專利名稱：瓜類細菌性果斑病菌的padlock探針及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測瓜類細菌性果斑病菌(A^owmx"w"aesubsp.c//n////)的 padlock探針及其檢測方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。適用于口岸檢驗檢疫、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、 植物保護等部門使用。
(二)
背景技術(shù)：
瓜類細菌性果斑病是葫蘆科植物上的毀滅性細菌病害，自1989年，美國佛羅 里達洲、印第安納洲及特拉華洲發(fā)生該病害以來，該病不斷擴展蔓延至美國的15 個洲?，F(xiàn)主要分布在美國、澳大利亞、馬利亞納群島、印度尼西亞、土耳其等國 家(Langstone/fl/， 1999)。我國一些省份也有報道瓜類細菌性果斑病的發(fā)生和危害, 給果農(nóng)造成巨大損失。為了防止該病害危害和擴散蔓延，我國于2006年將其列入 全國農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物。
該病菌主要附著在種子和病株殘體上越冬，種子帶菌為主要侵染，病菌隨風、 雨水或灌溉侵入植株氣孔或受傷部位。受害果實病菌在其受害部位大量繁殖擴散 造成再侵染(SchaadN. W. e"/, 1978; Rane K. K. "a/， 1992)。在我國，瓜類細 菌性果斑病對哈密瓜生產(chǎn)及相關(guān)產(chǎn)業(yè)構(gòu)成極大的威脅。因此該病對我國哈密瓜產(chǎn) 業(yè)的威脅不容忽視，需要我們盡快拿出綜合防治方案，快速、準確地檢測病原物 是行之有效防治措施的基礎(chǔ)和前提。
傳統(tǒng)的檢測技術(shù)包括利用半選擇性培養(yǎng)基分離和鑒定病菌、免疫學檢測方法、 致病性測定及過敏反應(yīng)測定、生理生化反應(yīng)測試等。這些方法往往需耗費較長時 間并且靈敏度和準確性不高，因此常規(guī)的檢測方法難以適應(yīng)檢疫的需求。近年來， 采用PCR擴增病原菌的致病性基因、未知的DNA片段、質(zhì)粒DNA和rDNA轉(zhuǎn)錄間隔 區(qū)(ITS)等進行病原菌鑒定、檢測及病害診斷為國際上廣泛使用。目前已經(jīng)驗證 的傳統(tǒng)PCR檢測方法主要根據(jù)Walcott.R R,(2000)的報道，在瓜類細菌性果斑病菌 U".c) 16SrRNA設(shè)計了特異性引物WFB1和WFB2，但是這對引物用于Aac的特異 性不強，對類產(chǎn)堿假單孢桿菌和嗜酸菌屬的幾個種擴增結(jié)果均呈陽性。根據(jù)張祥 林(2007)對的16SrDNA序列設(shè)計的引物對BFB64/65，以此構(gòu)建的PCR檢測體系更靈敏、準確，對A"c的檢測靈敏度可達50CFU/pL。Walcott . RR.(2000)
在Afl.cl6S-23S ITS序列設(shè)計了特異性引物(SEQID4)和(SEQID5)。 Song W Y.
(2003)的報道，將配制的系列IO倍梯度菌懸液用特異引物對Aacf3 /Aacr2和探
針Aap2進行實時熒光PCR檢測。謝關(guān)林等(2006)采用將免疫學和經(jīng)典PCR結(jié)
合的免疫捕獲PCR( IC-PCR)技術(shù)對帶菌種子進行檢測。
Padlock探針(PLPs)是一種用于病原菌分子檢測的新方法。Padlock探針是一
條長度為100bp左右的單核苷酸探針(圖4-1)，包括磷酸化的5'端和羥基化的3'
端，這兩端能夠識別特定目標物的DNA序列(Nilsson W a/, 1994)，我們通常稱之
為Tl端和T2端。在Tl端和T2之間，存在著一段通用序列和一段特異序列，我
們稱之為P1、 P2端和ZipCode。在進行反應(yīng)時，首先將padlock探針和要檢測的
目標DNA進行連接，在TaqDNA連接酶的作用下，探針的Tl端和T2端通過和
特定的檢測靶標物的DNA序列互補而相結(jié)合，探針的5'端和3'端連成環(huán)狀。由
于r"《DNA連接酶的特性，只有DNA序列和探針的Tl端和T2端完全互補時，
探針才能形成環(huán)狀，否則，探針以線性存在。采用核酸外切酶去除沒有形成環(huán)狀
的探針和錯配的探針，然后采用所有探針的通用端Tl端和T2端的引物對切除后
的產(chǎn)物進行滾環(huán)擴增。然后將擴增后的產(chǎn)物與固定在膜上或者Microarray上的與
ZipCode序列互補的核酸序列進行雜交(Shoemaker ef a/， 1996)。通過膜上的地高辛
標記信號或者Microarray上的熒光來判斷檢測樣品中是否有特定的病原物。由于
padlock探針可與Macroarray或者Microarray技術(shù)相結(jié)合，因此能夠在檢測的過
程中實現(xiàn)高通量(HardenbolWa/,2003)。目前，padlock檢測探針因其靈敏度高、
特異性強的優(yōu)點多與基因芯片相結(jié)合應(yīng)用于病毒性疾病分子的檢測(BanerJ^
a/,2007)和單核苷酸突變檢測當中(Baner J Wa/， 2003)。目前尚未有將padlock探針
應(yīng)用于植物病原菌實際檢測的實例。 參考文獻
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發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題
本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)中瓜類細菌性果斑病菌的padlock檢測探針及 其檢測方法，意在避免常規(guī)的PCR檢測方法易受檢測樣品雜質(zhì)干擾、以及假陽性 的現(xiàn)象。對瓜類細菌性果斑病菌進行檢測，特異性強、靈敏度高。
技術(shù)方案
本發(fā)明的目的意在克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供快速、可靠、靈敏度高、 特異性強的檢測瓜類細菌性果斑病菌的padlock探針以及檢測方法。
實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案 用于檢測瓜類細菌性果斑病菌的padlock探針序列
探針的耙標識別序列(加下劃線的序列)取自待測病原菌16S-23S rDNA(ITS) 區(qū)域特異的核酸序列。探針中間P1P2 (CTCGACCGTTAGCAGCATGACCGAGAT
5GTACCGCTATCGT)為引物結(jié)合區(qū)。
Padlock探針是一種長寡核苷酸探針，其兩端的序列可通過核酸間的互補與 耙標DNA結(jié)合。通過和靶標DNA的雜交，padlock探針的兩端在連接酶的作用下 連成環(huán)狀，具有非常高的特異性。Padlock探針可與Macroarray技術(shù)結(jié)合進行多 重檢測。
Padlock探針檢測方法，包括如下步驟
(1 )探針的連接與外切酶處理。首先將padlock探針和待檢測的目標DNA進行 雜交，在TaqDNA連接酶的作用下，探針的兩端通過與特定的檢測耙標物的DNA 序列互補而相結(jié)合，探針的5'末端和3'末端連成環(huán)狀。采用核酸外切酶去除沒有 形成環(huán)狀的探針和錯配的探針。(2)探針的擴增。采用兩條探針P-a.a.c經(jīng)地高 辛標記的引物對連接產(chǎn)物進行擴增。利用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳。(3)Macroaary
檢測。將擴增后的產(chǎn)物與固定在膜上的與探針上的ZipCode序列互補的探針
(cZipcode探針)進行雜交。通過膜上的地高辛標記信號來判斷檢測樣品中是否 含有病原物。
有益效果采用上述技術(shù)方案，突出的技術(shù)進步在于-(1)本發(fā)明設(shè)計了適用于瓜類細菌性果斑病菌檢測的padlock探針。(2)本 發(fā)明利用padlock探針結(jié)合Macroaary技術(shù)，實現(xiàn)了對瓜類細菌性果斑病菌的檢測， 檢測方法可靠、靈敏度高、特異性強。(3)采用padlock探針作為分子檢測工具， 有效地避免傳統(tǒng)PCR檢測方法的假陽性現(xiàn)象。傳統(tǒng)的基于PCR擴增的分子檢測通 常只能檢測單種病原物，熒光定量PCR的出現(xiàn)在一定程度上解決了這一問題，通 過在反應(yīng)的體系中添加不同熒光染料，可以同時檢測1種以上的病原物。但是由于 熒光染料種類的限制和彼此之間的干擾，采用這種方法對多種病原物進行檢測時候 效果往往不好。采用padlock探針作為分子檢測工具，結(jié)合Macroaary技術(shù)彌補了實 時定量PCR檢測因受到引物設(shè)計問題、熒光染料的種類和熒光定量PCR儀光源是 單一光源等問題而不能同時檢測非常多的病原物的不足。 (四)說明書附圖


圖1. Padlock探針的結(jié)構(gòu)示意圖及檢測原理。 圖2A.瓜類細菌性果斑病菌特異性驗證結(jié)果。M為DNA Maker DL2000， 1~10為瓜類細菌性果斑病菌，11-21為其他細菌，22為 陰性對照。
圖2B.瓜類細菌性果斑病菌的靈敏度驗證結(jié)果。
M為DNA Maker DL2000， 1-6為病原菌DNA依次為10 ng 、 lng、 100pg、 10pg、 lpg、 100fg7為陰性對照。分別以十倍梯度稀釋的DNA為模板，利用padlock探針檢 測，最低可檢測到lpg。
圖3. Padlock探針結(jié)合Macroaary技術(shù)檢測瓜類細菌性果斑病菌結(jié)果。cZip control TATGGTCGGCAATTCCCTGC。
圖4.利用padlock探針對市售哈密瓜種子的檢測結(jié)果。
結(jié)果表明從市售6份的哈密瓜種子樣品中共檢測出4份帶有瓜類細菌性果斑 病菌。
具體實施方式
實施例1: 一種利用padlock探針的分子檢測方法，用于檢測瓜類細菌性果斑病菌。
用于檢測瓜類細菌性果斑病菌的padlock探針序列
(1)連接反應(yīng)液包括20mM Tris-HCL, pH 9.0, 25 mM KCH3COO， 10 mM Mg(CH3COO)2， 10 mM DTT， 1 mM NAD， 0.1% Triton X陽IOO， 2.4 U Taq DNA連接 酶，lpl待測模板，100pm探針P-a.a.c。連接的反應(yīng)程序為95'C預(yù)變性5分鐘; 然后進入循環(huán)，95'C變性30秒，65'C連接5分鐘，反應(yīng)共進行20個循環(huán)；然后 95'C滅活15分鐘。采用核酸外切酶切除自連和錯連的探針在連接后的產(chǎn)物中加 入2個單位的核酸外切酶I和2個單位的核酸外切酶ni， 37'C反應(yīng)2個小時，然 后將反應(yīng)后的產(chǎn)物95'C滅活3小時。
(2)采用引物P1-F (5'-CTCGACCGTTAGCAGCATGA-3，)P2-R(5'-CCGAGAT GTACCGCTATCGT-3，)對連接產(chǎn)物進行PCR擴增，反應(yīng)液包括0.5 pMPl-F和P2-R， 4禾中dNTP各50 pM， 2.5nI10xPCR反應(yīng)緩沖液，2mMMg2+， 2.5 pl 1% BSA， 1.25單位Taq酶(TaKaRa)， 3pl經(jīng)核酸外切酶處理后的連接產(chǎn)物。反應(yīng)程序為 94。C預(yù)變性5min;然后進入循環(huán)，94。C變性30sec， 60。C退火30sec， 72。C延伸
730sec，共35個循環(huán)；最后72。C延伸7 min。利用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行分 析檢測結(jié)果。
(3) Macroaary檢測。將l^L cZipcode探針點于尼龍膜上，每條cZipcode 探針重復(fù)4次，經(jīng)紫外交聯(lián)30s固定。將固定好的膜放入雜交管中，加入預(yù)雜交 液(0.02% SDS、 5xSSC、 50%去離子甲酰胺、0.1%N-laurysarosine、 50mmolL" 磷酸鈉、pH7.0 2。/。封閉劑)于雜交爐中42'C預(yù)雜交lh，棄預(yù)雜交液，將經(jīng)地高 辛標記的擴增產(chǎn)物沸水浴中變性10min，迅速移至冰上，5分鐘后加入預(yù)雜交液中， 42。C雜交過夜后，用大量2XSSC、 0.1% SDS室溫洗膜2次，每次5 min，再用 0.5XSSC、 0.1% SDS于68'C洗膜2次，每次15min。洗膜后把膜加入洗滌液 (0.1 mol'L"馬來酸、0.15mol丄"NaCl， pH7.5、 0.3%吐溫)中洗膜2min，棄 去，用封閉液(1%封閉劑、0.1 mol'L"馬來酸、0.15mol.L"NaCl， pH7.5)封閉 30min后，加入用封閉液稀釋了 5 000倍的Anti-DIG-AP，輕搖30 min。最后， 將結(jié)合完抗體的膜用洗滌液洗膜2次，每次15 min，加入檢測液(0.1moH/1 Tris-HCl、 0.1 mol.L"NaCl、 pH9.5)平衡3 min，再加入NBT/BCIP溶液，黑暗 中靜止顯色2h，待觀察到理想的顯色后，用無菌水浸泡10min終止反應(yīng)，進行 拍照。通過膜上的地高辛標記信號來判斷檢測樣品中是否含有病原物。
實例l從市售的哈密瓜種子中檢測瓜類細菌性果斑病菌
上述瓜類細菌性果斑病菌的padlock檢測探針及檢測方法檢測市售的哈密瓜
種子，包括
1)參照Walcott(2000)的方法將市售的哈密瓜種子的懸浮液作為模板。 2 )參照上述技術(shù)方案利用padlock檢測探針P-a.a.c結(jié)合Macroaary檢測樣品。檢 測結(jié)果見圖4。結(jié)果表明從市售6份的哈密瓜種子樣品中共檢測出4份帶有瓜 類細菌性果斑病菌。證明了上述技術(shù)方案能夠應(yīng)用于瓜類細菌性果斑病菌的 實際檢測。
權(quán)利要求
1、用于檢測瓜類細菌性果斑病菌的padlock探針序列P-a.a.cCGGCACGGTGCAGTTTCCTGCTTTCCGCPIP2CCTTACGCTAGGTCGAGAGTATTTTTGTCACCGG
2、權(quán)利要求padlock探針檢測方法，包括如下步驟 (1)探針的連接與外切酶處理。首先將padlock探針和待檢測的目標DNA進行 雜交，在TaqDNA連接酶的作用下，探針的兩端通過與特定的檢測耙標物的DNA 序列互補而相結(jié)合，探針的5'末端和3'末端連成環(huán)狀。采用核酸外切酶去除沒有 形成環(huán)狀的探針和錯配的探針。(2)探針的擴增。采用經(jīng)地高辛標記的引物對連接產(chǎn)物進行擴增。利用2.5%瓊脂糖凝膠電泳。(3) Macroaary多重檢測。將擴增后的產(chǎn)物與固定在膜上的與探針上的ZipCode序列互補的探針(cZipcode探針) 進行雜交。通過膜上的地高辛標記信號來判斷檢測樣品中是否含有病原物。
全文摘要
本發(fā)明用于檢測瓜類細菌性果斑病菌的padlock探針及其檢測方法屬于農(nóng)作物防病治病及植物檢疫范疇。用于檢測瓜類細菌性果斑病菌的padlock探針序列P-a.a.cCGGCACGGTGCAGTTTCCTGCTTTCCGCP_IP₂CCTTACGCTAGGTCGAGAGTATTTTTGTCACCGG。以此探針為基礎(chǔ)結(jié)合Macroaary技術(shù)的檢測方法具較強的特異性、靈敏性及穩(wěn)定性，為瓜類細菌性果斑病菌的檢測提供了快速、靈敏、特異的技術(shù)方法。圖為padlock探針檢測瓜類細菌性果斑病菌的檢測結(jié)果。
文檔編號C12N15/11GK101608234SQ20091003012
公開日2009年12月23日 申請日期2009年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月27日
發(fā)明者劉鳳權(quán), 王源超, 田艷麗, 胡白石, 鄭小波 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學