段的三元復(fù)合物，所述第一和第二抗體或 其抗原結(jié)合性片段或衍生物對SEQ ID NO: 1所示前Augurin(pre-Augurin)的氨基酸71至 107內(nèi)所含表位具有特異性，并且
[0013]所述第一和第二抗體或其抗原結(jié)合性片段或衍生物對不同且非交疊表位具有特 異性，以及
[0014] (b)檢測所述兩抗體或其抗原結(jié)合性片段或衍生物與Augurin或其前體或片段的 結(jié)合。
[0015] 本發(fā)明還涉及包括以下步驟、用于檢測Augurin或其前體或片段的免疫分析方法： [0016] (a)令疑有Augurin或其前體或片段的樣品接觸對Augurin或其前體或片段特異性 的第一抗體或其抗原結(jié)合性片段或衍生物，接觸條件允許形成Augur in或其前體或片段與 所述第一抗體或其抗原結(jié)合性片段或衍生物的復(fù)合物，
[0017] (b)令所述樣品接觸對Augurin或其前體或片段特異性的第二抗體或其抗原結(jié)合 性片段或衍生物，接觸條件允許形成Augur in或其前體或片段與所述第一和第二抗體或其 抗原結(jié)合性片段或衍生物的三元復(fù)合物，其中，所述第一和第二抗體或其抗原結(jié)合性片段 或衍生物對SEQ ID NO: 1所示前Augurin的氨基酸71至107內(nèi)所含表位具有特異性，所述第 一和第二抗體或其抗原結(jié)合性片段或衍生物對不同且非交疊表位具有特異性，以及
[0018] (c)檢測所述三元復(fù)合物。
[0019]本發(fā)明還涉及用于檢測Augurin或其前體或片段的試劑盒，所述試劑盒包含 [0020] (i)SEQ ID NO: 1所示前Augurin的氨基酸71至107內(nèi)、優(yōu)選氨基酸71至88內(nèi)、更優(yōu) 選氨基酸71至83內(nèi)所含表位的特異性抗體或其抗原結(jié)合性片段或衍生物，
[0021] (ii)SEQ ID NO: 1所示前Augurin的氨基酸71至107內(nèi)、優(yōu)選氨基酸71至88內(nèi)、更優(yōu) 選氨基酸79至88內(nèi)所含表位的特異性抗體或其抗原結(jié)合性片段或衍生物，
[0022]本發(fā)明另一主題是抗Augurin抗體或其抗原結(jié)合性片段或衍生物，所述抗體或其 片段或衍生物對SEQ ID NO: 1所示前Augurin的氨基酸71至107內(nèi)、優(yōu)選71至88內(nèi)、更優(yōu)選71 至83內(nèi)所含表位具有特異性，或?qū)EQ ID NO: 1所示前Augurin的氨基酸79至88內(nèi)所含表位 具有特異性。
[0023] 本發(fā)明還涉及雜交瘤細胞系，選自：保藏號為DSM ACC3206的細胞系439/F4,保藏 號為DSM ACC3207的細胞系439/H10,保藏號為DSM ACC3208的細胞系482/H2,保藏號為DSM ACC3209的細胞系482/H10,保藏號為DSM ACC3210的細胞系482/H7和保藏號為DSM ACC3211 的細胞系482/G9。
[0024] 方法的優(yōu)化改變形式如從屬權(quán)利要求所述。
【附圖說明】
[0025]圖1:前Augurin的結(jié)構(gòu)和可能的加工肽。
[0026] 圖2:以肽PQW14(SEQ ID N0:9)、AK 439/F4和AK 439/H10免疫所得單克隆抗體的 表位圖。
[0027] 圖3:以肽AUG-EL10(SEQ ID N0:10)、AK 482/H7、AK 482/H2、AK482/G9和AK 482/ H10免疫所得單克隆抗體的表位圖。
[0028] 圖4:分析物穩(wěn)定性。所示為單克隆免疫試驗所測每一基質(zhì)十份樣本22°C儲存指定 時長后比之未儲存樣本(恢復(fù)率％ )的平均值(SEM)。
[0029]圖5:單克隆免疫試驗測得的重組型前Augurin的量效曲線。
[0030]圖6 :單克隆免疫試驗測得的健康群體(n= 100)中的Augurin免疫反應(yīng)性頻率分 布。
[0031] 圖7:用菲尼克斯制藥(Phoenix Pharmaceuticals Inc)的競爭性酶免疫試驗前原 Augurin(prepro-Augurin) (71-107) (A)，多克隆參比夾心免疫試驗(B)和單克隆夾心免疫 試驗(C)對不同標準材料的測定。
[0032] 發(fā)明詳述
[0033]本發(fā)明涉及一種用于檢測Augurin蛋白或其前體肽或肽片段的免疫試驗。具體地 說，所述免疫試驗檢測的表位包括SEQ ID NO: 1所示前Augurin的氨基酸殘基71至107、優(yōu)選 氨基酸殘基71至88。因此，本公開中所述免疫試驗?zāi)軌驒z測出包含前Augurin序列中氨基酸 殘基71至107、優(yōu)選71至88的Augur in片段和前體。此類片段包括:argil in、Δ 16-Augur in和 A16-argilin，見下文(例如，圖1)。本發(fā)明的免疫試驗方法是基于下述意外發(fā)現(xiàn):能夠特異 性結(jié)合前Augurin的氨基酸71至107內(nèi)所含表位的兩種抗Augur in抗體的組合增強Augur in (或其包含這些表位的片段或前體）的檢測。本發(fā)明的免疫試驗方法利用兩種不同的抗 Augur in抗體，它們能夠特異性結(jié)合SEQ ID NO: 1所示前Augur in的氨基酸71至107、優(yōu)選71 至88內(nèi)所含表位。據(jù)本發(fā)明的免疫試驗方法，能夠依據(jù)所述兩種抗體與Augurin或其前體或 片段的結(jié)合來定性和/或定量檢測Augurin或其前體或片段。若兩抗體都結(jié)合Augurin或其 片段或前體則鑒定存在有Augurin或其片段或前體。換言之，本發(fā)明涉及一種用于檢測樣品 中Augur in或其前體或片段的免疫試驗，其包括以下步驟:令所述樣品接觸第一抗Augur in 抗體(或其抗原結(jié)合性片段或衍生物）和第二抗Augurin抗體(或其抗原結(jié)合性片段或衍生 物），以及檢測這些抗體與Augurin或其前體或片段的三元免疫復(fù)合物的存在。所述免疫復(fù) 合物形成于允許這些抗體與所述