μ L [Ru (phen) 2dppz_idzo]2+ (200 μ mol/L)加入至上述混合物中，體系在 室溫下培養(yǎng)15分鐘。T30最終濃度為I. 5ymol/L，[Ru(phen)2dppz-idzo]2+最終濃度為 3. 0 μ mol/L。15個離心管中三聚氰胺的濃度分別為0, L 0, 2. 0, 3. 0, 4. 0, 5. 0, 6. 0, 7. 0, 8. 0 ，9. 0, 10. 0, 11. 0, 12. 0, 14. 0 和 16. 0 ymol/L〇
[0047] (3)熒光測定
[0048] 將混合液震蕩，混合均勻后，移入比色皿中進行熒光測定。測定條件：測量類型為 Wavelength scan，激發(fā)波長為405nm，掃描范圍為500-800nm，數(shù)據(jù)點采集間隔lnm，激發(fā)和 發(fā)射狹縫均為IOnm。
[0049] 三聚氰胺可以和富含胸腺嘧啶的DNA形成特殊的三個氫鍵作用，從而使DNA由單 鏈轉變?yōu)槿?，由于[Ru(phen) 2dppZ-idZ0]2+對三鏈DNA的強插入作用，造成的熒光增強 幅度明顯強于單鏈DNA，作用原理圖如圖1所示，圖1中，T-rich為富含胸腺嘧啶的DNA， melamine為三聚氰胺。
[0050] 本實施所得的[Ru (phen) 2dppz_idzo] 2+-T30焚光強度響應與三聚氰胺的 濃度的對應關系如圖2,圖3,圖4所示，從圖2及圖3可知，隨著三聚氰胺的加入， [Ru(phen) 2dppz-idzo]2+-T30體系的焚光強度先增大后逐漸達到平臺。說明隨著三聚氰胺 的加入，三聚氰胺可以和富T DNA序列形成特殊的三個氫鍵作用，從而使DNA由單鏈轉變?yōu)?三鏈，由于[Ru(phen)2dppz-idzo] 2+對三鏈DNA的強插入作用，造成的焚光增強幅度明顯強 于單鏈DNA。圖4所示，當三聚氰胺的濃度為0-7. 0 μ mol/L時，三聚氰胺的濃度與熒光響應 值有良好的線性關系，線性回歸方程分別為：F = 199. 96+85. 41c (c: μ mol/L)，線性系數(shù)R2 為0. 9923。計算檢出限為34. lnmol/L。
[0051] 實施例2
[0052] 選擇性研宄
[0053] (1)富T DNA序列與干擾物培養(yǎng)
[0054] 用移液槍向各個離心管（I. 5mL)中分別先加入15 yL T30(濃度為100 ymol/L， 序列從5' -3'為：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT)，然后用移液槍依次加入一定濃度的 干擾物（甘氨酸、組氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、賴氨酸、半胱氨酸、葡萄糖、Ca 2+、Mg2+、Zn2+、二氰二 胺、尿嘧啶、ATP、BSA)和三聚氰胺，用10mmol/LTris-HCl(pH為7. 0)緩沖液稀釋至985 yL。 混合物在室溫下孵化15分鐘。
[0055] (2) [Ru(phen)2dppz_idzo]2+插入
[0056] 將 15 μ L [Ru (phen) 2dppz_idzo]2+ (200 μ mol/L)加入至上述混合物中，體系在 室溫下培養(yǎng)15分鐘。T30最終濃度為I. 5ymol/L，[Ru(phen)2dppz-idzo]2+最終濃度為 3. 0 μ mol/L。干擾物最終濃度為10 μ mol/L，三聚氰胺最終濃度為5 μ m〇l/L〇
[0057] (3)熒光測定
[0058] 將混合液震蕩，混合均勻后，依次移入比色皿中進行熒光測定。測定條件：測量類 型為Wavelength scan，激發(fā)波長為405nm，掃描范圍為500-800nm，數(shù)據(jù)點采集間隔lnm，激 發(fā)和發(fā)射狹縫均為IOnm。
[0059] 本實施所得的不同干擾物在[Ru(phen)2dppz-idzo]2+_T30體系中焚光強度圖如圖 5所示，干擾物最終濃度為10 μ mol/L，三聚氰胺最終濃度為5 μ mol/L，干擾物對本方法無 影響。
[0060] 實施例3
[0061] 樣品加標回收率實驗
[0062] (1)牛奶樣品前處理
[0063] 在IOmL離心管中分別加入2mL純牛奶和ImL不同濃度的三聚氰胺溶液，加入2mL 三重蒸餾水，然后加入乙腈ImU甲醇lmL，渦旋振蕩Imin去除蛋白質，混合物經(jīng)超聲IOmin 后，混合物在l〇〇〇〇r/min條件下離心10min。用0. 22 μ m微孔濾膜過濾，取上清液，轉移至 另一離心管內(nèi)，待用。
[0064] (2)富T DNA序列與牛奶樣品培養(yǎng)
[0065] 用移液槍向各個離心管（1.5mL)中分別先加入15yL T30(濃度為lOOymol/L，序 列從5' -3'為：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT)，然后用移液槍依次加入含一定濃度三 聚氰胺的牛奶樣品，用lOmmol/LTris-HCl (pH為7. 0)緩沖液稀釋至985 μ L。混合物在室溫 下孵化15分鐘。
[0066] (3) [Ru(phen)2dppz_idzo]2+插入
[0067] 將 15 μ L [Ru (phen) 2dppz_idzo]2+ (200 μ mol/L)加入至上述混合物中，體系在 室溫下培養(yǎng)15分鐘。T30最終濃度為I. 5ymol/L，[Ru(phen)2dppz-idzo]2+最終濃度為 3. 0 μ mol/L。樣品中的三聚氰胺的最終濃度分別為2 μ mol/L、4 μ mol/L和6 μ mol/L〇
[0068] (4)焚光測定
[0069] 將混合液震蕩，混合均勻后，依次移入比色皿中進行熒光測定。測定條件：測量類 型為Wavelength scan，激發(fā)波長為405nm，掃描范圍為500-800nm，數(shù)據(jù)點采集間隔lnm，激 發(fā)和發(fā)射狹縫均為IOnm。
[0070] 實施例3所得的純牛奶樣品的加標回收率實驗數(shù)據(jù)。如表1所示，加標回收率為 96. 40%到99. 25%，RSD為0. 662% -4. 841%。驗證該方法的可行性。
[0071] 表 1
【主權項】
1. 一種基于金屬釕多吡啶配合物的三聚氰胺熒光光譜檢測方法，其特征在于，包括以 下步驟： (1) 制作三聚氰胺濃度與熒光強度響應的標準曲線： (I. 1)在不同梯度的三聚氰胺標準液中，分別加入富含胸腺嘧啶的DNA，用緩沖液稀釋 后，在室溫下孵化一段時間； (1. 2)將金屬釕多吡啶配合物加入步驟（I. 1)所得混合物中，室溫下培養(yǎng)； (1. 3)將步驟（1. 2)所得混合液震蕩，混合均勻后，移入比色皿中進行熒光測定； (1.4) 做出三聚氰胺濃度與熒光強度響應的標準曲線； (2) 待測樣品三聚氰胺濃度的測定： (2. 1)在待測樣品中，加入富含胸腺嘧啶的DNA，用緩沖液稀釋后，在室溫下孵化一段 時間； (2. 2)將金屬釕多吡啶配合物加入步驟（2. 1)所得混合物中，室溫下培養(yǎng)； (2. 3)將步驟（2. 2)所得混合液震蕩，混合均勻后，移入比色皿中進行熒光測定； (2.4) 根據(jù)測得的熒光強度以及步驟（1.4)所得的標準曲線，得出待測樣品中三聚氰 胺濃度。
2. 根據(jù)權利要求1所述的一種基于金屬釕多吡啶配合物的三聚氰胺熒光光譜檢測方 法，其特征在于，所述的富含胸腺嘧啶的DNA序列從5' -3'為TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTo
3. 根據(jù)權利要求1所述的一種基于金屬釕多吡啶配合物的三聚氰胺熒光光譜檢測方 法，其特征在于，所述的富含胸腺嘧啶的DNA在加入三聚氰胺后的終濃度為I. 5ymol/L。
4. 根據(jù)權利要求1所述的一種基于金屬釕多吡啶配合物的三聚氰胺熒光光譜檢測方 法，其特征在于，所述的緩沖液為lOmmol/LTris-HCl，pH為7. 0。
5. 根據(jù)權利要求1所述的一種基于金屬釕多吡啶配合物的三聚氰胺熒光光譜檢測方 法，其特征在于，所述的金屬釕多啦啶配合物最終濃度為3. 0ymol/L。
6. 根據(jù)權利要求1所述的一種基于金屬釕多吡啶配合物的三聚氰胺熒光光譜檢測方 法，其特征在于，所述的金屬釕多吡啶配合物化學式為[Ru(phen) 2dppz-idzo]2+，其中，phen 為1，10-鄰菲羅啉，dppz為雙吡啶并吩嗪，idzo為咪唑啉酮。
7. 根據(jù)權利要求1所述的一種基于金屬釕多吡啶配合物的三聚氰胺熒光光譜檢測方 法，其特征在于，步驟（I. 1)中，三聚氰胺標準液的濃度依次為〇，1. 0, 2. 0, 3. 0,4. 0, 5. 0， 6. 0,7. 0,8. 0,9. 0,10. 0,11. 0,12. 0,14. 0 和 16. 0ymol/L〇
8. 根據(jù)權利要求1所述的一種基于金屬釕多吡啶配合物的三聚氰胺熒光光譜檢測方 法，其特征在于，步驟（1.3)與步驟（2.3)中，進行熒光測定的條件相同，均為：測量類型為 Wavelengthscan，激發(fā)波長為405nm，掃描范圍為500-800nm，數(shù)據(jù)點采集間隔lnm，激發(fā)和 發(fā)射狹縫均為IOnm。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于金屬釕多吡啶配合物的三聚氰胺熒光光譜檢測方法。利用三聚氰胺可以和富含胸腺嘧啶的DNA形成特殊的三個氫鍵作用，從而使DNA由單鏈轉變?yōu)槿?，由于[Ru(phen)2dppz-idzo]2+(phen為1,10-鄰菲羅啉，dppz為雙吡啶并吩嗪，idzo為咪唑啉酮)對三鏈DNA的強插入作用，造成的熒光增強幅度明顯強于單鏈DNA。當三聚氰胺的濃度為0-7.0μmol/L時，三聚氰胺的濃度與熒光響應值有良好的線性關系，線性回歸方程分別為：F＝199.96+85.41c(c:μmol/L)，線性系數(shù)R2為0.9923。同時應用所建立的方法在純牛奶樣品中加入不同濃度的三聚氰胺，得到滿意的回收率。
【IPC分類】G01N1-28, G01N1-38, G01N21-64
【公開號】CN104792757
【申請?zhí)枴緾N201510186091
【發(fā)明人】劉冰, 張藝偉, 王秀枝, 姚天明
【申請人】同濟大學
【公開日】2015年7月22日
【申請日】2015年4月17日