專利名稱：酶聯(lián)免疫吸附elisa反應(yīng)板的再生方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA法)臨床診斷肝炎、愛滋病等病毒以及其它細菌、衣原體、原蟲感染所使用的反應(yīng)板、管、珠的再生重復(fù)使用方法及其相應(yīng)技術(shù)。
酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)是國內(nèi)外臨床診斷和實驗研究的一類重要技術(shù)，涉及到醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)等許多學(xué)科，其基本原理是利用抗原、抗體的特異性反應(yīng)、用已知的抗原(抗體)檢測未知的抗體(抗原)，在疾病的診斷和療效的觀察及預(yù)防醫(yī)學(xué)方面應(yīng)用尤為廣泛，如醫(yī)學(xué)上用以診斷爭鑒別診斷肝炎病毒(甲、乙、丙、丁、戊、庚型肝炎病毒)、愛滋病診斷及其它細菌、衣原體、原蟲感染的診斷。
運用ELISA法檢測的反應(yīng)板，目前用的較多的是國產(chǎn)產(chǎn)品，幾百元一塊，進口價格更貴。反應(yīng)板是將可溶性抗原或抗體吸附在固相載體上(如聚苯乙烯制成的反應(yīng)板、管、珠)。這是一種非特異性吸附，吸附很牢，稱之為“包被”，當(dāng)被檢樣品中有相應(yīng)的抗體或抗原，就會與吸附在反應(yīng)器上的已知抗原或抗體結(jié)合被連接在反應(yīng)板上，再用酶結(jié)合物(酶二抗標(biāo)記物或生物素、親和素系統(tǒng)、螢光素標(biāo)記物等)及其相應(yīng)底物顯示結(jié)果，其結(jié)果可以用肉眼觀察或更精確的用酶標(biāo)儀測定OD值。由于被檢樣品中的抗體或抗原與反應(yīng)器上的抗原或抗體的連接結(jié)合非常特異，用一般清洗液清洗不掉，因此，目前檢測一次樣品后，反應(yīng)板只好丟棄了，致使檢測成本較高。
本發(fā)明的目的就是為了克服上述反應(yīng)板用過一次不能再重復(fù)使用的缺點，根據(jù)ELISA基本原理，抗原與抗體結(jié)合雖然是非常特異，但不是通過離子鍵、共價鍵結(jié)合，而是通過很弱的短距力而結(jié)合，如范德瓦耳斯力、靜電引力、氫鍵及疏水性作用等，這些力在一定的外界條件下非常弱，以致抗原與抗體復(fù)合物解離，使抗原抗體的結(jié)合為可逆的化學(xué)反應(yīng)。關(guān)鍵是一定的外界條件，如降低反應(yīng)系統(tǒng)的PH值，用酸類，如硫酸、鹽酸、醋酸等與離子強度有機溶劑，如乙醚或尿素混合，使相互已結(jié)合的抗原抗體復(fù)合物重新離解，而不破壞影響已包被在反應(yīng)板、管、珠上的抗原或抗體的免疫反應(yīng)功能。根據(jù)上述原理，配制了一種復(fù)合清洗液、解離標(biāo)本中已結(jié)合到反應(yīng)板上的相應(yīng)抗體或抗原，恢復(fù)反應(yīng)板再結(jié)合下一次被檢物中的抗體或抗原的功能，其特異性、靈敏度不受影響。
本

發(fā)明內(nèi)容
包括復(fù)合清洗液的組成及配比以及操作步驟。復(fù)合清洗液主要為硫酸、鹽酸、醋酸中的任一種，濃度分別為0.25-1摩爾、0.5-2摩爾、0.5-2摩爾。在上述三種酸中還可分別加入乙醚(分析純，加入量為酸量的1/25-1/30)、尿素(總濃度10-50g/L)，乙醚與尿素混合，三種中的任一種。用配制好的復(fù)合清洗液按下列步驟清洗用過的反應(yīng)板a．把使用完的反應(yīng)板中的反應(yīng)液倒掉；b．加入300-400微升復(fù)合清洗液滿反應(yīng)孔，靜置1-10分鐘后倒掉；c．用PBS(硫酸鹽緩沖液)洗3次，每次間隔15-30秒。在多次用復(fù)合清洗液進行清洗反應(yīng)板，使其多次重復(fù)使用后，OD值會有所下降，操作時應(yīng)略加大底物和延長孵育時間，并在測定時加入質(zhì)控物。
實施例一，用廈門新創(chuàng)生產(chǎn)的抗-HIV試劑盒批號971113，按操作說明書，加底物顯色時間到后，吸出陽性、陰性對照孔及檢樣顯色孔，分別加入另一空白的酶標(biāo)板內(nèi)再加終止液、酶標(biāo)儀測0D值，判斷結(jié)果。原反應(yīng)板，各孔加入復(fù)各清洗液(0.5摩爾H2SO4100ml+3ml乙醚)，注滿反應(yīng)孔靜置5分鐘倒去。再用PBS緩沖液洗滌3次，每次間隔30秒，即可用以測定下一批標(biāo)本。如不在當(dāng)時用此板，可放4℃冰箱保存，一周內(nèi)結(jié)果不變，下次用時先拍干板，再按原法測定即可，循環(huán)二次以上，以后每次在最后一步加底物時每次較上一次多加5微升，放置時間延長3分鐘，每次測定加1-2孔質(zhì)控臨界值參考來確定循環(huán)的次數(shù)。
實施例二、廈門新創(chuàng)抗HCV試劑盒，批號971110、按操作說明書、加底物顯色時間到后，加終止液，酶標(biāo)儀測OD值判斷結(jié)果，之后即傾去原反應(yīng)液，加入復(fù)合清洗液(0.5摩爾HCl100ml與3ml乙醚及3g尿素混合)滿反應(yīng)孔，靜置10分鐘傾去，反復(fù)一次，再用PBS緩沖洗滌3次、即可用以測定下一批標(biāo)本，按原操作步驟測定即可。當(dāng)時不用，可放4℃冰箱二周以內(nèi)結(jié)果不變，每次加1-2孔質(zhì)控物作參考來確定循環(huán)的次數(shù)。
實施例三、洛陽華美生物公司抗-HGV試劑盒，按操作說明書，加底物顯色后加終止液、酶標(biāo)儀測OD值，判斷結(jié)果。之后即傾去原反應(yīng)液，加入復(fù)合清洗液(0.5摩爾HCl+3g尿素)注滿反應(yīng)孔靜置5分鐘傾去，再用PBS緩沖液洗滌3次，即可以測定下一批標(biāo)本。如不當(dāng)時用，置4℃冰箱二周內(nèi)結(jié)果不變，每次測定加1-2孔質(zhì)控物，作參考來確定循環(huán)次數(shù)。以上各種方法的酶質(zhì)結(jié)合物自配后要作預(yù)試驗以確定最佳效價，底物等按一般常規(guī)法配制即可。
本發(fā)明同樣適合于用ELISA方法制作的反應(yīng)管和反應(yīng)珠。本發(fā)明為所有使用ELISA方法的試驗及診斷技術(shù)，開辟了充分利用資源、降低成本的新途徑。由于配制的清洗液成本很低，制作方便、效果明顯，將為廣大醫(yī)務(wù)單位所采用。
權(quán)利要求
1.酶聯(lián)免疫吸附ELISA反應(yīng)板的再生方法，其特征是用一種復(fù)合清洗液將使用過的ELISA反應(yīng)板清洗，解離標(biāo)本中已結(jié)合到反應(yīng)板上的相應(yīng)抗體或抗原，恢復(fù)反應(yīng)板再結(jié)合下次被檢標(biāo)本中的抗體或抗原，復(fù)合清洗液主要為硫酸、鹽酸、醋酸中的任一種，濃度分別為0.25-1摩爾、0.5-2摩爾、0.5-2摩爾。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫吸附ELISA反應(yīng)板的再生方法，其特征是在上述酸中還分別加入乙醚(分析純，加入量為酸量的1/25-1/30)、尿素(總濃度10-50g/L)，乙醚與尿素混合，三種中的任一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫吸附ELISA反應(yīng)板的再生方法，其特征是用配制好的復(fù)合清洗液按下列步驟清洗用過的反應(yīng)板a、把使用完的反應(yīng)板中的反應(yīng)液倒掉；b、加入300-400微升復(fù)合清洗液滿反應(yīng)孔，靜置1-10分鐘后倒掉；c、用PBS(硫酸鹽緩沖液)洗3次，每次間隔15-30秒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的酶聯(lián)免疫吸附ELISA反應(yīng)板的再生方法，其特征是在多次用復(fù)合清洗液進行清洗反應(yīng)板，使其多次重復(fù)使用后，OD值會有所下降，操作時應(yīng)加大底物和延長孵育時間，并在測定時加入質(zhì)控物。
全文摘要
本發(fā)明涉及用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA法)臨床診斷肝炎、愛滋病等病毒以及其它細菌、衣原體、原蟲感染所使用的反應(yīng)板、管、珠的再生重復(fù)使用方法及其相應(yīng)技術(shù)。為了克服上述反應(yīng)板用過一次不能再重復(fù)使用的缺點，配制了一種以硫酸或鹽酸或醋酸為主再加入適量乙醚或尿素的復(fù)合清洗液，解離標(biāo)本中已結(jié)合到反應(yīng)板上的相應(yīng)抗體或抗原，恢復(fù)反應(yīng)板再結(jié)合下一次被檢物中的抗體或抗原的功能，其特異性、靈敏度不受影響。
文檔編號G01N33/53GK1239225SQ9811135
公開日1999年12月22日 申請日期1998年6月12日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月12日
發(fā)明者徐樹良 申請人:南京紅十字血液中心