瓜類細(xì)菌性果斑病免疫層析檢測試條的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測瓜類細(xì)菌性果斑病的器具，特別是涉及一種瓜類細(xì)菌性果斑病的免疫層析檢測試條。
【背景技術(shù)】
[0002]瓜類細(xì)菌性果斑病病原為嗜酸菌屬西瓜亞種(Acidovorax avenae subsp.citrulli)，病菌菌體短桿狀，革蘭氏染色陰性，不產(chǎn)生熒光，嚴(yán)格好氧，單根極生鞭毛；能在41°C下生長，不能在4°C下生長；在KB培養(yǎng)基上呈現(xiàn)乳白色、圓形、光滑、全緣、隆起、不透明菌落，菌落直徑I?2mm。該病菌引起煙草過敏反應(yīng)結(jié)果不一致，不產(chǎn)生精氨酸水解酶，明膠液化力弱，氧化酶和2 —酮葡糖酸試驗陽性。該病菌可附著在西、甜瓜種子表面，也可能侵入種子的內(nèi)部組織，存活于種皮下的胚乳表層，在種子中的存活時間長，抗逆能力強。帶菌種子為初次感染源，種子發(fā)芽后感染子葉和真葉，借助雨水、灌溉、田間操作使病菌自然接種到同株葉片或鄰近的植株上而傳播，幼果受感染后病斑不明顯，但到果實成熟前病斑迅速擴大而失去商品價值，對西、甜瓜生產(chǎn)造成難以挽回的損失。
[0003]瓜類細(xì)菌性果斑病為典型的種傳病害，從苗期到成株期均可發(fā)生，病果、病株、染病果皮及接觸帶菌果實的健康果實都會成為菌源，具有潛伏時期長、傳播快和不易識別等特點，對西、甜瓜的種植造成巨大的威脅?，F(xiàn)在該病已成為瓜類作物一種嚴(yán)重的世界性病害，在美國、澳大利亞、巴西、土耳其、泰國、以色列等國家和我國河北、山西、新疆、河南等多個省份和地區(qū)發(fā)生，因此我國也將細(xì)菌性果斑病定為檢疫對象，進口或引種時應(yīng)嚴(yán)格進行種子檢疫。國內(nèi)瓜類細(xì)菌性果斑病的檢測方法主要有血清學(xué)檢測和分子檢測，血清學(xué)檢測主要有ELISA法，其缺點是檢測精度低、假陽性高，分子檢測有免疫檢測、PCR法、熒光定量PCR等，其優(yōu)點是靈敏、準(zhǔn)確、快速，缺點是對實驗技術(shù)要求較高，對技術(shù)設(shè)備且需特定的儀器設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員。以上這些方法雖然有各自的優(yōu)點，但是也都存在著明顯的缺陷，很難在基層生產(chǎn)上推廣。因此，瓜類細(xì)菌果斑病檢測如何向快速、簡便、高效又能夠在基層廣泛使用成為了亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對上述問題，本發(fā)明提供了一種特異、快速、簡便的瓜類細(xì)菌性果斑病免疫層析檢測試條，該檢測試條應(yīng)用范圍廣，便于推廣應(yīng)用，能夠在基層地區(qū)廣泛使用。
[0005]為解決上述問題，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
設(shè)計一種瓜類細(xì)菌性果斑病的免疫層析檢測試條，包括置于最下層的支撐底板，提供整個產(chǎn)品骨架，依次連接設(shè)置于該支撐底板上的樣品緩沖層、覆載有標(biāo)記蛋白的承載層、包被吸附層和液體吸收層，且在所述包被吸附層上設(shè)有至少一條測試線和質(zhì)控線。
[0006]根據(jù)上述的免疫層析檢測試條，所述標(biāo)記蛋白為抗細(xì)菌果斑病單克隆抗體IgG，所述測試線對應(yīng)地由兔抗細(xì)菌果斑病多克隆抗體IgG制成；或者所述標(biāo)記蛋白為兔抗細(xì)菌果斑病多克隆抗體IgG，所述測試線對應(yīng)地由抗細(xì)菌果斑病單克隆抗體IgG制成。
[0007]根據(jù)上述的免疫層析檢測試條，所述測試線的制成方法如下:用生理鹽水將抗細(xì)菌性果斑病單克隆抗體IgG或兔抗細(xì)菌果斑病多克隆抗體IgG配制成0.5?10mg/mL的溶液，再用單向噴點儀將該溶液按照0.5?1.5PL/cm的用量噴射在包被吸附層上，形成測試線。
[0008]根據(jù)上述的免疫層析檢測試條，所述標(biāo)記蛋白采用量子點標(biāo)記法進行標(biāo)記，且用于量子點標(biāo)記的材料采用以下方法制備:選用Cd或Zn作為陽離子前驅(qū)體，Se或Te作為陰離子前驅(qū)體，以多官能團巰基小分子巰基乙酸、巰基丙酸、谷胱甘肽或半胱氨酸作為保護劑，通過加熱回流三者混合溶液使量子點逐漸成核并生長，即得。
[0009]根據(jù)上述的免疫層析檢測試條，所述標(biāo)記蛋白在承載層上覆載方法如下:將量子點標(biāo)記蛋白的重懸液用緩沖液稀釋2倍，然后用單向噴點儀將其按照3?15PL/cm的用量噴射在承載層上，且使其噴到承載層上后能擴散成2?8mm寬，然后45°C鼓風(fēng)干燥I小時后，即成；所述緩沖液含 100mmol/L ρΗ8.0 Tris_HCl、5wt% BSA、0.lwt% Triton X-100、5wt%鹿糖。
[0010]根據(jù)上述的免疫層析檢測試條，所述質(zhì)控線由抗種屬特異性二抗IgG制成。
[0011]根據(jù)上述的免疫層析檢測試條，所述質(zhì)控線經(jīng)由以下方法制成:用單向噴點儀將兔抗鼠或羊抗兔二抗蛋白按照0.5?1.5PL/cm的用量噴射在包被吸附層上形成對應(yīng)的質(zhì)控線。
[0012]根據(jù)上述的免疫層析檢測試條，所述支撐底板由不吸水的硬質(zhì)紙條或PVC材料制成，且其一面帶有膠水涂層；所述包被吸附層由硝酸纖維素膜、醋酸纖維素膜、混合纖維素膜、FUS1N 5、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；所述承載層由玻璃纖維膜、FUS1N 5或聚酯膜制成；所述液體吸收層由吸水紙、FUS1N 5或吸水纖維制成；所述樣品緩沖層由玻璃纖維膜、FUS1N 5或聚酯膜制成。
[0013]根據(jù)上述的免疫層析檢測試條，所述免疫層析檢測試條的外部還設(shè)有保護材料層，由塑料膠膜或成型塑料制成。
[0014]根據(jù)上述的免疫層析檢測試條，所述測試線和質(zhì)控線的組合排列為“ I I ”、“..”或“+”形式。
[0015]本發(fā)明的積極有益效果:
(I)結(jié)果直觀、可分級定量:本發(fā)明檢測試條以鮮艷的紅色或橙色(需在紫外光源激發(fā)下觀測)“ I I ”、“..”或“+”等形式的印跡線作為結(jié)果顯示，出現(xiàn)的檢測線強度在一定范圍內(nèi)與被測樣品中細(xì)菌性果斑病病原菌含量高低密切相關(guān)，結(jié)果判定直觀準(zhǔn)確。
[0016](2)操作簡便、快速:使用本發(fā)明檢測試條時無需任何其它試劑，只要將其插入用稀釋液稀釋好的待檢樣品中10秒左右，在10分鐘內(nèi)即可在紫外光源激發(fā)下觀測判定檢測結(jié)果。不需另配儀器設(shè)備及其它試劑，隨時隨地進行檢測，費用低廉，可節(jié)省大量貴重儀器及設(shè)備費用。
[0017](3)特異性強:本發(fā)明以量子點標(biāo)記細(xì)菌性果斑病單克隆抗體(或多克隆抗體)，測試線為細(xì)菌性果斑病多克隆抗體(或單克隆抗體)為基礎(chǔ)制備而成，因此就保證了該免疫層析檢測試條的反應(yīng)特異性。
[0018](4)應(yīng)用范圍廣，便于推廣應(yīng)用:本發(fā)明檢測試條操作簡單，不需要專業(yè)技術(shù)人員操作，按照使用說明人人可以操作，包括植物檢疫、種植合作社到個體種植等，具有廣闊的市場前景和較好的經(jīng)濟、社會效益。
【附圖說明】
[0019]圖1為本發(fā)明瓜類細(xì)菌性果斑病免疫層析檢測試條的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0020]圖2為本發(fā)明瓜類細(xì)菌性果斑病免疫層析檢測試條的俯視圖。
[0021]圖中，1:樣品緩沖層，2:包被吸附層，3:液體吸收層，4:支撐底板，5:承載層，6:質(zhì)控線，7:測試線。
【具體實施方式】
[0022]制備本發(fā)明瓜類細(xì)菌性果斑病免疫層析檢測試條，首先需制備量子點標(biāo)記的細(xì)菌性果斑病單克隆抗體IgG或多克隆抗體IgG，配合抗體測試線的細(xì)菌性果斑病多克隆抗體IgG或單克隆抗體IgG，從而制備蛋白標(biāo)記承載材料層和測試線及質(zhì)控線。
[0023]1.細(xì)菌性果斑病細(xì)菌的培養(yǎng)
細(xì)菌性果斑病Pslb-86菌株為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研宄所趙廷昌研宄員提供，菌株采樣地點為新疆(2003年6月)，寄主作物甜瓜，經(jīng)常規(guī)方法純化后置于取_80°C保存。
[0024]培養(yǎng)皿用報紙包起來，滅菌；取_80°C Pslb-86甘油菌株，將滅菌后的培養(yǎng)基倒入平板中，瓊脂凝固后，倒置；接種環(huán)在酒精燈的火焰上燒紅后，降溫，取一環(huán)菌，在平板上劃線；劃線后的平板，倒置放入培養(yǎng)箱中進行活化培養(yǎng)；經(jīng)LB固體平板37°C活化培養(yǎng)24?48h，接種于LB液體培養(yǎng)基中，于37° C震蕩培養(yǎng)18h，獲得菌液。
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