專利名稱：馬傳染性貧血病瓊脂擴(kuò)散反應(yīng)凍干抗原的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明系一種用于診斷馬傳染性貧血病的瓊脂擴(kuò)散反應(yīng)凍干抗原的制備方法。
目前世界上制備馬傳染性貧血病瓊脂擴(kuò)散反應(yīng)抗原的方法有三種第一種方法以美國(guó)、日本為代表的細(xì)胞培養(yǎng)抗原(日本學(xué)者H·Nakajima，T·Sugiura及C·Ushimi)。該法是以組織培養(yǎng)馬的胚胎皮膚、肺及腎細(xì)胞增殖病毒為原材料，需經(jīng)多次超速離心(4萬(wàn)rpm2-4小時(shí))及濾過(guò)等工藝制備成無(wú)色、透明抗原液體。由于沒(méi)有解決抗原凍干時(shí)的保護(hù)劑，因此只能制備液體制劑抗原。此法工藝復(fù)雜，需用超速離心機(jī)，故產(chǎn)品成本較高不適宜我國(guó)獸藥廠批量生產(chǎn)。另外在抗原液體濾過(guò)除色等技術(shù)關(guān)鍵，在文獻(xiàn)中無(wú)詳細(xì)報(bào)道。
第二種方法以古巴為代表的臟器抗原。此法系一種30年代古老傳統(tǒng)制備抗原方法，以人工發(fā)病馬的脾臟作為原材料，經(jīng)離心、濾過(guò)等工藝制備出棕色、粘稠的液體抗原。該法需捕殺病馬取脾臟，因此產(chǎn)品成本較高，同時(shí)造成環(huán)境污染易擴(kuò)散該病。
第三種方法此法為農(nóng)牧漁業(yè)部發(fā)布(獸醫(yī)生物藥品制備規(guī)程405頁(yè)，1984·08·31發(fā)布1985·01·01執(zhí)行)的馬傳染性貧血病瓊脂擴(kuò)散反應(yīng)抗原制備方法。該法屬于細(xì)胞培養(yǎng)抗原，以組織培養(yǎng)驢的胚胎皮膚、肺及腎臟等細(xì)胞增殖病毒為原材料，經(jīng)普通離心機(jī)3000-6000rpm離心0.5-1.0小時(shí)等工藝制備出黃色或紅色粘稠并含有大量細(xì)胞碎片的液體抗原，也無(wú)凍干產(chǎn)品制劑。
本發(fā)明的目的在于提出一種適宜我國(guó)獸藥廠現(xiàn)有設(shè)備，無(wú)需超速離心機(jī)及特殊濾器，工藝簡(jiǎn)便、成本較低能夠批量生產(chǎn)無(wú)色、透明馬傳染性貧血病瓊脂擴(kuò)散反應(yīng)凍干抗原的方法。
本發(fā)明的特征在于1.消除接毒細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞、牛血清及色素是制備無(wú)色、透明抗原的技術(shù)關(guān)鍵。本法將收獲的接毒細(xì)胞培養(yǎng)物分為細(xì)胞相病毒(在貼瓶壁細(xì)胞中而沒(méi)有釋放到培養(yǎng)液中的病毒)和液相病毒(在脫落瓶壁的細(xì)胞中或釋放到培養(yǎng)液中的病毒)并分別進(jìn)行處理。細(xì)胞相病毒可用3000-6000rpm離心30-60分鐘，而液相病毒先進(jìn)行3000-6000rpm離心30-60分鐘，然后將離心沉淀物用同第一次離心量相同經(jīng)2%醋酸將PH調(diào)到5.0的PBS沖洗，沖洗后用離心達(dá)到除去牛血清及色素作用。用上述方法可以取代接毒細(xì)胞培養(yǎng)物需多次超速離心及濾過(guò)制備無(wú)色、透明液體抗原的效果。
2.在液體抗原中加1%量的牛血清白蛋白作為凍干保護(hù)劑，則可以防止因不加凍干保護(hù)劑抗原凍干后引起的抗原效價(jià)喪失，從而解決了凍干技術(shù)關(guān)鍵。
目前我國(guó)獸醫(yī)研究單位和獸藥廠用組織培養(yǎng)方法增殖病毒制備的畜禽瓊脂擴(kuò)散反應(yīng)抗原，在物理性狀上不理想，均呈有色、混濁粘稠的液體。馬傳染性貧血病瓊脂擴(kuò)散反應(yīng)抗原也不例外，與國(guó)外(美國(guó)、日本)制備的同類抗原相比，存在如下缺點(diǎn)抗原液體中含有大量細(xì)胞碎片，影響抗原的滴加量及抗原在瓊脂中的擴(kuò)散;抗原液體粘稠，易于粘附在器皿上造成一定量的損失;抗原液體混濁帶色，因此在使用時(shí)易在抗原孔周圍形成一個(gè)濁環(huán)，從而影響被檢血清的判定。
國(guó)外(美、日)同類抗原雖無(wú)上述缺點(diǎn)，但在制備該抗原或其它畜禽瓊脂擴(kuò)散反應(yīng)抗原時(shí)，均需采用多次超離心(4萬(wàn)rpm、2-4小時(shí))及濾過(guò)方法，使抗原呈無(wú)色、透明液體。因此，制備抗原時(shí)需超速離心機(jī)和特殊濾器，工藝復(fù)雜不易批量生產(chǎn)。
無(wú)論在美國(guó)、日本或是按我國(guó)現(xiàn)有規(guī)程制備的馬傳染性貧血病瓊脂擴(kuò)散反應(yīng)抗原均為液體制劑，無(wú)凍干產(chǎn)品。因此給該抗原的保存、長(zhǎng)途運(yùn)輸和邊遠(yuǎn)地區(qū)的使用帶來(lái)許多困難，同時(shí)也易損失效價(jià)。
我們研究出制備馬傳染性貧血病瓊脂擴(kuò)散反應(yīng)抗原的方法與國(guó)外方法相比，在如下兩個(gè)方面有新的發(fā)展1.突破了國(guó)內(nèi)外長(zhǎng)期認(rèn)為用細(xì)胞培養(yǎng)增殖病毒作為原材料，只有用超速離心和濾過(guò)的方法才能制備出物理性狀良好的瓊脂擴(kuò)散反應(yīng)抗原。用超速離心機(jī)離心，每次最大離心量為500ml，每次需離心2-4小時(shí)，因此不易進(jìn)行批量生產(chǎn)。
我們的方法是將接毒的細(xì)胞培養(yǎng)物分為細(xì)胞相病毒及液相病毒分別進(jìn)行處理，這樣可用一般離心機(jī)代替超速離心機(jī)，每次離心只需30-60分鐘，最大離心量為3000ml，是國(guó)外離心量的六倍，另外不用濾過(guò)，故易進(jìn)行批量生產(chǎn)。
2.研究出馬傳染性貧血病瓊脂擴(kuò)散反應(yīng)抗原凍干時(shí)添加的保護(hù)劑及其用量，從而解決了物理性狀良好的瓊脂擴(kuò)散反應(yīng)抗原凍干后效價(jià)喪失而只能制備液體抗原的技術(shù)關(guān)鍵。用我們方法制備的抗原有如下優(yōu)點(diǎn)1.我們方法制備的抗原與美國(guó)、日本同類抗原在物理性狀上一樣，均呈無(wú)色、透明液體并優(yōu)于法國(guó)(略帶粉紅色)。
2.我們制備的液體抗原經(jīng)加保護(hù)劑凍干后，在37℃至少可以保存二個(gè)月，在20-25℃至少可以保存半年，在0-4℃至少可以保存兩年。抗原效價(jià)不降低，故可以解決抗原長(zhǎng)途運(yùn)輸或邊遠(yuǎn)地區(qū)使用的困難。該凍干抗原經(jīng)稀釋后仍呈無(wú)色、透明液體。而美國(guó)、日本兩國(guó)抗原是液體制劑，不易長(zhǎng)途運(yùn)輸或長(zhǎng)期保存。
此外，我國(guó)用組織培養(yǎng)方法增殖病毒作為原材料制備的畜禽瓊脂擴(kuò)散反應(yīng)抗原，如牛白血病瓊擴(kuò)抗原、羊梅地-維士那瓊擴(kuò)抗原、羊蘭舌病瓊擴(kuò)抗原以及雞馬立克氏瓊擴(kuò)抗原等均呈有色、混濁粘稠液體抗原。若借鑒我們制備抗原的方法也可能制備出無(wú)色、透明瓊脂擴(kuò)散反應(yīng)抗原。
馬傳染性貧血病瓊脂擴(kuò)散反應(yīng)凍干抗原生產(chǎn)流程接毒細(xì)胞培養(yǎng)物(100ml培養(yǎng)物)
細(xì)胞相病毒液相病毒↓↓加pH7.40.05MPBS30ml用2%醋酸將pH調(diào)到5.0↓↓凍融離心3000-6000rpM30-60分鐘↓↓用2%醋酸將pH調(diào)到5.0沉淀物(最大離心量為3000ml)↓↓離心3000-6000rpM離心3000-6000rpM30-60分鐘(最大離心量為3000ml)30-60分鐘↓↓沉淀物沉淀物↓適量加pH7.40.05MPBS↓乙醚處理乙醚處理↓除醚↓適量加pH7.40.05MPBS適量加pH7.40.05MPBS↓↓離心3000rpM20-30分鐘離心3000rpM20-30分鐘
↓按1%量加牛血清白蛋白↓凍干↓凍干抗原國(guó)外制備馬傳染性貧血病瓊脂擴(kuò)散反應(yīng)抗原工藝流程接毒細(xì)胞培養(yǎng)物↓凍融↓用2%醋酸將pH調(diào)到5.0↓離心4萬(wàn)rpM2-4小時(shí)，最大離心量500ml↓沉淀物↓加適量PBS乙醚處理↓除醚加適量PBS↓離心3000rpM20分鐘↓上清↓離心4萬(wàn)rpM2-4小時(shí)↓沉淀物↓加適量PBS↓濾過(guò)↓無(wú)色、透明抗原液體
權(quán)利要求
1.一種用于診斷馬傳染性貧血病的瓊脂擴(kuò)散反應(yīng)凍干抗原的制備方法，其特征是將接毒細(xì)胞培養(yǎng)物分為細(xì)胞相病毒及液相病毒并分別進(jìn)行處理。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是用牛血清白蛋白作為抗原凍干時(shí)的保護(hù)劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是細(xì)胞相病毒直接用3000-6000rpm離心30-60分鐘，液相病毒進(jìn)行上述離心后，將離心沉淀物用同第一次離心量相同經(jīng)2%醋酸將pH調(diào)至5.0的PBS沖洗，沖洗后進(jìn)行第二次離心，離心時(shí)間速度同上。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的凍干保護(hù)劑，其特征是用量按100ml液體抗原加1g牛血清白蛋白。
全文摘要
本發(fā)明系一種用于診斷馬傳染性貧血病瓊脂擴(kuò)散反應(yīng)凍干抗原的制備方法。本法將接毒細(xì)胞培養(yǎng)物分為細(xì)胞相病毒及液相病毒分別進(jìn)行處理，用一般離心機(jī)3000-6000rpM離心30-60分鐘，每次離心量最大可達(dá)3000ml，制備出無(wú)色、透明馬傳染性貧血病瓊脂擴(kuò)散反應(yīng)抗原。
文檔編號(hào)A61K35/76GK1033741SQ8710121
公開(kāi)日1989年7月12日 申請(qǐng)日期1987年12月30日 優(yōu)先權(quán)日1987年12月30日
發(fā)明者董君平, 彭達(dá)春, 王振漪, 沈榮顯 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所