用于定量檢測(cè)甲胎蛋白異質(zhì)體的側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于定量檢測(cè)甲胎蛋白異質(zhì)體的側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)，涉及醫(yī)用試劑領(lǐng)域。所述側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)沿層析方向依次包括：樣本區(qū)和結(jié)合區(qū)；所述樣本區(qū)涂布有凝集素活化的乳膠微粒，用于結(jié)合液體樣品中的甲胎蛋白異質(zhì)體；所述結(jié)合區(qū)上涂布有膠體金結(jié)合物，用于結(jié)合液體樣品中的甲胎蛋白；所述凝集素活化的乳膠微粒在所述樣本區(qū)上的涂布濃度為2.5～50ug/cm2；所述凝集素為小扁豆凝集素。本發(fā)明的側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)操作簡(jiǎn)單、方便快速、成本低廉，AFP?L3分離與測(cè)定一步實(shí)現(xiàn)，效率更高。
【專利說明】
用于定量檢測(cè)甲胎蛋白異質(zhì)體的側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥制劑領(lǐng)域，具體涉及一種用于定量檢測(cè)甲胎蛋白異質(zhì)體的側(cè)向?qū)?析系統(tǒng)。
【背景技術(shù)】
[0002] 一般認(rèn)為，甲胎蛋白（AFP)是HCC(hepatocellular carcinoma，肝細(xì)胞癌）相對(duì)特 異的腫瘤標(biāo)志物，AFP持續(xù)升高是發(fā)生HCC的危險(xiǎn)因素。目前，有些歐美學(xué)者認(rèn)為AFP的敏感 性和特異度不高，2010版美國(guó)肝病研究學(xué)會(huì)(AASLD)指南已不再將AFP作為篩查指標(biāo)，但是 我國(guó)的HCC大多與HBV(乙肝病毒)感染相關(guān)，與西方國(guó)家HCC致病因素不同（多為HCV、酒精和 代謝性因素），結(jié)合國(guó)內(nèi)隨機(jī)研究(RCT)結(jié)果和實(shí)際情況，對(duì)HCC的常規(guī)監(jiān)測(cè)篩查指標(biāo)中繼續(xù) 保留AFP。
[0003] 血清AFP及其異質(zhì)體是診斷肝癌的重要指標(biāo)和特異性最強(qiáng)的腫瘤標(biāo)記物，國(guó)內(nèi)常 用于肝癌的普查、早期診斷、術(shù)后監(jiān)測(cè)和隨訪。對(duì)于AFP彡400iig/L超過1個(gè)月，或彡200iig/L 持續(xù)2個(gè)月，并能排除其他原因引起的AFP升高，這種情況一般包括妊娠、生殖系胚胎源性腫 瘤、活動(dòng)性肝病及繼發(fā)性肝癌等。但是尚有30%-40%的肝癌病人AFP檢測(cè)呈陰性，包括ICC (ntrahepaticcholangiocarcinoma，肝內(nèi)膽管癌）、高分化和低分化HCC，或HCC已壞死液化 者，AFP均可不增高。因此，僅靠AFP不能診斷所有的肝癌，AFP對(duì)肝癌診斷的陽性率一般為 60 %-70%，有時(shí)差異較大。
[0004] 近年來，國(guó)內(nèi)外臨床觀察和研究結(jié)果均提示，血清AFP在部分ICC和胃腸癌肝轉(zhuǎn)移 患者中也可升高，并且ICC也多伴有肝硬化。盡管ICC的發(fā)病率遠(yuǎn)低于HCC，但兩者均常見于 肝硬化患者，因此，肝占位性病變伴AFP升高并不一定就是HCC，仍需進(jìn)一步鑒別。
[0005] AFP是一個(gè)單鏈糖蛋白，不同的肝病患者產(chǎn)生的血清AFP的糖鏈結(jié)構(gòu)不同，根據(jù)與 小扁豆凝集素親和力不同，AFP可以分成3種類型:AFP-L1由良性病變肝細(xì)胞分泌，AFP-L2， 來自孕婦，而AFP-L3則為惡性癌細(xì)胞產(chǎn)生，即通常所說的甲胎蛋白異質(zhì)體。AFP-L3是肝癌診 斷的高特異指標(biāo)，被稱為新一代肝癌標(biāo)志物。FDA于2005年批準(zhǔn)該指標(biāo)應(yīng)用于肝癌預(yù)警，并 把AFP-L3診斷肝癌的陽性界定值為10%。1999年第四屆全國(guó)癌癥學(xué)術(shù)會(huì)議將AFP-L3列為原 發(fā)性肝癌臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)的肝癌標(biāo)記物之一。被公認(rèn)為是比單純的AFP更為特異的原發(fā)性肝 癌指標(biāo)。
[0006]鑒別肝癌與良性肝病。原發(fā)性肝癌患者AFP常升尚，但許多良性肝臟疾病也可有 AFP升高，單憑AFP結(jié)果有時(shí)很難區(qū)分良、惡性病變。此時(shí)AFP異質(zhì)體檢測(cè)就具有良好的臨床 意義，尤其對(duì)于AFP在30-400ng/ml之間者具有較好的價(jià)值。Yozhiaki對(duì)361例肝硬化進(jìn)行了 前瞻性研究，在53例AFP在30ug幾以上的患者中，2年以后21例發(fā)展為肝癌，確診肝癌時(shí)39% 的患者AFP在400ug/L以下。對(duì)比研究開始時(shí)肝細(xì)胞肝癌(HCC)組與非HCC組AFP測(cè)定值，未發(fā) 現(xiàn)差異有顯著性，研究發(fā)現(xiàn)病變時(shí)AFP異質(zhì)體的類型有所不同，對(duì)HCC診斷LCA陽性率 87.12 %，假陽性率21.5 %，ConA陽性率89.17 %，假陽性率17.15 %。目前的研究結(jié)果把AFP-L3含量大于10 %作為肝癌的陽性指標(biāo)。
[0007] 肝癌術(shù)后的監(jiān)測(cè)。肝癌切除術(shù)后，血清AFP含量隨之下降，其下降速度取決于體內(nèi) 殘留AFP量及半衰期，一般2月內(nèi)轉(zhuǎn)陰，轉(zhuǎn)陰時(shí)AFP異質(zhì)體隨之消失。如果AFP明顯下降但不轉(zhuǎn) 陰，異質(zhì)體變化不明顯，則提示手術(shù)不徹底，可能還存在邊緣殘留、血管癌檢、衛(wèi)星結(jié)節(jié)或轉(zhuǎn) 移等。如果異質(zhì)體下降至25%以下，AFP和異質(zhì)體濃度相對(duì)恒定，則可能是患者有肝炎或肝 硬化所致。
[0008] 胚胎異常發(fā)育及胎兒先天性疾患。正常妊娠期母體血清中AFP與胚胎中AFP處于平 衡狀態(tài)，一旦胎兒畸形或胎盤屏障發(fā)生異常，可導(dǎo)致胎兒血清滲入羊水中或羊水滲入母體 血清，造成母體羊水或血清AFP急劇升高。但僅僅測(cè)定AFP總量有一定的局限性。實(shí)驗(yàn)表明神 經(jīng)管缺損、無腦兒或脊柱裂等，兒童肝母細(xì)胞瘤、膽道閉鎖、性腺腫瘤、惡性崎胎瘤等可有 AFP和/或AFP異質(zhì)體的陽性。
[0009] AFP-L3是唯一由患者肝臟中癌細(xì)胞生成的蛋白。在加拿大和美國(guó)的一項(xiàng)多中心、 前瞻性、雙盲、長(zhǎng)期臨床試驗(yàn)中，對(duì)該檢測(cè)方法進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示AFP-L3%升高（15%以 上)的患者，在接下來的21個(gè)月中，發(fā)生肝細(xì)胞癌的危險(xiǎn)增加7倍之多。根據(jù)已有的肝細(xì)胞癌 腫瘤學(xué)實(shí)踐指南，這些患者肝細(xì)胞癌發(fā)生率極端增高。
[0010]目前，AFP-L3檢測(cè)方法有檢測(cè)方法有植物凝集素親和免疫電泳技術(shù)、 iUTASWak〇?i30檢測(cè)系統(tǒng)技術(shù)及熱景生物糖基捕獲離心柱前處理技術(shù)。其中植物凝集素 親和免疫電泳技術(shù)和^TASW ak〇?i30檢測(cè)系統(tǒng)技術(shù)要求高、操作繁瑣、試劑昂貴，限制了 其臨床應(yīng)用。而糖基捕獲離心柱，由于樣本處理和檢測(cè)分開進(jìn)行，增加了操作的繁瑣性。
[0011] 側(cè)向?qū)游黾夹g(shù):免疫層析按其原理可分為兩類，一類是以酶促反應(yīng)顯色為基礎(chǔ)，以 顯色高度來定量；另一類則使用著色標(biāo)記物如乳膠微粒、膠體硒、膠體金以及脂質(zhì)體等。層 析時(shí)，標(biāo)記物與待測(cè)物反應(yīng)形成的復(fù)合物被相應(yīng)的固定在層析材料上的配體捕獲而富集顯 色，根據(jù)層析材料上顯色條帶的有無或多少來定性或定量。以酶促反應(yīng)顯色為基礎(chǔ)的免疫 層析技術(shù)由于待測(cè)物的定量是以試紙條上的酶活性為依據(jù)，故其測(cè)量結(jié)果受酶穩(wěn)定性以及 樣品基質(zhì)、pH值、溫育時(shí)間和溫度等環(huán)境因素的影響。
[0012] 免疫膠體金技術(shù)是繼三大標(biāo)記技術(shù)(熒光素、放射性同位素和酶)后發(fā)展起來的固 相標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)。80年代出現(xiàn)在臨床診斷領(lǐng)域的膠體金免疫層析（colloidal gold immunochromatography assay，GICA)快速診斷試紙條是建立在金標(biāo)免疫滲濾基礎(chǔ)上的一 種免疫檢測(cè)技術(shù)。它具有簡(jiǎn)單快速、結(jié)果明確、無需復(fù)雜操作技巧和特殊設(shè)備、靈敏度高、攜 帶方便等優(yōu)點(diǎn)，己成為臨床實(shí)驗(yàn)診斷領(lǐng)域發(fā)展的一個(gè)新方向。
[0013]綜上，本領(lǐng)域亟需開發(fā)一種可快速便捷、成本低廉地完成定量檢測(cè)AFP-L3的試劑 盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 根據(jù)上述領(lǐng)域存在的缺陷和需求，本發(fā)明提供一種以甲胎蛋白異質(zhì)體為目標(biāo)蛋白 的測(cè)定系統(tǒng)。
[0015] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0016] 本發(fā)明首先提供一種用于捕獲甲胎蛋白異質(zhì)體的小扁豆凝集素活化乳膠微粒，其 特征在于，是通過小扁豆凝集素活化而得，其中乳膠微粒與小扁豆凝集素的投料比例為 lmg :25-60ug。該乳膠微?？捎糜趯游鱿到y(tǒng)中，在用小扁豆凝集素活化乳膠微粒時(shí)，二者通 過roc法共價(jià)偶聯(lián)，偶聯(lián)后的小扁豆凝集素存在一定程度的空間構(gòu)象變化，從而影響后續(xù)與 甲胎蛋白異質(zhì)體的親和程度，因此要保證偶聯(lián)上乳膠微粒的小扁豆凝集素在結(jié)合甲胎蛋白 異質(zhì)體AFP-L3的親和力，就必須控制好活化時(shí)小扁豆凝集素與乳膠微粒的用量比例;太低 會(huì)使有限量的小扁豆凝集素在偶聯(lián)乳膠微粒后，變得不易與AFP-L3結(jié)合，親和力低;太高則 會(huì)導(dǎo)致過量的小扁豆凝集素，從而產(chǎn)生非特異性結(jié)合AFP-L3以外的甲胎蛋白。采用上述投 料比例的小扁豆凝集素活化的乳膠微粒(MP-LCA)，不僅能夠特異性地捕獲AFP-L3,從而使 AFP-L3與AFP分開，同時(shí)還能保證MP-LCA結(jié)合AFP-L3的親和力，從而確保檢測(cè)結(jié)果的特異性 和準(zhǔn)確性。
[0017] 在進(jìn)一步的實(shí)施例中，所述乳膠微粒的粒徑2.Own，適合于用在側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)檢測(cè) 甲胎蛋白異質(zhì)體的技術(shù)中，固定在網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)樣本墊中。
[0018] 在另一些實(shí)施例中，還提供所述小扁豆凝集素活化乳膠微粒的制備方法，包括如 下步驟：
[0019] (1)乳膠微粒活化
[0020] 1) ?取乳膠Latex MP，用lmL MES緩沖液洗滌去上清；
[0021] 2) ?將Latex MP用440yL MES緩沖液重懸。
[0022] 3).加入10yL10mg/mL EDC溶液，充分混勻，緩慢振搖，室溫30min;
[0023] 4). 3000rmp，離心5min，去除上清，并用lmLMES緩沖液洗滌3次去上清得到活化的 乳膠微粒；
[0024] (2)乳膠微粒包被
[0025] 1) ?用300yL pH 5.0,25mM MES重懸lmgLatex MP;
[0026] 2).加入小扁豆凝集素溶液；
[0027] 3).用25mM MES使反應(yīng)體系定容為500yL，充分混勻；
[0028] 4) ?緩慢振搖，室溫30-120min或4°C2小時(shí)；
[0029] 5).離心去除上清得到小扁豆凝集素活化的乳膠微粒，
[0030] 上述包被過程中，所述小扁豆凝集素與乳膠微粒的投料比例為25-60ug:lmg。上述 乳膠微粒的制備方法是在原有步驟的基礎(chǔ)上進(jìn)行了投料濃度比例的改進(jìn)，本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn) 得知，采用上述投料比例的小扁豆凝集素與乳膠微粒進(jìn)行混合、包被、活化獲得的MP-LCA， 能夠更為特異地捕獲AFP-L3，從而使AFP-L3與AFP分開，從而保證檢測(cè)結(jié)果的特異性和準(zhǔn)確 性。
[0031]在進(jìn)一步的實(shí)施例中，所述扁豆凝集素與乳膠微粒的投料比例為50ug:lmg。該比 值是經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的，從上述投料比例的范圍中進(jìn)一步優(yōu)選的投料比例數(shù)值，采用該比值進(jìn) 行活化、包被，效果最優(yōu)。
[0032] 本發(fā)明的另一些實(shí)施例還提供了用于定量檢測(cè)甲胎蛋白異質(zhì)體的側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)， 沿層析方向依次包括:樣本區(qū)、結(jié)合區(qū)；
[0033] 所述樣本區(qū)包含所述的小扁豆凝集素活化的乳膠微粒，所述小扁豆凝集素活化的 乳膠微粒的使用量為2.5~50ug/cm2，優(yōu)選地，所述小扁豆凝集素活化的乳膠微粒的使用量 為10ug/cm 2〇
[0034] 所述結(jié)合區(qū)涂布有膠體金結(jié)合物，所述膠體金結(jié)合物指膠體金標(biāo)記的甲胎蛋白抗 體，用于結(jié)合樣品中的甲胎蛋白。
[0035] 采用本發(fā)明提供的上述側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)，能特異捕獲AFP-L3、從而有效地將AFP-L3 從AFP中分離，上述使用量是經(jīng)涂布濃度選自實(shí)驗(yàn)獲得，采用上述2.5~50ug/cm 2的小扁豆 凝集素活化的乳膠微粒涂布樣本墊，能獲得90%_110%的結(jié)合效率。而采用lOug/cm2的使 用量能使結(jié)合效率達(dá)到100 %。
[0036] 在進(jìn)一步的實(shí)施例中，所述側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)，還包括檢測(cè)區(qū);所述樣本區(qū)、結(jié)合區(qū)、檢 測(cè)區(qū)沿層析方向依次排布;所述檢測(cè)區(qū)設(shè)有檢測(cè)線和對(duì)照線;所述檢測(cè)線包被有羊抗鼠抗 體;所述對(duì)照線包被有甲胎蛋白抗體;所述檢測(cè)線和對(duì)照線垂直于層析方向且不重疊。
[0037] 上述檢測(cè)區(qū)主要起質(zhì)量控制的作用，用于指示檢測(cè)結(jié)果是否存在假陽性，用于提 高側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)檢測(cè)的可靠性。
[0038] 在一些具體的實(shí)施例中，所述甲胎蛋白抗體在所述膠體金結(jié)合物中的濃度為 0.4mg/ml;所述羊抗鼠抗體濃度為lmg/mL;所述甲胎蛋白抗體濃度為lmg/mL。在所述側(cè)向?qū)?析系統(tǒng)中采用上述濃度的抗體進(jìn)一步保證了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。
[0039] 本發(fā)明還請(qǐng)求保護(hù)所述側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)的制備方法，其特征在于，包括制備樣本墊 和結(jié)合墊：
[0040] 所述樣本墊上涂布有所述的小扁豆凝集素活化的乳膠微粒；
[0041 ]所述結(jié)合墊涂布甲胎蛋白抗體的膠體金結(jié)合物。
[0042]采用上述制備方法可制備出特異性和準(zhǔn)確性都較高的定量檢測(cè)樣品中甲胎蛋白 異質(zhì)體的側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)。該系統(tǒng)具體可以是試紙條、檢測(cè)芯片、試劑盒等。
[0043] 進(jìn)一步地，所述制備方法，還包括制備檢測(cè)區(qū)；
[0044] 所述樣本墊、結(jié)合墊、檢測(cè)區(qū)沿層析方依次排布；
[0045] 所述檢測(cè)區(qū)設(shè)有檢測(cè)線和對(duì)照線；
[0046] 所述檢測(cè)線包被有羊抗鼠抗體；
[0047] 所述對(duì)照線包被有甲胎蛋白抗體；
[0048] 所述檢測(cè)線和對(duì)照線垂直于層析方向且不重疊。
[0049] 上述檢測(cè)區(qū)主要起質(zhì)量控制的作用，用于指示檢測(cè)結(jié)果是否存在假陽性，用于提 高側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)檢測(cè)的可靠性。
[0050] 在一些具體的實(shí)施例中，所述小扁豆凝集素活化的乳膠微粒在所述樣本墊上的涂 布濃度為2.5-50ug/cm2，該涂布濃度范圍能獲得90 % -110 %的結(jié)合效率，涂布濃度進(jìn)一步 優(yōu)選為lOug/cm2,這種情況下的結(jié)合效率最優(yōu)，可達(dá)100%。
[0051 ]所述甲胎蛋白抗體在所述膠體金結(jié)合物中的濃度為0.4mg/ml;所述羊抗鼠抗體濃 度為lmg/mL;所述甲胎蛋白抗體濃度為lmg/mL。在制備過程中采用上述濃度的抗體，可進(jìn)一 步保證所制備出的側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)的檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。
[0052]本發(fā)明所述側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)的工作原理如下：甲胎蛋白異質(zhì)體(AFP-L3)是一種糖鏈 上含巖藻糖的糖基化蛋白，因此可以與植物或微生物凝集素親和結(jié)合。該測(cè)定系統(tǒng)選用小 扁豆凝集素（LCA)與乳膠微粒用1-(3_二甲基氨基丙基）-3_乙基碳二亞胺(EDC)法共價(jià)偶 聯(lián)，形成穩(wěn)定的共價(jià)化學(xué)鍵，獲得活性乳膠微粒。將一定量的活性乳膠微粒處理網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的 樣本墊，活化的乳膠微粒將會(huì)固定于樣本墊。由于樣本中的AFP-L3與凝集素的親和結(jié)合作 用，泳動(dòng)速度降低，進(jìn)而與AFP-L1、AFP-L2分離，AFP-L1、AFP-L2然后通過與金標(biāo)結(jié)合物的結(jié) 合、T線和C線的捕獲，最后根據(jù)T線和C線的吸光度計(jì)算出樣本中AFP-LUAFP-L2的總濃度。 若AFP濃度已知，便可間接計(jì)算得出AFP-L3濃度。
[0053 ]本發(fā)明基于網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)樣本墊可以固定一定粒徑乳膠微粒(粒徑2. Own )、側(cè)向?qū)游?分離技術(shù)以及AFP-L3與植物凝集素的親和結(jié)合作用，提供一種改進(jìn)的甲胎蛋白異質(zhì)體測(cè)定 系統(tǒng)。為了提高AFP-L3分離效果，實(shí)驗(yàn)從包被凝集素種類和濃度進(jìn)行優(yōu)化，獲得用于特異的 檢測(cè)甲胎蛋白異質(zhì)體的含量側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l。
[0054]基于上述的分離原理，將樣本墊固定有其它凝集素活化的乳膠微?？捎糜谄渌?蛋白的分離。
[0055]由于AFP-L3是甲胎蛋白的巖藻糖糖基化形式，因此欲實(shí)現(xiàn)對(duì)AFP-L3的定量測(cè)定， 需將其從甲胎蛋白中分離，然后進(jìn)行測(cè)定。而本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)便、快速的定量測(cè)定AFP-L3的側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)。其原理是利用樣本墊上固定的植物凝集素捕獲樣本中的 [0056] AFP-L3，使其與AFP-L1和AFP-L2分離，同時(shí)利用金標(biāo)側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)測(cè)定AFP-L1和 AFP-L2的濃度，進(jìn)而可以計(jì)算出樣本中AFP-L3的濃度。采用本發(fā)明所述的側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)檢 測(cè)液體樣本中的AFP-L3，操作簡(jiǎn)單、方便快速、成本低廉，結(jié)果準(zhǔn)確，AFP-L3分離與測(cè)定一步 實(shí)現(xiàn)，效率更高。
【附圖說明】
[0057]圖1為本發(fā)明所述側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)及其組成的示意圖。由左至右，從上至下依次由樣 本墊、結(jié)合墊、T線、C線、NC膜、吸水墊、PVC襯板、卡盒組成;流動(dòng)方向?yàn)橛勺笾劣?。樣本墊上 含有凝集素活化的乳膠微粒(MP-Lectin);結(jié)合墊上含有膠體金結(jié)合物(CG-Ab)。
[0058]圖2為NC膜T/C線包被示意圖。C線（對(duì)照線）為羊抗鼠抗體包被的NC膜;T線（檢測(cè) 線)為AFP抗體包被的NC膜。
[0059] 圖3為不同凝集素對(duì)糖蛋白糖鏈的特異性柱狀圖。橫坐標(biāo)為不同的凝集素:LPH:菜 豆凝集素;LCA:小扁豆凝集素;LUE:荊豆凝集素;ConA:刀豆凝集素?？v坐標(biāo)為凝集素對(duì)糖蛋 白糖鏈的特異性百分比（％)。
[0060] 圖4為不同濃度的凝集素活化的乳膠微粒(MP-LCA)包被條件下AFP-L3的結(jié)合效 率。橫坐標(biāo)為MP-LCA的濃度(ug/ml)，縱坐標(biāo)為AFP-L3的結(jié)合效率（％ )。
【具體實(shí)施方式】
[0061] 以下實(shí)施例用于進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明，這并不限制本發(fā)明的范圍。
[0062] 試劑與耗材
[0063] 乳膠顆粒：活性Latex MP(Latex MP):粒徑2.0wn，39510001，Merck;
[0064] 25mM MES(2-(N-嗎啉基）乙磺酸（sigma，M3671)緩沖液：稱取4.88gMES于900mL超 純水中，完全溶解后調(diào)節(jié)PH5.0,定容至1L。
[0065] 1-(3_二甲基氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺(EDC)購(gòu)自sigma，貨號(hào)39391;
[0066] 小扁豆凝聚素(LCA)購(gòu)自Sigma，貨號(hào)L9627;
[0067] LCA溶液：lmg/ml，溶于25mM MES緩沖液中，pH5 ? 0;
[0068] 菜豆（Phaseolus vulgaris)凝集素（LPH，Sigma_61764);
[0069] 荊ii(Ulexeuropaeus)凝集素（LUE，Sigma_L5505);
[0070] 刀豆（Canavaliaensiformis)凝集素（ConA，Sigma_61760);
[0071] pH7.5 lOmM PBS:稱取0.27g磷酸二氫鉀(KH2P04)(國(guó)藥，10017608) 1.42g磷酸氫 二鈉（Na2HP04)(國(guó)藥，100203008)，8g氯化鈉（NaCl)(國(guó)藥，10019308)、0.2g氯化鉀（KC1) (國(guó)藥，10016308)于900mL超純水中，完全溶解后調(diào)節(jié)pH至7.5，然后用容量瓶定容至1L。
[0072] 10mM Tris-HCl:稱取1.576g(國(guó)藥，xw020034)于900mL超純水中，完全溶解后調(diào)節(jié) 到所需的pH值，然后定容至1L。
[0073] 1 %檸檬酸緩沖液:稱取1. Og檸檬酸三鈉（國(guó)藥，10019428)于100mL超純水中，至完 全溶解。
[0074] EDC溶液:EDC(M= 191 ? 7g/mol)溶解于冷的25mM MES，pH5 ? 0中制得52mM，即 10mg/ ml的EDC溶液；
[0075] 膠體金(Colloidal Gold，CG);甲胎蛋白抗體(AFP抗體)購(gòu)自菲鵬生物公司；羊抗 鼠抗體購(gòu)自杭州啟泰公司；樣品墊(Fusion 5，GE);結(jié)合墊(NJ25)、吸水墊(CH37M)、PVC襯板 購(gòu)自上海金標(biāo)生物科技有限公司;NC膜（1358，]\1;1111。〇代)購(gòu)自組111。〇代公司 ；卡盒購(gòu)自金 燦華公司；BSA(amresco,0332) ;Tween_20(sigma，44112)
[0076]其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
[0077] 實(shí)施例1、本發(fā)明所述側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)及制備方法
[0078] (一）乳膠微粒（latex MP，Merck)制備步驟
[0079] 1、Latex MP活化
[0080] 取lmgLatex MP，用lmL 25mM MES(pH5.0)緩沖液洗滌3次(每次混勻lOmin);
[0081] 5) ?配制 10mg/mL EDC(M=191.7g/mol，C = 52mM)溶液(EDC溶解于冷的25mM MES， pH5.0)；(EDC,sigma,39391)
[0082] 6) ?將Latex MP用440yL 25mM MES(pH5.0)重懸。
[0083] 7).加入10yL EDC溶液，充分混勻，緩慢振搖，30min，RT;
[0084] 8).將反應(yīng)完成的離心管離心（3000rmp，5min)，去除上清，并用lmL 25mM MES，pH 5.0洗滌3次；
[0085] 2、Latex MP包被
[0086] 6) ?用300yL 25mM MES，pH 5.0重懸lmgLatex MP;
[0087] 7) ?加入5-12ul(優(yōu)選 10ul)5mg/ml LCA(25mM MES，pH5.0)溶液；
[0088] 8).用25mM MES，pH 5.0使反應(yīng)體系定容為500yL，充分混勻；
[0089] 9) ?緩慢振搖，室溫30-120min或4°C2小時(shí)；
[0090] 10).將反應(yīng)完成的離心管離心(3000rmp，5min)，去除上清得到小扁豆凝集素活化 的乳膠微粒，其中小扁豆凝聚素投料量與乳膠微粒的投料量比例為:25-70ug: lmg，優(yōu)選50: lmg;
[0091] 3、Latex MP洗滌和保存
[0092] 1) ?用500yL 25mM MES(pH 5.0)洗滌4次；
[0093] 2) ?加入 100yL 0.1-0.5%85八，30-601^11，1?1'(室溫）；
[0094] 3) ?用 100yL 50mM Tris-HCl(pH 6.8,含l%Tween-20)洗滌4次；
[0095] 4) ?加入lmL 5%BSA保存。
[0096](二)金標(biāo)結(jié)合物制備
[0097] 1)取 100mL 0.01%HAuC14溶液，加熱至沸騰。
[0098] 2)加入2.0mL 1%檸檬酸三鈉溶液，加熱攪拌15min。
[0099] 3)關(guān)掉加熱旋扭，適當(dāng)速度攪拌至室溫。
[0100] 1)量取20.0 mL的膠體金置于100.0 mL的小燒杯中，在攪拌的狀態(tài)下緩慢加入0.4mg AFP抗體，攪拌30min;
[0101] 3)加入5%BSA至終濃度為1%，繼續(xù)攪拌30min。
[0102] 4)以 12000r/min 離心 30min，棄去上清夜，用 PBST(PBS含 0.05%Tween-20)重懸； [0103] 5)以12000r/min離心30min，棄去上清夜，用PBST重懸；
[0104] 6)以12000r/min離心30min，棄去上清夜，沉淀用1 %BSA重懸，得到1. OmL濃縮物， 置4 °C冰箱備用。
[0105] (三)樣本墊、結(jié)合墊制備
[0106] 1)將樣品墊和結(jié)合墊用1%BSA浸泡30min，37°C烘干。
[0107] 2)將凝集素活化的乳膠微粒涂布于樣本墊，37°C烘干
[0108] 3)取膠體金結(jié)合物滴加到結(jié)合墊上（10uL/cm2)，37°C烘干。
[0109](四）T/C線(檢測(cè)線/對(duì)照線)包被
[0110] C線(對(duì)照線）：將lmg/mL羊抗鼠抗體包被NC膜C線(見圖2a、圖2b)，每條1 ? OyL，37°C 干燥。
[0111] T線（檢測(cè)線）：將1. Omg/mLAFP抗體包被NC膜（見圖2c、圖2d)，每條1. Oyg，37 °C干 燥。
[0112] (五)試劑盒組裝
[0113]將樣本墊、結(jié)合墊、NC膜、吸水墊沿液體層析方向由左至右依次排布;PVC襯板置于 上述樣本墊、結(jié)合墊、NC膜、吸水墊的下方用于支撐它們；卡盒包圍在所述樣本墊、結(jié)合墊、 NC膜、吸水墊和PVC襯板的外側(cè)用于保護(hù)它們，由此組裝形成本發(fā)明所述的側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng) (見圖1)，在本實(shí)施例中，所述側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)具體為層析試劑盒。
[0114](六)不同凝集素選擇
[0115] 由于不同的凝集素對(duì)糖蛋白糖鏈的親和力和特異性不同，因此凝集素種類選擇對(duì) 提高試劑盒的特異性尤為重要。實(shí)驗(yàn)對(duì)菜豆(Phaseolus vulgaris)凝集素（LPH)、小扁豆 (Lens culinaris)凝集素（LCA)、荊豆（Ulexeuropaeus)凝集素（LUE)、刀豆 (〇31^￥311361181；1；'〇1'11118)凝集素((]〇1^)進(jìn)行了對(duì)比試驗(yàn)，分別測(cè)定100例正常體檢樣本，計(jì) 算其特異性(特異性=檢測(cè)陰性樣本數(shù)/正常樣本數(shù)），特異性越接近于100%越好，結(jié)果得 出AFP-L3的最佳結(jié)合型凝集素為L(zhǎng)CA小扁豆凝集素(見圖3)。
[0116] 篩選方法如下：
[0117] 1)選用不同凝集素包被Latex MP，包被步驟同上；
[0118] 2)層析試紙條制備方法同上；
[0119] 3)加入100yL正常體檢血清(AFP濃度已知），RT，15min;
[0120] 4)然后用讀條儀即AFP濃度計(jì)算AFP-L3比例，若AFP-L3/AFP彡10 %則判定為陽性。
[0121] 實(shí)施例2、樣本墊固定MP-LCA涂布濃度選擇
[0122] 1、層析試紙條制備
[0123] 在本實(shí)施例中，本發(fā)明所述的側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)為層析試紙條，其樣本墊的制備方法 與實(shí)施例1步驟(三）中樣本墊制備方法相同，其中將不同濃度MP-LCA(0、0.1、0.5、2.5、10、 50ug/cm2)(以LCA濃度計(jì)算)涂布于樣本墊。
[0124] 2、不同濃度MP-LCA條件下AFP-L3的結(jié)合效率檢測(cè)
[0125] 1)加入100此含有不同濃度六？？-13(2、8、40、160、400叫/1111)的血清（4??濃度已 知），RT，15min;
[0126] 2)然后用讀條儀計(jì)算AFP-L3濃度，根據(jù)凝集素對(duì)不同濃度AFP-L3的結(jié)合能力[(實(shí) 際測(cè)定濃度/理論濃度）X100%。
[0127] 本實(shí)施例通過使用固定有不同涂布量的MP-LCA樣本墊制備的層析試紙，優(yōu)選出能 使結(jié)合效率在90%_110%之間的樣本墊固定MP-LCA涂布濃度范圍為2.5~50ug/cm 2,最佳 涂布濃度為10ug/cm2〇
[0128] 實(shí)施例3、采用本發(fā)明所述側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)進(jìn)行臨床樣本檢測(cè)
[0129] 所述側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)使用方法
[0131] 具體操作為：
[0132] 取實(shí)施例1所述的層析試劑盒或?qū)嵤├?所述的層析試紙條，在加樣點(diǎn)滴入lOOiiL 待測(cè)血清，室溫15min;
[0133] 然后在讀條儀(C10066-10,濱松)上讀出濃度值，根據(jù)所測(cè)樣本AFP濃度計(jì)算出樣 本中AFP-L3濃度(即AFP-L3濃度=樣本AFP濃度-層析試紙條讀值）。
[0134] 收集臨床樣本共324例，其中HCC(原發(fā)性肝癌)樣本103例，非HCC(慢性肝炎、肝硬 化)63例，正常人血清樣本例46。
[0135] 采用實(shí)施例1步驟(六)的方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表3所示：
[0136] 表3血清樣本分布
[0138]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明對(duì)于原發(fā)性肝癌的符合率達(dá)90.3%，在肝硬化中的特異性 高達(dá)84.8%，在肝炎中的特異性高達(dá)87.5%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于捕獲甲胎蛋白異質(zhì)體的小扁豆凝集素活化乳膠微粒，其特征在于，是通過 小扁豆凝集素活化而得，其中乳膠微粒與小扁豆凝集素的投料比例為lmg:25-6〇 Ug。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的小扁豆凝集素活化乳膠微粒，其特征在于，所述乳膠微粒的粒 徑2·0μηι〇3. 權(quán)利要求1或2所述小扁豆凝集素活化乳膠微粒的制備方法，包括如下步驟： (1) 乳膠微?；罨? 1) .取乳膠Latex MP，用ImL MES緩沖液洗滌去上清； 2) .將Latex MP用440yL MES緩沖液重懸。 3) .加入IOyL 10mg/mL EDC溶液，充分混勻，緩慢振搖，室溫30min; 4) .3000rmp，離心5min，去除上清，并用ImLMES緩沖液洗滌3次去上清得到活化的乳膠 微粒； (2) 乳膠微粒包被 1) .用300yL pH 5.0,25mM MES重懸ImgLatex MP; 2) .加入小扁豆凝集素溶液； 3) .用25mM MES使反應(yīng)體系定容為500yL，充分混勻； 4) .緩慢振搖，室溫30-120min或4 °C 2小時(shí)； 5) .離心去除上清得到小扁豆凝集素活化的乳膠微粒， 上述包被過程中，所述小扁豆凝集素與乳膠微粒的投料比例為25-60ug: lmg。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，所述小扁豆凝集素與乳膠微粒的投料比例為50ug: Img05. 用于定量檢測(cè)甲胎蛋白異質(zhì)體的側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)，沿層析方向依次包括:樣本區(qū)、結(jié)合 區(qū)； 其特征在于： 所述樣本區(qū)包含權(quán)利要求1或2所述的小扁豆凝集素活化的乳膠微粒，所述小扁豆凝集 素活化的乳膠微粒的使用量為2.5~50ug/cm2， 所述結(jié)合區(qū)涂布有膠體金結(jié)合物，所述膠體金結(jié)合物指膠體金標(biāo)記的甲胎蛋白抗體， 用于結(jié)合樣品中的甲胎蛋白。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)，其特征在于，還包括檢測(cè)區(qū)， 所述樣本區(qū)、結(jié)合區(qū)、檢測(cè)區(qū)沿層析方向依次排布； 所述檢測(cè)區(qū)設(shè)有檢測(cè)線和對(duì)照線； 所述檢測(cè)線包被有羊抗鼠抗體； 所述對(duì)照線包被有甲胎蛋白抗體； 所述檢測(cè)線和對(duì)照線垂直于層析方向且不重疊。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)，其特征在于，所述小扁豆凝集素活化的乳膠微 粒的使用量為10ug/cm2〇8. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)，其特征在于，所述甲胎蛋白抗體在所述膠 體金結(jié)合物中的濃度為〇. 4mg/ml; 所述羊抗鼠抗體濃度為lmg/mL; 所述甲胎蛋白抗體濃度為lmg/mL。9. 權(quán)利要求5 - 8任一所述的側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)的制備方法，其特征在于，包括制備樣本墊 和結(jié)合墊： 所述樣本墊上涂布有權(quán)利要求1或2所述的小扁豆凝集素活化的乳膠微粒； 所述結(jié)合墊涂布甲胎蛋白抗體的膠體金結(jié)合物。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于， 所述小扁豆凝集素活化的乳膠微粒在所述樣本墊上的涂布涂布濃度為2.5-50ug/cm2; 所述甲胎蛋白抗體在所述膠體金結(jié)合物中的濃度為〇. 4mg/ml。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK105891509SQ201610286029
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年5月3日
【發(fā)明人】肖智, 李全, 焦守恕
【申請(qǐng)人】同昕生物技術(shù)（北京）有限公司