專利名稱：一種梅花型瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)方法及打孔裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種免疫擴(kuò)散試驗(yàn)，具體地說是一種梅花型瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)方法及
打孔裝置。
背景技術(shù)：
可溶性抗原與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合，兩者比例適當(dāng)并有電解質(zhì)存在及一定的溫度
條件下，經(jīng)一定的時(shí)間，可形成肉眼可見的沉淀物，稱為沉淀反應(yīng)。沉淀反應(yīng)的抗原可以是
多糖、蛋白質(zhì)、類脂等，與相應(yīng)的抗體相比，抗原分子小(< 20pm)，單位體積內(nèi)所含抗原量
多，具有較大的反應(yīng)面積。為了使抗原抗體之間比例適合，不使抗原過剩，故一般均應(yīng)稀釋
抗原，并以抗原最高稀釋度仍能與抗體出現(xiàn)沉淀反應(yīng)為該抗體的沉淀反應(yīng)效價(jià)(滴度)。 免疫擴(kuò)散法就是使抗原與抗體在瓊脂糖凝膠中自由擴(kuò)散而相遇，從而形成抗原抗
體復(fù)合物，由于此復(fù)合物分子量增大并產(chǎn)生聚集，不再繼續(xù)擴(kuò)散而形成肉眼可見的帶狀或
線狀沉淀帶。抗原抗體復(fù)合物的沉淀帶是一種特異性的半滲透性屏障，它可以阻止免疫學(xué)
性質(zhì)與其相似的抗原抗體分子通過，而允許那些性質(zhì)不相似的分子繼續(xù)擴(kuò)散，這樣由不同
抗原或不同抗體所形成的沉淀帶各有各的位置，從而可以分離和鑒定混合系統(tǒng)。 利用瓊脂凝膠作為擴(kuò)散介質(zhì)是因?yàn)橐欢舛鹊沫傊z，其內(nèi)部為多孔網(wǎng)狀。而
且孔徑很大，可以允許大分子物質(zhì)(分子量自十幾萬到幾百萬以上)自由通過。因?yàn)榇蠖?br> 數(shù)抗原和抗體的分子量都在20萬以上，所以它們在瓊脂凝膠中幾乎可以自由擴(kuò)散。而且瓊
脂糖凝膠又具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性、含水量大、透明度好、來源方便、處理容易等優(yōu)點(diǎn)，因此
是免疫沉淀檢測技術(shù)中最理想的擴(kuò)散介質(zhì)。 現(xiàn)有的瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)，操作過程復(fù)雜，而且需要在瓊脂凝膠上一個(gè)一個(gè)地打 出梅花型孔，效率很低且容易使孔型不規(guī)則、邊緣開裂。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對上述現(xiàn)有技術(shù)現(xiàn)狀，而提供一種梅花型瓊脂免 疫擴(kuò)散試驗(yàn)方法及打孔裝置。 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為一種梅花型瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)方 法，包括以下步驟 (1)、以重量份數(shù)計(jì)，稱取8至15份的瓊脂粉，加入1000份重量濃度為1 %的生理 鹽水或緩沖液，將混合液經(jīng)水浴煮沸20分鐘融化； (2)、將融化的瓊脂溶液倒入平皿內(nèi)，保持溶液厚度為2mm至3mm，自然冷卻；
(3)、使用打孔裝置在冷卻后的瓊脂凝膠上打孔，所述的打孔裝置包括至少五個(gè)排 列成梅花型的打孔管和一個(gè)中心打孔管；打孔管和中心打孔管分別制有用于吸附瓊脂的負(fù) 壓腔，在負(fù)壓腔內(nèi)固定有螺旋針；負(fù)壓腔的下端制有開口，打孔管的側(cè)壁和中心打孔管的側(cè) 壁在開口處制有斜邊刀刃；各個(gè)打孔管通過中空的橫管與中心打孔管固定連接，在中心打 孔管上端設(shè)置有橡膠負(fù)壓囊，各個(gè)打孔管的負(fù)壓腔與橡膠負(fù)壓囊相連通；打孔時(shí)先擠壓橡膠負(fù)壓囊，將打孔裝置垂直于瓊脂平面，使打孔管和中心打孔管的斜邊刀刃平整切入瓊脂 凝膠，然后松開橡膠負(fù)壓囊，使孔內(nèi)的瓊脂吸附在負(fù)壓腔內(nèi)；
(4)、取出打孔裝置，挑出負(fù)壓腔內(nèi)的瓊脂； (5)、將平皿在火焰上緩緩加熱，使孔底邊緣的瓊脂少許熔化，密封孔底，以免加樣 后液體從孔底滲漏； (6)、以毛細(xì)滴管吸取樣品加入瓊脂孔內(nèi)，加滿且不溢出； (7)、蓋上平皿蓋，將平皿翻過來，置于濕盤中，在37°CT自由擴(kuò)散24小時(shí)至48小時(shí)。 為優(yōu)化上述技術(shù)方案，采取的措施還包括
上述步驟(1)中瓊脂粉的重量份數(shù)優(yōu)選為10份。 在上述的生理鹽水或緩沖液中，可加入重量份數(shù)為0. 1份的硫柳汞或疊氮鈉用以 防腐。 上述螺旋針的下端與打孔管下端或中心打孔管下端的斜邊刀刃平齊。 上述的打孔管為六個(gè)，均勻分布在中心打孔管的周圍，在上述步驟(3)中，打孔裝
置在瓊脂凝膠上打出相應(yīng)的梅花型孔。 本發(fā)明的一種梅花型瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)打孔裝置，包括至少五個(gè)排列成梅花型的 打孔管和一個(gè)中心打孔管；打孔管和中心打孔管分別制有用于吸附瓊脂的負(fù)壓腔，在負(fù)壓 腔內(nèi)固定有螺旋針；負(fù)壓腔的下端制有開口，打孔管的側(cè)壁和中心打孔管的側(cè)壁在開口處 制有斜邊刀刃；各個(gè)打孔管通過中空的橫管與中心打孔管固定連接，在中心打孔管上端設(shè) 置有橡膠負(fù)壓囊，各個(gè)打孔管的負(fù)壓腔與橡膠負(fù)壓囊相連通。
為優(yōu)化上述技術(shù)方案，采取的措施還包括 上述的螺旋針上端與打孔管上端或中心打孔管上端固定連接，螺旋針的下端與打 孔管下端或中心打孔管下端的斜邊刀刃平齊。 上述的打孔管為圓柱形管，上端封閉，下端沿制有上述的斜邊刀刃；所述的橫管與 打孔管的側(cè)壁相連接，負(fù)壓腔與橫管相連通。 上述的中心打孔管為圓柱形管，上端邊沿與橡膠負(fù)壓囊的下端邊沿密封連接，下 端沿制有上述的斜邊刀刃，各個(gè)打孔管通過橫管與中心打孔管的側(cè)壁相連接，所述的橫管 與橡膠負(fù)壓囊相連通。 在上述的中心打孔管周圍均勻排列有五至七個(gè)打孔管。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的梅花型瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)方法操作簡單，效率高，而且 使用梅花型瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)打孔裝置，可以一次性在瓊脂凝膠上打出梅花型孔，并且梅 花型孔形狀規(guī)則，不易產(chǎn)生邊緣開裂。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例的俯視結(jié)構(gòu)示意圖；
圖2是本發(fā)明實(shí)施例的仰視結(jié)構(gòu)示意圖；
圖3是圖1的A-A向剖視結(jié)構(gòu)示意圖；
圖4是打孔裝置進(jìn)行打孔的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的實(shí)施例作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
圖1至圖4所示為本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖。 其中的附圖標(biāo)記為打孔管1、螺旋針2、橫管3、中心打孔管4、橡膠負(fù)壓囊5、瓊脂 凝膠6、平皿7、負(fù)壓腔8、開口 9、斜邊刀刃10。 本實(shí)施例的一種梅花型瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)方法，包括以下步驟
1、以重量份數(shù)計(jì)，稱取8至15份的瓊脂粉，加入1000份重量濃度為1 %的生理鹽 水或緩沖液，將混合液經(jīng)水浴煮沸20分鐘融化；本步驟中瓊脂粉的重量份數(shù)優(yōu)選為10份， 在所述的生理鹽水或緩沖液中，也可加入重量份數(shù)為0. 1份的硫柳汞或疊氮鈉用以防腐。
2、將融化的瓊脂溶液倒入平皿7內(nèi)，保持溶液厚度為2mm至3mm，自然冷卻凝固；
3、使用打孔裝置在冷卻后的瓊脂凝膠6上打孔，所述的打孔裝置包括六個(gè)排列成 梅花型的打孔管1和一個(gè)中心打孔管4 ;打孔管1和中心打孔管4分別制有用于吸附瓊脂 的負(fù)壓腔8，在負(fù)壓腔8內(nèi)固定有螺旋針2 ;負(fù)壓腔8的下端制有開口 9，打孔管1的側(cè)壁和 中心打孔管4的側(cè)壁在開口 9處制有斜邊刀刃10 ;各個(gè)打孔管1通過中空的橫管3與中心 打孔管4固定連接，在中心打孔管4上端設(shè)置有橡膠負(fù)壓囊5，各個(gè)打孔管1的負(fù)壓腔8與 橡膠負(fù)壓囊5相連通；打孔時(shí)先擠壓橡膠負(fù)壓囊5，將打孔裝置垂直于瓊脂平面，使打孔管 1和中心打孔管4的斜邊刀刃10平整切入瓊脂凝膠6，然后松開橡膠負(fù)壓囊5，使孔內(nèi)的瓊 脂吸附在負(fù)壓腔8內(nèi)，在瓊脂凝膠6上打上梅花型孔； 4、取出打孔裝置及吸附在負(fù)壓腔8內(nèi)的瓊脂，挑出負(fù)壓腔8內(nèi)的瓊脂； 5、將平皿7在火焰上緩緩加熱，使瓊脂凝膠6上梅花型孔底邊緣的瓊脂少許熔化，
密封孔底，以免加樣后液體從孔底滲漏； 6、以毛細(xì)滴管吸取樣品加入瓊脂孔內(nèi)，注意不要產(chǎn)生氣泡，加滿且不溢出；加少 了，影響反應(yīng)程度，加多了，易溢出，也影響反應(yīng)結(jié)果； 7、蓋上平皿7蓋，將平皿7翻過來，置于濕盤中，在37"下自由擴(kuò)散24小時(shí)至48 小時(shí)。 本實(shí)施例的梅花型瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)方法用以檢測抗原或比較抗原差異時(shí)，將抗 血清置中心孔，將待測抗原或需比較的抗原置于周圍相鄰？L。若出現(xiàn)沉淀帶完全融合，證明 為同種抗原；若二者有部分相連，表明二者有共同抗原決定簇；若二條沉淀線相互交叉，說 明二者抗原完全不同。 中間孔含A， B， C三種抗血清，A、B和A、C為不同型的抗原呈雙線或交叉，B、 C為 同一血清型的不同亞型部分融合，有交叉。 本實(shí)施例的梅花型瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)方法用做血清流行病學(xué)調(diào)查時(shí)，將標(biāo)準(zhǔn)抗原 置瓊脂凝膠6的中心孔，周圍相間隔的三個(gè)孔加標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，另外相間隔的三個(gè)孔分別 加待檢血清。待檢孔與陽性孔出現(xiàn)的沉淀帶完全融合者判為陽性。待檢血清無沉淀帶或所 出現(xiàn)的沉淀帶與陽性對照的沉淀帶完全交叉者判為陰性。待檢孔雖未出現(xiàn)沉淀帶，但兩陽 性孔的沉淀帶在接近待檢孔時(shí)，兩端均內(nèi)向有所彎曲者判弱陽性。若僅一端有所彎曲，另一 端仍為直線者，判為可疑，需重檢。重檢時(shí)，可加大檢樣的量。 檢樣孔無沉淀帶，但兩側(cè)陽性孔的沉淀帶在接近檢樣孔時(shí)變得模糊、消失，可能為 待檢血清中抗體濃度過大，致使沉淀帶溶解，可將樣品稀釋后重檢。
6
用以檢測的抗血清的效價(jià)時(shí)，將抗原置中心孔，抗血清倍比稀釋后置周圍孔，以出 現(xiàn)沉淀帶的血清最高稀釋倍數(shù)為該抗血清的瓊擴(kuò)效價(jià)。 在試驗(yàn)中不規(guī)則的沉淀線可能是加樣過滿溢出、瓊脂凝膠6上孔型不規(guī)則、邊緣 開裂、孔底滲漏、孵育時(shí)沒放水平、擴(kuò)散時(shí)瓊脂變干燥、溫度過高蛋白質(zhì)變性或未加防腐劑 導(dǎo)致細(xì)菌污染等所致。 抗原抗體的比例與沉淀帶的位置、清晰度有關(guān)。如抗原過多，沉淀帶向抗體孔偏移 和增厚，反之亦然。可用不同稀釋度的反應(yīng)液試驗(yàn)后調(diào)節(jié)。 本發(fā)明的一種梅花型瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)打孔裝置，如圖1至3所示，包括至少五個(gè) 排列成梅花型的打孔管1和一個(gè)中心打孔管4 ;打孔管1和中心打孔管4分別制有用于吸 附瓊脂的負(fù)壓腔8，在負(fù)壓腔8內(nèi)固定有螺旋針2 ;負(fù)壓腔8的下端制有開口 9，打孔管1的 側(cè)壁和中心打孔管4的側(cè)壁在開口 9處制有斜邊刀刃10 ;各個(gè)打孔管1通過中空的橫管3 與中心打孔管4固定連接，在中心打孔管4上端設(shè)置有橡膠負(fù)壓囊5，各個(gè)打孔管1的負(fù)壓 腔8與橡膠負(fù)壓囊5相連通。 在本實(shí)施例中，中心打孔管4周圍均勻排列有六個(gè)打孔管l，成梅花型排列，使用 本實(shí)施例的打孔裝置時(shí)，在瓊脂凝膠6上打出相應(yīng)的梅花型孔。 打孔管1為圓柱形管，上端封閉，下端沿制有所述的斜邊刀刃10 ;所述的橫管3與 打孔管1的側(cè)壁相連接，負(fù)壓腔8與橫管3相連通。 中心打孔管4為圓柱形管，上端邊沿與橡膠負(fù)壓囊5的下端邊沿密封連接，下端沿 制有所述的斜邊刀刃10，各個(gè)打孔管1通過橫管3與中心打孔管4的側(cè)壁相連接，所述的橫 管3與橡膠負(fù)壓囊5相連通。 螺旋針2上端與打孔管1上端或中心打孔管4上端固定連接，螺旋針2的下端與
打孔管1下端或中心打孔管4下端的斜邊刀刃10平齊。在打孔裝置平整切入瓊脂凝膠6
時(shí)，螺旋針2的下端穿入瓊脂凝膠6，防止瓊脂凝膠6從負(fù)壓腔8中脫落。 本發(fā)明的最佳實(shí)施例已闡明，由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員做出的各種變化或改型都不
會脫離本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
一種梅花型瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)方法，其特征是包括以下步驟(1)、以重量份數(shù)計(jì)，稱取8至15份的瓊脂粉，加入1000份重量濃度為1％的生理鹽水或緩沖液，將混合液經(jīng)水浴煮沸20分鐘融化；(2)、將融化的瓊脂溶液倒入平皿(7)內(nèi)，保持溶液厚度為2mm至3mm，自然冷卻；(3)、使用打孔裝置在冷卻后的瓊脂凝膠(6)上打孔，所述的打孔裝置包括至少五個(gè)排列成梅花型的打孔管(1)和一個(gè)中心打孔管(4)；打孔管(1)和中心打孔管(4)分別制有用于吸附瓊脂的負(fù)壓腔(8)，在負(fù)壓腔(8)內(nèi)固定有螺旋針(2)；負(fù)壓腔(8)的下端制有開口(9)，打孔管(1)的側(cè)壁和中心打孔管(4)的側(cè)壁在開口(9)處制有斜邊刀刃(10)；各個(gè)打孔管(1)通過中空的橫管(3)與中心打孔管(4)固定連接，在中心打孔管(4)上端設(shè)置有橡膠負(fù)壓囊(5)，各個(gè)打孔管(1)的負(fù)壓腔(8)與橡膠負(fù)壓囊(5)相連通；打孔時(shí)先擠壓橡膠負(fù)壓囊(5)，將打孔裝置垂直于瓊脂平面，使打孔管(1)和中心打孔管(4)的斜邊刀刃(10)平整切入瓊脂凝膠(6)，然后松開橡膠負(fù)壓囊(5)，使孔內(nèi)的瓊脂吸附在負(fù)壓腔(8)內(nèi)；(4)、取出打孔裝置，挑出負(fù)壓腔(8)內(nèi)的瓊脂；(5)、將平皿(7)在火焰上緩緩加熱，使孔底邊緣的瓊脂少許熔化，密封孔底，以免加樣后液體從孔底滲漏；(6)、以毛細(xì)滴管吸取樣品加入瓊脂孔內(nèi)，加滿且不溢出；(7)、蓋上平皿(7)蓋，將平皿(7)翻過來，置于濕盤中，在37℃下自由擴(kuò)散24小時(shí)至48小時(shí)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種梅花型瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)方法，其特征是所述步驟(1) 中瓊脂粉的重量份數(shù)為10份。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種梅花型瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)方法，其特征是在所述的生 理鹽水或緩沖液中，加入重量份數(shù)為0. 1份的硫柳汞或疊氮鈉。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種梅花型瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)方法，其特征是所述螺旋針(2)的下端與打孔管(1)下端或中心打孔管(4)下端的斜邊刀刃平齊。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種梅花型瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)方法，其特征是所述的打孔管(1)為六個(gè)，均勻分布在中心打孔管(4)的周圍，在所述的步驟(3)中，打孔裝置在瓊脂 凝膠(6)上打出相應(yīng)的梅花型孔。
6. —種梅花型瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)打孔裝置，其特征是包括至少五個(gè)排列成梅花型的 打孔管(1)和一個(gè)中心打孔管(4);打孔管(1)和中心打孔管(4)分別制有用于吸附瓊脂的負(fù)壓腔(8)，在負(fù)壓腔(8)內(nèi)固定有螺旋針(2);負(fù)壓腔(8)的下端制有開口 (9)，打孔管 (1)的側(cè)壁和中心打孔管(4)的側(cè)壁在開口 (9)處制有斜邊刀刃(10);各個(gè)打孔管(1)通 過中空的橫管(3)與中心打孔管(4)固定連接，在中心打孔管(4)上端設(shè)置有橡膠負(fù)壓囊 (5)，各個(gè)打孔管(1)的負(fù)壓腔(8)與橡膠負(fù)壓囊(5)相連通。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種梅花型瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)打孔裝置，其特征是所述的 螺旋針(2)上端與打孔管(1)上端或中心打孔管(4)上端固定連接，螺旋針(2)的下端與 打孔管(1)下端或中心打孔管(4)下端的斜邊刀刃(10)平齊。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種梅花型瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)打孔裝置，其特征是所述的打孔管(1)為圓柱形管，上端封閉，下端沿制有所述的斜邊刀刃(10);所述的橫管(3)與打孔管(1)的側(cè)壁相連接，負(fù)壓腔(8)與橫管(3)相連通。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種梅花型瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)打孔裝置，其特征是所述的 中心打孔管(4)為圓柱形管，上端邊沿與橡膠負(fù)壓囊(5)的下端邊沿密封連接，下端沿制有 所述的斜邊刀刃(IO)，各個(gè)打孔管(1)通過橫管(3)與中心打孔管(4)的側(cè)壁相連接，所述 的橫管(3)與橡膠負(fù)壓囊(5)相連通。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種梅花型瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)打孔裝置，其特征是在所述 的中心打孔管(4)周圍均勻排列有五至七個(gè)打孔管(1)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種梅花型瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)方法及打孔裝置，包括至少五個(gè)排列成梅花型的打孔管和一個(gè)中心打孔管；打孔管和中心打孔管分別制有用于吸附瓊脂的負(fù)壓腔，在負(fù)壓腔內(nèi)固定有螺旋針；負(fù)壓腔的下端制有開口，打孔管的側(cè)壁和中心打孔管的側(cè)壁在開口處制有斜邊刀刃；各個(gè)打孔管通過中空的橫管與中心打孔管固定連接，在中心打孔管上端設(shè)置有橡膠負(fù)壓囊，各個(gè)打孔管的負(fù)壓腔與橡膠負(fù)壓囊相連通。本發(fā)明操作簡單，效率高，而且使用梅花型瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)打孔裝置，可以一次性在瓊脂凝膠上打出梅花型孔，并且梅花型孔形狀規(guī)則，不易產(chǎn)生邊緣開裂。
文檔編號G01N33/559GK101793896SQ201010127238
公開日2010年8月4日 申請日期2010年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月18日
發(fā)明者張疆 申請人:張疆