使用側(cè)向流免疫層析技術(shù)來(lái)檢測(cè)腸道病毒的現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定的制作方法
【專利說(shuō)明】
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求于2012年9月12日提交的題為"Point-Of-Care Assay For The Detection Of Enteroviruses Using Lateral Flow Immunochromatographic Technology"的新加坡專利申請(qǐng)No. 201206800-3的優(yōu)先權(quán)并且為該專利申請(qǐng)的轉(zhuǎn)換，其通 過(guò)引用以其整體并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本公開內(nèi)容涉及用于檢測(cè)病毒的現(xiàn)場(chǎng)側(cè)向流免疫層析測(cè)定（point-of-care lateral flow immunographic assay)。特別地，本公開內(nèi)容涉及用于檢測(cè)腸道病毒的現(xiàn)場(chǎng) 側(cè)向流免疫層析測(cè)定。
【背景技術(shù)】
[0004] 手足口病（Hand，F(xiàn)oot and Mouth Disease，HFMD)是亞太地區(qū)最常見的傳染病之 一，在過(guò)去幾十年中導(dǎo)致了許多起死亡事故。該病主要通過(guò)與體液（例如唾液）接觸來(lái)傳 播。大多數(shù)腸道病毒是HFMD的病原體。對(duì)患有HFMD的患者的預(yù)后可因引起HFMD的腸道 病毒而異。例如，腸道病毒，例如柯薩奇病毒A16(Coxsackievirus A16，CA16)通常導(dǎo)致自 限性HFMD，而腸道病毒71(EV71)可引起神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥和死亡。
[0005] HFMD是溫和瘆病的形式，其主要影響兒童并導(dǎo)致在手、腳和/或頰粘膜上出現(xiàn)水 皰皮瘆。有超過(guò)60種腸道病毒可引起HFMD。HFMD的主要病原體是屬于小核糖核酸病毒 科（Picornaviridae family)的腸道病毒，即EV71、CA16、柯薩奇病毒B2(CB2)和艾柯病毒 (Echovirus) 7 (Echo7)。通常，由大多數(shù)腸道病毒引起的臨床癥狀可以是相似的；因此，可能 難以僅通過(guò)單獨(dú)觀察臨床癥狀來(lái)確定哪種腸道病毒引起了 HFMD。然而，EV71通常是可區(qū)分 的，這是由于其可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥和死亡的異常毒力。可由EV71引起的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā) 癥包括無(wú)菌性腦膜炎、腦干腦炎、肺水腫和脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹。
[0006] 最近在亞太地區(qū)大規(guī)模爆發(fā)的HFMD導(dǎo)致了 1998年在臺(tái)灣的78人死亡，1997年 在馬來(lái)西亞的41人死亡，2000年在新加坡的5人死亡，2006年在馬來(lái)西亞的18人死亡以 及2008年在新加坡的2人死亡。所有上述的死亡事故都是由EV71引起的，并且在這些死 亡事故中的一些，發(fā)現(xiàn)患者共感染了 EV71和CA16。在2010年在中國(guó)的最近HFMD疫情中， 報(bào)道了由EV71引起的超過(guò)250, 000例HFMD病例，包括250起死亡事故。
[0007] 2010年在新加坡報(bào)道了超過(guò)19, 000例HFMD病例，其中12%的病例是由EV71引 起的。數(shù)量驚人的HFMD病例導(dǎo)致兒童看護(hù)中心和學(xué)校關(guān)閉，其最終影響了經(jīng)濟(jì)。
[0008] 迄今為止，還沒(méi)有可用于治療HFMD的有效抗病毒藥物，并且沒(méi)有可用于預(yù)防HFMD 的疫苗。目前，所有已知的HFMD治療都是基于癥狀的并且具有尤其是針對(duì)EV71的最低效 力。目前還沒(méi)有可用的有效抗病毒藥物或疫苗，需要迅速并準(zhǔn)確地鑒定HFMD患者，從而為 患者提供及時(shí)治療和管理并減少感染的傳播。
[0009] 此外，目前全科醫(yī)生、健康看護(hù)專業(yè)人員和學(xué)校教師通常是基于視覺(jué)上可觀察到 的癥狀（例如發(fā)燒、口腔潰瘍和/或四肢（例如手和/或腳）上出現(xiàn)皮瘆）來(lái)進(jìn)行分類、鑒 定和/或診斷患有HFMD或處于HFMD之早期階段的兒童。這種診斷方法是非常主觀的且 容易出現(xiàn)錯(cuò)誤分類或誤診。HFMD可在兒童中迅速傳播，特別是在人多的地方，例如學(xué)校；因 此，需要迅速并準(zhǔn)確地鑒定HFMD患者以防止疾病的進(jìn)一步傳播。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本公開內(nèi)容涉及利用特異性抗原-抗體相互作用的側(cè)向流免疫層析測(cè)定。將含有 病毒的分析物添加到樣品墊中，隨后通過(guò)毛細(xì)管作用沿著測(cè)試條（test strip)流動(dòng)。所述 測(cè)試條包含檢測(cè)分子，其中所述檢測(cè)分子包含與膠體金（即，膠體金納米顆粒）相綴合的第 一特異性抗體。當(dāng)病毒遇到檢測(cè)分子時(shí)，與膠體金相綴合的第一特異性抗體識(shí)別病毒的病 毒抗原，其中所述病毒抗原包含特異性病毒表面蛋白（即，腸道病毒的VP1蛋白）。第一特 異性抗體與病毒的特異性病毒表面蛋白（即，腸道病毒的VP1蛋白）的第一區(qū)域相結(jié)合，以 形成包含抗體-抗原復(fù)合物的第一復(fù)合物。所述抗體-抗原復(fù)合物進(jìn)一步向下迀移到測(cè)試 線（test line)上，所述測(cè)試線包含包被在測(cè)試線上的第二特異性抗體，其中第二特異性抗 體識(shí)別特異性病毒表面蛋白（即，腸道病毒的VP1蛋白）。第二特異性抗體與特異性病毒表 面蛋白（即，腸道病毒的VP1蛋白）的第二區(qū)域相結(jié)合。所述病毒與包被在測(cè)試線上的第 二特異性抗體相結(jié)合。第二特異性抗體與病毒的結(jié)合形成了包含抗體-抗原夾心復(fù)合物的 第二復(fù)合物。一種或更多種抗體-抗原夾心復(fù)合物的形成導(dǎo)致可見的或視覺(jué)可觀察的紅色 線的形成，這是由于作為膠體金納米顆粒的膠體金檢測(cè)分子具有紅色。
[0011] 本公開內(nèi)容的側(cè)向流免疫層析測(cè)定以及使用其來(lái)檢測(cè)腸道病毒的方法使得可在 30分鐘或更短時(shí)間內(nèi)以90%或更高的準(zhǔn)確度迅速現(xiàn)場(chǎng)鑒定HFMD患者。本公開內(nèi)容的側(cè)向 流免疫層析測(cè)定以及使用其來(lái)檢測(cè)腸道病毒的方法使得可進(jìn)行有效且高效的患者管理并 降低任何誤診的可能性。
[0012] 本公開內(nèi)容的第一方面提供了用于檢測(cè)腸道病毒之存在的側(cè)向流測(cè)試條（test strip)，其中，所述測(cè)試條可包含：綴合物墊，其包含多個(gè)檢測(cè)分子；和測(cè)試線，其包含多個(gè) 捕獲分子；其中所述測(cè)試條檢測(cè)腸道病毒。
[0013] 在一些實(shí)施方案中，上述側(cè)向流測(cè)試條可特異性地用于檢測(cè)腸道病毒。在一些實(shí) 施方案中，上述側(cè)向流測(cè)試條可100 %特異性地用于檢測(cè)腸道病毒。
[0014] 在一些實(shí)施方案中，每個(gè)檢測(cè)分子可包含與可檢測(cè)顆粒相綴合的第一抗原特異性 抗體。在一些實(shí)施方案中，可檢測(cè)顆粒可包含金納米顆粒。在一些實(shí)施方案中，第一抗原特 異性抗體可對(duì)包含病毒表面蛋白的病毒抗原特異。在一些實(shí)施方案中，第一抗原特異性抗 體可對(duì)病毒表面蛋白的第一區(qū)域特異。在一些實(shí)施方案中，病毒表面蛋白可以是VP1蛋白。 在一些實(shí)施方案中，每個(gè)檢測(cè)分子可包含一個(gè)或更多個(gè)第一抗原特異性抗體，其中每個(gè)所 述一個(gè)或更多個(gè)第一抗原特異性抗體可與可檢測(cè)顆粒相綴合。
[0015] 在一些實(shí)施方案中，每個(gè)捕獲分子包含第二抗原特異性抗體。在一些實(shí)施方案中， 第二抗原特異性抗體可對(duì)病毒表面蛋白特異。在一些實(shí)施方案中，第二抗原特異性抗體可 對(duì)病毒表面蛋白的第二區(qū)域特異。在一些實(shí)施方案中，病毒表面蛋白可以是VP1蛋白。
[0016] 在一些實(shí)施方案中，上述側(cè)向流測(cè)試條可在約30分鐘或更短時(shí)間內(nèi)、約20分鐘或 更短時(shí)間內(nèi)或約10分鐘內(nèi)提供測(cè)試結(jié)果。在一些實(shí)施方案中，側(cè)向流測(cè)試條可在約20分 鐘或更短時(shí)間內(nèi)提供測(cè)試結(jié)果。在一些實(shí)施方案中，上述側(cè)向流測(cè)試條可在約10分鐘內(nèi)提 供測(cè)試結(jié)果。
[0017] 在一些實(shí)施方案中，上述側(cè)向流測(cè)試條可提供準(zhǔn)確度約90%或更高的測(cè)試結(jié)果。 在一些實(shí)施方案中，上述側(cè)向流測(cè)試條可提供準(zhǔn)確度約95%或更高的測(cè)試結(jié)果。在一些實(shí) 施方案中，上述側(cè)向流測(cè)試條可提供準(zhǔn)確度約99%或更高的測(cè)試結(jié)果。在一些實(shí)施方案中， 上述側(cè)向流測(cè)試條可提供準(zhǔn)確度約100%的測(cè)試結(jié)果。
[0018] 在一些實(shí)施方案中，腸道病毒可包括一種或更多種腸道病毒。
[0019] 在一些實(shí)施方案中，上述側(cè)向流測(cè)試條可以是現(xiàn)場(chǎng)側(cè)向流測(cè)試條。
[0020] 本公開內(nèi)容的第二方面提供了制造上述側(cè)向流測(cè)試條的方法，其中所述方法可包 括：制造綴合物墊；制備包含檢測(cè)分子的檢測(cè)分子溶液；以及將綴合物墊浸泡在檢測(cè)分子 溶液中。
[0021] 本公開內(nèi)容的第三方面提供了用于檢測(cè)一種或更多種腸道病毒的診斷試劑盒，其 中所述診斷試劑盒包含上述側(cè)向流測(cè)試條。
[0022] 在一些實(shí)施方案中，上述診斷試劑盒還包含用于收集生物流體樣品的樣品收集裝 置。
[0023] 本公開內(nèi)容的第四方面提供了使用側(cè)向流免疫層析測(cè)定來(lái)確定腸道病毒之存在 的方法，其中所述方法可包括：提供樣品；提供包含多個(gè)檢測(cè)分子和多個(gè)捕獲分子的側(cè)向 流測(cè)試條；將樣品添加到側(cè)向流測(cè)試條的樣品墊上；以及使樣品暴露于多個(gè)檢測(cè)分子。
[0024] 在一些實(shí)施方案中，每個(gè)檢測(cè)分子可包含與可檢測(cè)顆粒相綴合的第一抗原特異性 抗體。在一些實(shí)施方案中，可檢測(cè)顆粒可包含金納米顆粒。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)檢測(cè)分 子可包含一個(gè)或更多個(gè)第一抗原特異性抗體，其中每個(gè)所述的一個(gè)或更多個(gè)第一抗原特異 性抗體可與可檢測(cè)顆粒相綴合。
[0025] 在一些實(shí)施方案中，第一抗原特異性抗體可對(duì)包含病毒表面蛋白的病毒抗原特 異，其中如果所述樣品包含腸道病毒，則第一抗原特異性抗體可與病毒表面蛋白相結(jié)合以 形成一個(gè)或更多個(gè)第一復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，第一抗原特異性抗體可對(duì)病毒表面蛋 白的第一區(qū)域特異。在一些實(shí)施方案中，病毒表面蛋白可以是VP1蛋白。
[0026] 在一些實(shí)施方案中，每個(gè)捕獲分子可包含第二抗原特異性