專利名稱：棉花纖維發(fā)育中兩個(gè)新的microRNA基因與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與陸地棉纖維發(fā)育相關(guān)的兩個(gè)未知miRNA (gAr-MflW和gA&M/及9)基因的克隆、鑒定和 用途。建立了野生型(WT)和無絨無絮纖維突變體(M)兩個(gè)小分子RNA文庫，采用了目前國際最先進(jìn) 的高通量測序列技術(shù)，獲得了上述兩個(gè)新的miRNA基因序列。進(jìn)一步分析了該miRNA的兩個(gè)耙基因，分 別編碼葉綠體omega 3-脂肪酸脫飽和酶和乙醇脫氫酶，兩者分別控制纖維的伸長發(fā)育及細(xì)胞壁的形成和加 厚。本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。若以該miRNA及其靶基因作為目的基因?qū)γ藁ㄟM(jìn)行深入的功能研究.在 一定程度上可有效地提高棉纖維的品質(zhì)，具有一定的經(jīng)濟(jì)及社會效益。
二背景技術(shù)：
MicroRNAs (miRNAs)是一類新發(fā)現(xiàn)的非編碼、長度約為21 nt的單鏈小分子RNA。近年來的大量研 究表明，miRNA在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育，細(xì)胞增值、脅迫響應(yīng)等過程中發(fā)揮著重要的作用。棉花是一種重 要的經(jīng)濟(jì)作物，其纖維是天然紡織材料的主要來源。我國是世界上最大的棉花生產(chǎn)和消費(fèi)國，也是一個(gè)重 要的棉花貿(mào)易國，因此，棉花作為經(jīng)濟(jì)作為在我國更是具有舉足輕重的地位 (http://www.emergingtextiles.com)。棉花纖維的發(fā)育機(jī)理成為備受關(guān)注的熱點(diǎn)，因?yàn)樗P(guān)系到如何提高棉 纖維產(chǎn)量(提髙單位面積棉纖維伸長的數(shù)量)，改良纖維品質(zhì)，而所有這些是與紡織工業(yè)和民生密切相關(guān) 的現(xiàn)實(shí)問題。
隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，國內(nèi)外除了利用常規(guī)育種手段外，逐步運(yùn)用基因工程技術(shù)對棉纖維 品質(zhì)進(jìn)行遺傳改良。利用基因工程改良纖維品質(zhì)依賴于對纖維發(fā)育相關(guān)基因及其調(diào)控元件的認(rèn)識。因此， 開展分離、鑒定與棉花纖維發(fā)育相關(guān)的功能基因是培育優(yōu)質(zhì)棉纖維新品種，實(shí)現(xiàn)育種理論和關(guān)鍵技術(shù)新突 破的重要基礎(chǔ)，也是提升我國棉花育種原始創(chuàng)新力的關(guān)鍵舉措。
2007年我們實(shí)驗(yàn)室率先在已有的棉花基因組中挖掘出了 37miRNA。這也是國內(nèi)外迄今為止從棉花植 物中發(fā)掘到最多的miRNA。這些重要的miRNA基因?qū)φ{(diào)控棉花生長及纖維發(fā)育具有重要的生物學(xué)意義及 潛在的生產(chǎn)開發(fā)價(jià)值。雖然目前已經(jīng)知道與棉纖維發(fā)育相關(guān)的基因有上千個(gè)，但對這些基因的表達(dá)機(jī)理及 網(wǎng)絡(luò)調(diào)控知之甚少。因此，迫切需要對我國已有的特色棉花資源，通過大規(guī)?？寺》椒ǔ浞滞诰蚝烷_發(fā)屬 于本國知識產(chǎn)權(quán)的新的miRNA (包括其它sRNA)基因，為后期定向改良和培育優(yōu)質(zhì)性狀的棉花種質(zhì)奠定 基礎(chǔ)。
本專利所克隆到的兩個(gè)新的miRNA來自于陸地棉品種，而且只在突變體中表達(dá)，表明在野生型中這 兩個(gè)miRNA不表達(dá)，因此它們不會對葉綠體co-3-脂肪酸脫飽和酶和乙醇脫氫酶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA進(jìn) 行轉(zhuǎn)錄后的切割抑制。o-3-脂肪酸脫飽和酶在植物中催化脂肪酸脫飽和生成二烯脂肪酸，后者對維持細(xì)胞 膜的功能起著重要的作用。更重要的是三烯脂肪酸是茉莉酸合成的前體，而茉莉酸對細(xì)胞壁的形成有調(diào)節(jié) 作用。乙醇脫氫酶在細(xì)胞壁中以眾多的代謝物為底物催化木質(zhì)素的鉸鏈，形成細(xì)胞壁的成分。因此，兩者 可能對纖維細(xì)胞壁的合成有著重要的影響。
事實(shí)上，脂肪酸脫飽和酶和乙醇脫氫酶是多功能酶，這兩種酶參與植物對冷害脅迫反應(yīng)的調(diào)節(jié)，基因突變導(dǎo)致植物對冷脅迫的高度敏感。兩者可能在棉花植物開花吐絲后期由于氣溫較低調(diào)節(jié)棉纖維的生伸發(fā) 育。但是上述兩個(gè)靶基因在調(diào)節(jié)棉花纖維合成中的具體功能還不清楚。因此，通過研究miRNA的調(diào)節(jié)功 能系統(tǒng)研究脂肪酸脫飽和酶和乙醇脫氫酶在棉花纖維發(fā)育中的作用具有重要的生物學(xué)意義和潛在應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的是克隆陸地棉纖維發(fā)育過程中兩個(gè)重要的miRNA (g/w-Affl 和g/zr-AfflWO， 分析和鑒定了二級結(jié)構(gòu)，同時(shí)分析得到了兩個(gè)靶基因，葉綠體0)-3-脂肪酸脫飽和酶和乙醇脫氫酶基因，分 析表明它們參與了棉纖維發(fā)育過程中細(xì)胞壁的合成。以此基因?yàn)榛A(chǔ)，通過基因工程的方法改變目前棉纖 維的品質(zhì)特性，獲得一定的經(jīng)濟(jì)及社會效益，為棉花的品質(zhì)育種提供基因資源，盡快提高我國棉花品種的 纖維品質(zhì)。
技術(shù)方案
陸地棉/^-g/^-M/i (基因表達(dá)前體)，長度為205bp ，序列如下:
陸地棉;^-g/^-M/卵(基因表達(dá)前體)，長度為296bp ，序列如下:
AATGAATCAAAAGAGAAGAAA
1. 按照IUumina Sample Preparation Protocol文庫構(gòu)建方法，構(gòu)建了陸地棉Xuzhou-142( WT)和Xuzhou-142 光籽突變體(M)開花后(0， 1， 2, 3, 4， 5， 6， 8， 10天，DPA)胚珠cDNA兩個(gè)文庫。
2. 從文庫中挑取克隆，進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將分析得到的高質(zhì)量的長度為18-30 nt的RNA進(jìn)行高通量測序。根據(jù) 測序結(jié)果，進(jìn)一步進(jìn)行BLAST比對分析，篩選符合miRNA標(biāo)準(zhǔn)的序列。生物信息學(xué)預(yù)測其靶基因。
有益效果
1. 目前常用的mRNA克隆分析技術(shù)效率低、不靈敏，有些表達(dá)豐度低的小分子RNA根本測不出來。 本研究采用目前國際上最先進(jìn)的大規(guī)模高通量測序，其優(yōu)點(diǎn)為
(1) 靈敏度高，準(zhǔn)確性高，能夠測出一個(gè)小分子RNA，測定的RNA分子的堿基準(zhǔn)確率高；
(2) 高通量、規(guī)模大，能夠測定所有基因組的轉(zhuǎn)錄子。兩個(gè)文庫的測序量高達(dá)到130萬條堿基序列 以上，包涵所有的小分子RNA序列；
(3) 同時(shí)測定小分子RNA的表達(dá)豐度，因此可以比較兩個(gè)基因文庫中小分子RNA表達(dá)譜的差異。
2. 本發(fā)明所克隆到的兩個(gè)miRNA (g/w-M/iW和g/w-M/i 0分別調(diào)控葉綠體co-3-脂肪酸脫飽和酶和 乙醇脫氫酶的耙基因，后者有研究表明參與細(xì)胞壁的合成，即與細(xì)胞壁的加厚有關(guān)，而細(xì)胞壁的此基因作為靶基因，對棉花進(jìn)行轉(zhuǎn)化理論上可直接有效地提高 其強(qiáng)度，打破產(chǎn)量品質(zhì)的負(fù)相關(guān)，獲得優(yōu)質(zhì)棉花，帶來可觀的經(jīng)濟(jì)社會效益。
3. 目前轉(zhuǎn)基因的外源基因大部分來源于微生物，這類轉(zhuǎn)基因作物對安全性評價(jià)要求嚴(yán)格。本專利報(bào) 道的基因來源于棉花，再導(dǎo)入棉花不存在安全性評價(jià)問題。同時(shí)，與棉纖維發(fā)育相關(guān)的miRNA 基因目前在國內(nèi)外申請的專利甚少。
4. 通過該基因的功能預(yù)測和分析，表明上述兩個(gè)靶基因參與棉纖維發(fā)育進(jìn)程，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將 該基因?qū)朊藁?，使其過量表達(dá)，獲得的轉(zhuǎn)基因植株將在棉纖維伸長或和加厚期大量表達(dá)，獲得 一定的經(jīng)濟(jì)及社會效益，為棉花的品質(zhì)育種提供基因資源，盡快提髙我國棉花品種的纖維品質(zhì)。
四

圖l.g^-Affi^和ghr-MJi 9前體二級結(jié)構(gòu)圖。miRNA從無絨無絮纖維突變體中克隆得到，并具有較 高的相對表達(dá)豐度。結(jié)構(gòu)鑒定表明成熟miRNA片斷位于5'端(紅字黑線部分)。
五、 發(fā)明的具體實(shí)施例
1. 棉花胚珠采集棉花種植地為江蘇省農(nóng)科院試驗(yàn)田，開花期進(jìn)行掛牌。胚珠釆集后立即液氮冷凍，-80°C
冰箱保存，備用。
2. 按照Illumina Sample Preparation Protocol文庫構(gòu)建方法，構(gòu)建了陸地棉Xuzhou-142( WT)禾卩Xuzhou-142 光籽突變體(M)開花后0， 1， 2， 3, 4, 5， 6， 8， 10天(DPA)胚珠混合cDNA兩個(gè)文庫。
3. 從文庫中挑取克隆，進(jìn)行分離鑒定，將分析得到的高質(zhì)量的長度為18-30 nt的RNA進(jìn)行高通量測序。 根據(jù)測序結(jié)果，進(jìn)一步進(jìn)行BLAST比對分析，篩選符合miRNA標(biāo)準(zhǔn)的序列。生物信息學(xué)預(yù)測其耙基 因。
5SEQUENCE LISTING
<110>南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120>棉花纖維發(fā)育中兩個(gè)新的microRNA基因與用途 <130>說明書
<160> 2
<170> Patentln version 3.1
<210> 1
<211> 205
<212> DNA
<213> Gossypium hirsutum <220>
<221> ghr-MIR3前體基因
<222> (1)..(205) <223><400> 1
aactaatcct tgtacattag atcaaagagc aaacttatca tttctattaa aaactaacgt 60
gattgatgga ttaaccagac agttacacgt agcgtgccac atgtatctca tttgagaggt 120
aggcacaagt ttttagcaat agaaatagat gggatttcaa cagaaggacc aatttgctct 180 ttgatctagt atacaatgac taatt
205
<210>. 2 <211> 296 <212> DNA
<213> Gossypium hirsutum
<220>
<221> ghr-MIR9前體基因
<222> (1)"(296) <223>
<400> 2
ttcttctctt tagattcatt ggctgagtta aaacagcagc acaaatttcg gggtcaagaa 60
ttttatatgc. aggtgaaaaa accactttta acttaaaaat attctttttc cgeaaaaata 120 ccggaaaacg ctagtgtttt aaagttaaat atgcgattaa aaaaaccttt ctacccaaat 180 attgagaagt tggttaaaag aattttaaac tcgacatcga gtcaaagtca tcgagtttaa 240 gacctaaaac caaatatctg aatattaact cagctaatga atcaaaagag aagaaa 29權(quán)利要求
1.兩個(gè)新發(fā)現(xiàn)的miRNA基因(ghr-MIR3和ghr-MIR9)的成熟片斷分別為21和22堿基(表1)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l，這兩個(gè)miRNA基因只在突變體(M)中表達(dá)，而在野生型(WT)中不表達(dá)(表2)， 表明這兩個(gè)miRNA基因.對纖維發(fā)育功能有著不可缺少的作用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l，通過生物信息學(xué)預(yù)測到12個(gè)靶基因(表3)。表l.陸地棉(GoMj^MH7feVTOtom)新發(fā)現(xiàn)的miRNA成熟片斷。M:突變體__Precursor Library_5p成熟片斷(5'-3)_g/w-M/i 3 DR459348 M TGTACATTAGATCAAAGAGCAA(22) g/w-M/i 9 TA40540 M TAGATTCATTGGCTGAGTTAA (21)表2.陸地棉(GomwZww fe'rawtow)新的miRNA及表達(dá)豐度(Reads)。 5p禾B 3p分別指成熟miRNA在 5鄰3'端。WT:野生型IDLibrary5p Reads3p Reads表達(dá)(相對于WT)M010 上調(diào)M120 上調(diào)表3. 和g/zr-Affl^的耙基因miRNAGene ID耙基因Ghr-MIR3DT455847葉綠體omega 3-脂肪酸脫飽和酶Chloroplast omega 3 fatty acid desaturaseGhr-MIR9TA20488乙醇脫氫酶TA20490Putative alcohol dehydrogenaseTA20491TA20492TA20493TA20494TA20495CD485586CD485902CD486113DN803191全文摘要
MicroRNAs(miRNAs)是一類新發(fā)現(xiàn)的非編碼長度約為21nt的內(nèi)源小分子RNA。它們可以與其特定的靶基因mRNA互補(bǔ)結(jié)合，通過引起靶基因的降解或翻譯抑制來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。本發(fā)明建立了棉花野生型(Xuzhou-142)及其無絨無絮纖維突變體(光籽，Xuzhou 142 fuzzless-lintless)胚珠兩個(gè)小分子RNA文庫，采用了目前國際最先進(jìn)的高通量測序技術(shù)(Solexa)，獲得了2個(gè)未知的miRNAs基因，暫時(shí)命名為ghr-MIR3和ghr-MIR9，并研究其在棉花纖維初始發(fā)育過程中的不同表達(dá)豐度。通過生物信息學(xué)預(yù)測到了12個(gè)靶基因，其中g(shù)hr-MIR3靶基因編碼葉綠體omega 3-脂肪酸脫飽和酶(omega 3-fatty acid desaturase)，而ghr-MIR9靶基因編碼乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase)。上述研究結(jié)果迄今為止尚未見有報(bào)道，通過基因工程手段與方法為深入研究調(diào)控棉纖維生長發(fā)育和改良纖維品質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/11GK101565701SQ200910029480
公開日2009年10月28日 申請日期2009年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月14日 公開號200910029480.發(fā)明者楊志敏, 王芹芹, 陳旭升 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 被以下專利引用 (1),