專(zhuān)利名稱(chēng)：酶檢測(cè)方法
競(jìng)爭(zhēng)性檢測(cè)方法，例如免疫檢測(cè)法和免疫測(cè)量檢測(cè)法在臨床化學(xué)中應(yīng)用廣泛。這些方法所達(dá)到的專(zhuān)一性和靈敏度是其他分析方法很難或不可能與之比擬的。但仍有兩條理由需進(jìn)一步提高這種檢測(cè)法的專(zhuān)一性。首先，某些感興趣的分析物是以極低的濃度存在的。其次，更靈敏的檢測(cè)法能用來(lái)更迅速地測(cè)試濃度更高的分析物。人們已經(jīng)作出了一些努力，企圖通過(guò)使用放射性標(biāo)記試劑、熒光或化學(xué)發(fā)光試劑等最大限度地提高檢測(cè)靈敏度。但迄今為止，都沒(méi)能使靈敏度、重復(fù)性和簡(jiǎn)易性理想地結(jié)合起來(lái)。
提高檢測(cè)靈敏度的一種可選擇的策略是采用放大步驟，即使所產(chǎn)生的在化學(xué)計(jì)量上不多于分析物的產(chǎn)物去產(chǎn)生濃度顯著升高的第二產(chǎn)物，然后觀察第二產(chǎn)物。文獻(xiàn)中廣泛描述了將酶用于此目的的情況。使酶反復(fù)作為催化劑作用，能使放大作用達(dá)到成百上千倍。
從原理上說(shuō)，使用連續(xù)的雙酶體系能夠達(dá)到進(jìn)一步的放大效果，但實(shí)際上這是很難達(dá)到的。A.Johannsson等人(JournalofImmunologicalMethods，87(1986)7-11)描述了TSH的檢測(cè)法，第一催化步驟是NADP脫磷酸而產(chǎn)生NAD，NAD通過(guò)催化作用活化一個(gè)專(zhuān)一的氧化還原循環(huán)，從而產(chǎn)生一種可以觀察的、色彩濃重的化合物。此方法的缺點(diǎn)是使用了體內(nèi)發(fā)生的不穩(wěn)定酶，并涉及到NADP/NAD，因此樣品中含有這些物質(zhì)時(shí)不能被采用。
YolkenR.H.(Rev.Infec.Dis，4，(1982)35-68)描述了一種用補(bǔ)體進(jìn)行放大的免疫檢測(cè)法，該方法依賴(lài)于非特異的補(bǔ)體逐級(jí)活化系統(tǒng)，而且其組分很難于分離。
EPA75379(Syva)和EPA152254(DuPont)描述的免疫檢測(cè)法都涉及在固相上結(jié)合兩種酶，其中之一與分析物的濃度成比例，一種酶的產(chǎn)物是另一酶的底物。
EPA180327(Amoco)描述的免疫檢測(cè)系統(tǒng)涉及這樣的酶，其反應(yīng)產(chǎn)物能以不同于底物的(液)相存在。
本發(fā)明的檢測(cè)法至少使用一種，在其優(yōu)選方案中是使用兩種或更多種酶放大步驟。而且，在其優(yōu)選方案中，本方法所需要的試劑很容易得到或制備，而且它們?cè)谑褂闷陂g內(nèi)保持穩(wěn)定。
本發(fā)明提供了檢測(cè)樣品中分析物的方法，即通過(guò)使用第一酶及與該酶能夠作用的第一底物從而產(chǎn)生第一產(chǎn)物，該方法包括下述步驟a)使樣品進(jìn)入檢測(cè)程序，從而以預(yù)定狀態(tài)和相關(guān)于樣品中分析物濃度的量產(chǎn)生第一酶，b)使預(yù)定狀態(tài)中的第一酶在合適條件下與第一底物接觸，以產(chǎn)生其數(shù)量相關(guān)于樣品中分析物濃度的第一產(chǎn)物。
c)使步驟b)產(chǎn)生的第一產(chǎn)物在合適條件下與第一產(chǎn)物的特異性結(jié)合劑接觸，從而使二者結(jié)合在一起，以確定第一產(chǎn)物的存在或其量。
d)利用C的結(jié)果確定樣品中分析物的存在或濃度。
分析物的本質(zhì)并不重要。分析物可以例如是半抗原或抗原或抗體，例如激素、類(lèi)固醇、藥物或藥物代謝物、蛋白質(zhì)、核酸、維生素或多糖。
樣品的本質(zhì)也不重要，樣品可以是生物液體，例如血清、血漿，尿或奶。
第一酶的功能是作用于第一底物，以產(chǎn)生具有特性的第一產(chǎn)物，從原理上說(shuō)，此酶的例子可以在酶的所有主要類(lèi)型中找到。因此，第一酶可以是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、裂解酶、異構(gòu)酶、連接酶或水解酶。在最后一類(lèi)酶中，有一些是特別重要的，例如糖苷酶、磷酸酶、硫酸酯酶、酯酶和脂酶。
第一底物的功能是被第一酶作用以產(chǎn)生具有特性的第一產(chǎn)物，因此，第一底物的選擇受第一酶選擇的支配。
本發(fā)明的一個(gè)重要特征即第一酶對(duì)第一底物的這種作用所產(chǎn)生的第一產(chǎn)物具有與抗體(或其它專(zhuān)一性結(jié)合劑)結(jié)合的抗原決定簇(或其它結(jié)合域)，該決定簇可用信號(hào)發(fā)生系統(tǒng)(或其組分)進(jìn)行標(biāo)記。
標(biāo)記的專(zhuān)一性結(jié)合劑的主要功能是與第一產(chǎn)物專(zhuān)一性結(jié)合。第一產(chǎn)物和專(zhuān)一性結(jié)合劑可形成一個(gè)免疫對(duì)，其中一個(gè)是抗原，另一個(gè)則是抗體，或兩者可形成某些其它的專(zhuān)一性結(jié)合系統(tǒng)，例如抗生素蛋白或抗生蛋白鏈菌素-生物素系統(tǒng)。重要的是，標(biāo)記的專(zhuān)一性結(jié)合劑與第一底物不發(fā)生顯著反應(yīng)。最好是完全不反應(yīng)。因此，第一產(chǎn)物應(yīng)當(dāng)具有自己的特性，它能夠被專(zhuān)一性結(jié)合劑從與之不同的第一底物中識(shí)別出來(lái)并與之結(jié)合。
標(biāo)記的專(zhuān)一性結(jié)合劑的標(biāo)記物可以是常用于競(jìng)爭(zhēng)性檢測(cè)的任一種標(biāo)記物。例如，標(biāo)記物可以是放射性同位素、熒光物質(zhì)或能夠發(fā)光、產(chǎn)生電化學(xué)或色度信號(hào)的酶系統(tǒng)中的一員。但標(biāo)記物最好是第二酶，它可與第一酶相同，或最好是不同的。這樣就能在檢測(cè)系統(tǒng)中引入第二步放大作用，這一點(diǎn)下面將予以詳述。
本方法的第一步驟涉及使樣品進(jìn)入檢測(cè)程序，從而以預(yù)定狀態(tài)和相關(guān)于樣品中分析物濃度的濃度產(chǎn)生第一酶。為此目的，使酶附著于分析物本身或一種檢測(cè)試劑，一般是分析物的類(lèi)似物或該分析物的專(zhuān)一性結(jié)合劑(例如抗體)現(xiàn)有文獻(xiàn)詳述了酶與這種試劑的結(jié)合，同時(shí)不損害酶的性質(zhì)。產(chǎn)生酶的預(yù)定狀態(tài)可以很方便地是溶液(在此狀態(tài)，可將它容易地從與固體表面結(jié)合的酶中分離出來(lái))，或使它結(jié)合于固體表面(在此狀態(tài)，可將它容易地與溶液中的酶分離開(kāi)來(lái))。
現(xiàn)在，通過(guò)實(shí)例來(lái)描述本發(fā)明方法中步驟a的幾種檢測(cè)程序。一個(gè)專(zhuān)業(yè)讀者將會(huì)容易地設(shè)計(jì)出其他程序，在這些實(shí)例中，為了簡(jiǎn)明起見(jiàn)，假設(shè)分析物是抗原，而其專(zhuān)一性結(jié)合劑是抗體，但正如上述，本發(fā)明并不受此限制。
A.試劑是與基質(zhì)結(jié)合形成的分析物類(lèi)似物，用酶標(biāo)記的分析物的抗體存在于溶液中。在第一步中，使溶液中的酶標(biāo)抗體與結(jié)合于基質(zhì)上的分析物類(lèi)似物接觸，使其與之結(jié)合。通過(guò)洗滌去除多余的溶液。然后，使液體樣品與結(jié)合在基質(zhì)上的分析物類(lèi)似物/抗體復(fù)合物保溫。樣品中的分析物與基質(zhì)上的分析物類(lèi)似物為結(jié)合在抗體上競(jìng)爭(zhēng)。其結(jié)果是，分析物/酶標(biāo)抗體復(fù)合物被釋放至溶液中，其濃度與樣品中分析物濃度成正比。此溶液然后用于本方法的下一步驟。
還殘留有與基質(zhì)結(jié)合的分析物類(lèi)似物/標(biāo)記抗體復(fù)合物，其濃度與樣品中分析物濃度成反比?？梢赃x擇的另一途徑是，棄去保溫后產(chǎn)生的溶液，而在步驟b中代之使用與基質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)。
B.試劑是與基質(zhì)結(jié)合的針對(duì)分析物的抗體，酶標(biāo)記的分析物類(lèi)似物存在于溶液中。在第一步中，使溶液中的酶標(biāo)記分析物類(lèi)似物與基質(zhì)結(jié)合的抗體接觸，使其與之結(jié)合，通過(guò)洗滌去除多余的溶液。然后，使樣品與基質(zhì)結(jié)合的抗體/標(biāo)記的分析物類(lèi)似物復(fù)合物保溫。樣品中的分析物與標(biāo)記的分析物類(lèi)似物競(jìng)爭(zhēng)與抗體的結(jié)合，從而將一部分標(biāo)記的分析物類(lèi)似物釋放至溶液中。產(chǎn)生的溶液可用于步驟b，其中含有的酶標(biāo)分析物類(lèi)似物濃度與樣品中分析物濃度成正比。
與A中所述相似，也可棄去溶液而代之使用固相。
C.試劑與A中的相同，但反應(yīng)順序不同，在第一步，使樣品與酶標(biāo)抗體的溶液保溫，第二步使得到的混合物與基質(zhì)結(jié)合的分析物類(lèi)似物接觸。
另外，也可同時(shí)在與基質(zhì)結(jié)合的分析物類(lèi)似物中加入樣品和酶標(biāo)記抗體溶液，從而通過(guò)一次保溫完成全過(guò)程。
D.試劑與B中的相同，但反應(yīng)順序不同。在第一步，使樣品與酶標(biāo)分析物類(lèi)似物溶液保溫。在第二步，使產(chǎn)生的混合物與基質(zhì)上的抗體接觸。
另外，也可同時(shí)在與基質(zhì)結(jié)合的抗體中加入樣品和酶標(biāo)的分析物類(lèi)似物溶液，從而通過(guò)一次保溫完成全過(guò)程。
E.此方案的選擇只有在分析物具有多決定簇，即有幾個(gè)位點(diǎn)可進(jìn)行免疫結(jié)合時(shí)才有可能。試劑是與基質(zhì)結(jié)合的針對(duì)分析物的第一抗體;針對(duì)分析物的酶標(biāo)記的第二抗體存在于溶液中。本方法涉及使這兩種試劑與樣品保溫，采用一步或任意順序的兩步都行。結(jié)果產(chǎn)生基質(zhì)-(第一抗體)-(分析物)-(酶標(biāo)記的第二抗體)的夾層結(jié)構(gòu)。固相上酶標(biāo)第二抗體的量與樣品中分析物的量成正比。溶液中酶標(biāo)第二抗體的量與樣品中的分析物量成反比。溶液或者固相都可用于步驟b。
步驟a的功能之一是將酶標(biāo)記的試劑分成兩個(gè)部分。然而，并不是一定要使其中之一在液相中，而另一個(gè)與固相結(jié)合。實(shí)際上，對(duì)該兩個(gè)部分的物理分離并不是總是必須的。有可能設(shè)計(jì)這樣一個(gè)系統(tǒng)，其中使某一部分的酶鈍化，而另一部分則不。下面列出了其它一些系統(tǒng)。
F.檢測(cè)捕獲于基質(zhì)中的微生物，并且使用酶標(biāo)記的抗體。
G.量桿似方法，其中，使酶標(biāo)抗體或抗原作為對(duì)分析物存在的應(yīng)答而移至另一區(qū)帶。
本發(fā)明方法的步驟b包括在產(chǎn)生第一產(chǎn)物的條件下，使預(yù)定狀態(tài)的第一酶(即所選擇的酶標(biāo)試劑部分)與一定量的第一底物接觸產(chǎn)生第一產(chǎn)物。如果第一酶在溶液中，則通常最好以與固體基質(zhì)或其它物質(zhì)結(jié)合的形式提供底物。這樣能使其方便地從上清液中分離出來(lái)，以利于本方法的后續(xù)步驟。第一底物可包括由某基團(tuán)掩蔽的第一產(chǎn)物，通過(guò)酶的作用去除該基團(tuán)后產(chǎn)生第一產(chǎn)物。
根據(jù)已經(jīng)完全確立的化學(xué)方法，可為此目的制備固定化的和可固定底物。這種底物的一般結(jié)構(gòu)可由下式表示X-O-A-L-M其中X是根據(jù)所用的酶選擇的糖基、磷酸酯、二磷酸酯、硫酸酯或其它殘基;
O通常是，但不一定是羥基功能團(tuán)，但也可以是例如氨基、羧基或巰基;
A可以是例如芳香核、雜環(huán)中心的一部分、肽或類(lèi)固醇，由酶去掉X后產(chǎn)生;
L是一種化學(xué)橋鍵，通過(guò)雙功能偶聯(lián)劑例如戊二醛、二酰肼、氨基酸、6-氨基己酸、二酰亞胺酯而形成;以及M可以是大分子載體如載體蛋白可溶性多糖或酶、或固體基質(zhì)如玻璃、塑料、多聚物陶瓷或紙表面，或顆?；|(zhì)如多糖或多聚物，或化學(xué)物質(zhì)如半抗原或抗原決定簇。
參見(jiàn)附圖，

圖1a，1b和1c是根據(jù)上述命名法給出的底物實(shí)例。
在圖1a中X是半乳糖;
A是熒光素L是來(lái)自戊二醛M是載體蛋白如牛血清清蛋白在圖1b中X是半乳糖A是7-羥基-4-甲基-香豆素-3-乙酸L是6-氨基己酸M是載體蛋白如牛血清清蛋白在圖1c中X是半乳糖A是雌酮L是N-(O-羧甲基)肟M是載體蛋白如牛血清清蛋白將糖苷殘基導(dǎo)入結(jié)構(gòu)A的羥基時(shí)，可根據(jù)Koenigs-Knorr反應(yīng)的一般原理進(jìn)行?？稍诤线m條件下，使四-O-乙酰基-α-D-半乳糖吡喃糖基溴化物與羥基-A反應(yīng)。可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)方法利用酸/堿萃取步驟及硅膠柱層折分離最終產(chǎn)物。下面的實(shí)例1-3描述了以溶液的和與基質(zhì)結(jié)合的兩種形式制備第一底物，EPA28332也提供了有關(guān)信息。
以與基質(zhì)結(jié)合的形式提供第一底物的優(yōu)點(diǎn)是本檢測(cè)法中的步驟a和b可以在一個(gè)容器中完成而無(wú)需傾倒或洗滌。缺點(diǎn)是基質(zhì)上的底物與第一酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)可能很慢。在此缺點(diǎn)確成問(wèn)題的情況下，可以推薦在溶液中提供第一底物的方式。在這種情況下，第一酶可以在溶液中或以與基質(zhì)結(jié)合的形式產(chǎn)生。饌扔牖式岷系男問(wèn)講諞幻父獎(jiǎng)恪 將預(yù)定狀態(tài)中的第一酶與第一底物一起保溫以產(chǎn)生第一產(chǎn)物。這是本方法的第一步放大作用。必須同時(shí)考慮第一底物的量、保溫的時(shí)間和其他條件，以確保所產(chǎn)生的第一產(chǎn)物的濃度不僅被放大而且還與起始樣品中分析物的濃度相關(guān)。換句話說(shuō)，不能使第一酶和第一底物間的反應(yīng)進(jìn)行完全，以便在此步結(jié)束時(shí)得到的是第一底物和第一產(chǎn)物的混合物。
在本方法的步驟c中，使第一產(chǎn)物在合適條件下與標(biāo)記的專(zhuān)一性結(jié)合劑接觸，從而使二者結(jié)合在一起，以這種方式測(cè)定第一產(chǎn)物的存在或數(shù)量。如何測(cè)定不是本發(fā)明的主題，現(xiàn)有文獻(xiàn)中描述了多種不同的技術(shù)。如果第一底物是以與基質(zhì)結(jié)合的形式提供的，這一步通常包括使標(biāo)記的專(zhuān)一性結(jié)合劑與第一產(chǎn)物和未反應(yīng)的殘留的第一底物的混合物保溫。如上面所指出的，本方法成功的關(guān)鍵是標(biāo)記的專(zhuān)一性結(jié)合劑與第一底物不應(yīng)有顯著反應(yīng)，最好是根本不發(fā)生反應(yīng)。為此目的對(duì)第一產(chǎn)物和第一底物進(jìn)行的設(shè)計(jì)，在某種程度上說(shuō)是反復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果，當(dāng)然，試驗(yàn)是根據(jù)已知的原理進(jìn)行的，利用多克隆抗體作為專(zhuān)一性結(jié)合劑，我們已使交義反應(yīng)活性降到0.018%以下，而且如果使用單克隆抗體，期望此數(shù)據(jù)將進(jìn)一步顯著下降。
如果在溶液中提供第一底物，因而導(dǎo)致在溶液中產(chǎn)生第一產(chǎn)物，那么最好在步驟c之前就使二者分離。這一點(diǎn)可通過(guò)使用過(guò)量的與基質(zhì)結(jié)合的抗體(或其他專(zhuān)一性結(jié)合劑)完成，即使基質(zhì)上的抗體與第一產(chǎn)物(通過(guò)第一酶作用于單一底物產(chǎn)生)上的抗原決定簇(或其他結(jié)合位點(diǎn))結(jié)合。傾出含有殘留的第一底物的上清液并洗滌固相。然后，最好是通過(guò)使用標(biāo)記有信號(hào)發(fā)生系統(tǒng)(或其組分)的另一抗體(或其他的專(zhuān)一性結(jié)合劑)，使一標(biāo)記試劑與基質(zhì)上的第一產(chǎn)物結(jié)合。
在步驟c的保溫之后，通常有必要將與第一產(chǎn)物結(jié)合的標(biāo)記的專(zhuān)一性結(jié)合劑從未結(jié)合的部分分離出來(lái)。如果第一產(chǎn)物固定在固定基質(zhì)上，通過(guò)傾倒和洗滌就可容易地完成這種分離作用。如果第一產(chǎn)物產(chǎn)生于溶液中，則可能需要某種其他的分離技術(shù)，另外，對(duì)于某些標(biāo)記系統(tǒng)無(wú)需進(jìn)行物理分離，例如，可通過(guò)某種途經(jīng)使結(jié)合(或未結(jié)合)于第一產(chǎn)物的標(biāo)記物掩蔽起來(lái)或鈍化。
必須測(cè)定結(jié)合或未結(jié)合于第一產(chǎn)物的標(biāo)記物。對(duì)于定量檢測(cè)來(lái)說(shuō)，這一步包括測(cè)定結(jié)合或未結(jié)合標(biāo)記物的濃度。根據(jù)所用標(biāo)記物的性質(zhì)，進(jìn)行這種測(cè)定的技術(shù)在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，本文不擬描述。在實(shí)施本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，如果標(biāo)記物是第二酶(不同于第一酶，且不與第一底物反應(yīng))，此測(cè)定過(guò)程包括第二步放大作用。因此，一分子結(jié)合的第二酶作用于第二底物的許多分子，在溶液中產(chǎn)生許多分子的第二產(chǎn)物，然后通過(guò)例如發(fā)光、熒光或色度變化觀察第二產(chǎn)物，在這些情況下，必須提供過(guò)量的第二底物，并應(yīng)當(dāng)在預(yù)定條件下以預(yù)定時(shí)間與結(jié)合的酶進(jìn)行保溫。
本方法的步驟d包括使用步驟c的結(jié)果確定樣品中分析物的存在或濃度。這通常是通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線完成的。用本方法測(cè)定含有已知濃度分析物的標(biāo)準(zhǔn)樣品，這些濃度覆蓋預(yù)期的未知分析物的范圍。用此結(jié)果作出信號(hào)強(qiáng)度對(duì)分析物濃度的曲線圖。測(cè)定了一個(gè)未知樣品的信號(hào)強(qiáng)度后，可簡(jiǎn)單地從圖上讀出該樣品中的分析物濃度。
下列實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例1二-半乳糖基熒光素胺-半琥珀酸的制備與性質(zhì)熒光素胺(1g，2.9毫摩爾)和琥珀酸酐(400mg，4毫摩爾)在50mlTHF中回流4小時(shí)。去掉溶劑以后，在殘留物中加入100ml0.5MHCl。冰上放置1小時(shí)，然后加入200ml乙酸乙酯，以溶解所出現(xiàn)的大量沉淀物。
用酸和水洗滌有機(jī)層，在Na2SO4上干燥，使體積降至熒光素胺-半琥珀酸(FAHS)開(kāi)始沉淀為止。使沉淀過(guò)程在低溫下繼續(xù)進(jìn)行，然后用冷乙酸乙酯洗滌產(chǎn)物并進(jìn)行真空干燥。
使熒光素胺半琥珀酸(500mg，1.1毫摩爾)和乙酰溴-α-D-半乳糖(2g，4.9毫摩爾)在4g無(wú)水K2CO4存在的條件下與干丙酮(50ml)和甲醇(5ml)的混合物回流24小時(shí)，通過(guò)乙酸乙酯∶甲醇(80∶20)的TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)。
反應(yīng)后使混合物冷卻，過(guò)濾并去除溶劑。然后用無(wú)水乙酸乙酯∶二乙基醚混合物(50∶50)洗滌殘留物，以除去多余的溴糖，將殘?jiān)萌肜涞?.1MNaHCO3中，用乙酸乙酯洗滌，置于冰上酸化，萃取入乙酸乙酯中，用水洗滌。然后使有機(jī)層干燥，去除溶劑以后，混合物在干燥器中在真空下放置過(guò)夜。得到的油狀殘留物溶于15ml分析純甲醇中并置于冰上冷卻，加入200μl1M的甲氧化鈉，1小時(shí)后加入100ml乙酸乙酯∶二乙基醚(50∶50)的混合物。將其置于低溫中過(guò)夜以使產(chǎn)物沉淀。沉淀用冷乙醚和乙酸乙酯洗滌多次，然后干燥。此物質(zhì)是幾乎純的底物。通過(guò)用乙酸乙酯萃取此底物的酸化水溶液而除去微量的熒光素。中和提純的產(chǎn)物后進(jìn)行冰凍干燥。
在評(píng)價(jià)其作為β-半乳糖苷酶底物的性能之前，用掃描分光光度計(jì)觀測(cè)二-半乳糖苷基熒光素胺-半琥珀酸，以鑒別其最大吸收的波長(zhǎng)。利用已知濃度的基本液，測(cè)定糖苷配基在490nm處的初級(jí)摩爾消光系數(shù)大約為38000。用紫外光檢測(cè)表明，在糖苷配基和熒光弱得多的二-半乳糖苷的熒光之間存在非常顯著的差別。
為了證實(shí)底物的水解作用，利用β-半乳糖糖苷酶在PH7.3進(jìn)行時(shí)間進(jìn)程實(shí)驗(yàn)，最終的底物濃度為2.7mM。在490nm處監(jiān)測(cè)光吸收的上升以測(cè)定糖苷配基的形成。
底物(200μl，濃度為4mM，在50mM Tris緩沖液PH7.3，0.1M NaCl，1mM MgCl2中)和大腸桿菌β-半乳糖苷酶(100μl，0.28單位)于37℃以不同時(shí)間保溫。加入0.5ml冰冷卻的0.5M CO3/HCO3緩沖液PH9.5終止反應(yīng)，在490nm處讀取反應(yīng)混合物的吸光度。得到的曲線斜率表明，在此條件下每分鐘產(chǎn)生74微微摩爾產(chǎn)物。
由于二-半乳糖苷基-FAHS作為β-半乳糖苷酶底物表現(xiàn)出明顯的活性，因此，利用3H-熒光素示蹤物評(píng)價(jià)此底物與其糖苷配基的交叉反應(yīng)活性。結(jié)果表明，雖然抗熒光素的抗血清能很容易地識(shí)別糖苷配基并與之結(jié)合，但卻不容易識(shí)別完整底物并與之結(jié)合。
為了抑制50%的3H-示蹤物與適當(dāng)稀釋的抗熒光素抗血清的結(jié)合，需要加入45倍摩爾過(guò)量的FAHS，因此在所測(cè)試的范圍內(nèi)，二-半乳糖苷基-FAHS不能抑制這種結(jié)合。此底物的交叉反應(yīng)活性因此低于糖苷配基的0.45%
實(shí)例2二-半乳糖基-熒光素胺-HS與AH-瓊脂糖的偶聯(lián)。
將1gAH-瓊脂糖4B經(jīng)溶脹洗滌后懸浮于10ml0.01M磷酸緩沖液PH6.8中。懸浮液中加入209mg實(shí)例1的底物和400mgCMC，滾動(dòng)24小時(shí)以使其混合，再加入200mgCMC，使反應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行24小時(shí)。利用常規(guī)的低和高PH條件洗滌該凝膠，然后保存于PBS中。它具有明顯的黃色。為了測(cè)試瓊脂糖上的底物是否能受到酶的水解作用，用一系列20μl50%的底物-瓊脂糖懸浮液的等分試樣與或不與β-半乳糖苷酶保溫過(guò)夜。在同樣的試管中進(jìn)行的RIA表明，測(cè)試樣品與示蹤物的結(jié)合達(dá)27%，而對(duì)照樣品與示蹤物的結(jié)合為45%。此結(jié)果清楚表明，AH-瓊脂糖上的底物能夠受到酶的水解作用。
實(shí)例3單-半乳糖苷-熒光素底物根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法制備硝基熒光素。通過(guò)在過(guò)量甲醇中和存在有1%濃H2SO4的條件下回流硝基熒光素而制備甲基酯在苯-四氫呋喃混合物中和存在有碳酸銀(催化劑)和硫酸鈣(內(nèi)部干燥劑)的條件下，利用四乙?；宕肴樘菍肴樘菍?dǎo)入硝基熒光素-甲基酯的剩余的游離的功能羥基上。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的甲基化方法，利用二甲基硫酸酯和0.1NNaOH制備硝基熒光素甲基酯的甲氧基衍生物。去掉酯后產(chǎn)生單甲氧基-硝基熒光素。如上述方法導(dǎo)入半乳糖。
由上述步驟能夠產(chǎn)生三種可能的單半乳糖苷硝基熒光素衍生物(A)、(B)和(C)。(參見(jiàn)圖2)。
使功能硝基還原的話，則所通過(guò)產(chǎn)生的氨基進(jìn)一步修飾。
實(shí)例4烏本苷-胎球蛋白結(jié)合物的制備利用高碘酸氧化/Schiffs堿法制備烏本苷-胎球蛋白的結(jié)合物。含有10.8μCi3H-異羥基毛地黃毒苷的烏本苷(200mg)用偏高碘酸鈉于室溫下氧 小時(shí)，然后與110mg胎球蛋白在PH9-9.5于室溫下進(jìn)一步反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)產(chǎn)物與137mg氫硼化鈉反應(yīng)4小時(shí)而穩(wěn)定化，在水中透析6天(換5次水，每次5升)，冷凍干燥以減少體積，最后在Sephadex G50上進(jìn)行凝膠過(guò)濾，以去除殘留的未結(jié)合的微量烏本苷。
實(shí)例5放大式免疫檢測(cè)法完整程序的演示選擇ELISA法來(lái)說(shuō)明以放大作用為基礎(chǔ)的完整的反應(yīng)順序。下面所用的烏本苷-胎球蛋白合成法見(jiàn)于實(shí)例4。
在進(jìn)行檢測(cè)的準(zhǔn)備工作時(shí)，首先預(yù)包膜兩塊PVC ELISA平板。對(duì)于第一塊平板(平板1)，平板的孔用烏本苷-胎球蛋白或單用胎球蛋白(10μg，在100μl包膜緩沖液中)于4℃包膜過(guò)夜。然后用洗滌緩沖液洗滌平板3次，每孔中加入β-半乳糖苷酶結(jié)合的抗異羥基毛地黃毒苷IgG(100μl;來(lái)自上述的結(jié)合物以1+1進(jìn)行洗滌緩沖液稀釋)。37℃下2小時(shí)后，從平板上洗去多余的抗體-酶結(jié)合物(用洗滌緩沖液洗3次)。
第二塊平板(平板2)的孔單用BSA(100μl 1mg/ml在包膜緩沖液中)或BSA-香豆素-β-半乳糖苷(100μl;1mg/ml在包膜緩沖液中)于4℃包膜過(guò)夜。在既將使用時(shí)，平板用包膜緩沖液洗滌3次，然后用β-半乳糖苷酶檢測(cè)緩沖液(0.1M磷酸鈉緩沖液PH7.1，0.1MNaCl，10mM MgCl2)再洗一次。
如下述進(jìn)行檢測(cè)，在平板1的每個(gè)含有烏本苷-胎球蛋白抗原的孔中加入異羥基毛地黃毒苷溶液(1ng/ml-1mg/ml，在150μlPBS中)。37℃下1小時(shí)后攪拌每一個(gè)孔中的內(nèi)容物，每孔的上清樣品(100μl)轉(zhuǎn)移至平板2的含有固定化BSA-香豆素-β-半乳糖苷(和50μlβ-半乳糖苷酶檢測(cè)緩沖液)的孔中。在含有固定化BSA(和50μlβ-半乳糖苷酶檢測(cè)緩沖液)的平板2的孔中加入100μlPBS。
37℃下2小時(shí)后，平板2用洗滌緩沖液洗滌2次，每孔中加入堿性磷酯酶結(jié)合的抗香豆素IgG(100μl，用洗滌緩沖液以1∶4稀釋)。平板于37℃保溫1.5小時(shí)，然后用洗滌緩沖液洗滌3次，以從平板的孔中去除未結(jié)合的抗體-酶結(jié)合物。在每一孔中加入堿性磷酯酶底物溶液(100μl;6mMpNp-磷酸酯，在0.1M甘氨酸緩沖液pH10.4，1mM ZnCl2，1mM MgCl2中)，平板于室溫下保溫。在15分鐘和30分鐘時(shí)，用ELISA平板測(cè)定儀測(cè)定平板在410nm處的讀數(shù)(圖3)。
圖3表明堿性磷酯酶聯(lián)的抗香豆素IgG對(duì)通過(guò)水解而暴露的香豆素殘基的結(jié)合活性，所謂水解是通過(guò)取代的β-半乳糖苷酶聯(lián)的抗異羥基毛地黃毒苷IgG作用于固定化香豆素-β-半乳糖苷進(jìn)行的。堿性磷酯酶-抗香豆素與單獨(dú)的BSA的結(jié)合少于與BSA-香豆素的最大結(jié)合的5%，結(jié)合物與未水解底物的結(jié)合大約為最大結(jié)合的29%。用此數(shù)據(jù)減除所有其它數(shù)據(jù)后作圖。檢測(cè)以平行樣品進(jìn)行。
此結(jié)果構(gòu)成了檢測(cè)異羥基毛地黃毒苷的基礎(chǔ)，其信號(hào)在10ng/ml-1mg/ml的范圍內(nèi)與所提供分析物的濃度成正比。
實(shí)例6實(shí)驗(yàn)方法1.固相捕獲系統(tǒng)的制備在PVC ELISA平板的每個(gè)孔中加入大約10μg親和純化的抗香豆素IgG(在100μl包膜緩沖液中)，平板在潮濕環(huán)境中于4℃保溫過(guò)夜。第二天，用洗滌緩沖液從平板上洗去未結(jié)合的IgG(洗4次)。
2.在葡聚糖-6-氨基己烷上的香豆素底物-雌二醇的雙結(jié)合物用高碘酸鈉氧化葡聚糖(DextranT40)以產(chǎn)生醛基功能團(tuán);引入二氨基己烷，然后用氫硼化鈉還原使連接穩(wěn)定化。香豆素-半乳糖和雌二醇通過(guò)其衍生物的活性酯鍵接在葡聚糖-6-氨基己烷上。將活性酯依次加到葡聚糖上，底物與雌二醇的比例為5∶1、反應(yīng)示于圖4中。
雙結(jié)合物透析后在SephadexG50上層析。含有葡聚糖的組分表現(xiàn)出熒光(微弱，表明香豆素底物的存在)。
3.葡聚糖-底物溶液的制備把得到的葡聚糖-底物(1mg/ml)用β-半乳糖苷酶檢測(cè)緩沖液制備成溶液，在其中加入抗香豆素IgG(12μl用洗滌緩沖液適當(dāng)稀釋的抗香豆素IgG/120μl葡聚糖-底物)，以阻斷所有能作為雜質(zhì)存在的暴露位點(diǎn)(此步并不是本方法所必需的)。混合物于37℃保溫1小時(shí)。
4.固相烏本苷-抗異羥基毛地黃毒苷-β-半乳糖苷酶結(jié)合物的制備在PVCELISA平板的每個(gè)孔中加入大約10μg胎球蛋白-烏本苷(實(shí)例4)(在100μl包膜緩沖液中)，平板在潮濕環(huán)境中于4℃保溫過(guò)夜。用洗滌緩沖液從平板上洗去游離的結(jié)合物(洗4次)。然后每孔中加入β-半乳糖苷酶聯(lián)的親和純的羊抗異羥基毛地黃毒苷IgG(4μg結(jié)合物，在100μl PBS中，3mg/ml BSA)(抗異羥基毛地黃毒苷結(jié)合物)。
平板然后于室溫下保溫2小時(shí)，如上述從孔中洗去多余的結(jié)合物。
5.利用由溶液中異羥基毛地黃毒苷的置換而產(chǎn)生的半乳苷酶活性的標(biāo)準(zhǔn)放大式檢測(cè)法。
制備異羥基毛地黃毒苷溶液(1ng-1μg/ml，在PBS中)或單獨(dú)的PBS，每種100μl加入鋪有固相烏本苷-抗異羥基毛地黃毒苷結(jié)合物的ELISA平板的孔中。室溫下60分鐘后，在攪拌下從每孔中取出100μl，或者通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的參考檢測(cè)法用oNp-半乳糖苷檢測(cè)，或者加入100μl葡聚糖-底物中。
20分鐘以后，每種反應(yīng)混合物取100μl轉(zhuǎn)移至ELISA平板的用抗-香豆素包膜的孔中，然后此平板進(jìn)一步保溫20分鐘。用洗滌緩沖液從孔中洗去未結(jié)合的反應(yīng)產(chǎn)物(洗4次)，在每孔中加入堿性磷酯酶聯(lián)的親和純化的抗雌二醇IgG(100μl，5μg/ml)。
20分鐘后，如上述從孔中洗去游離的結(jié)合物，在每孔中加入堿性磷酯酶底物溶液(100μl;6mMpNp-磷酯酶，在磷酯酶檢測(cè)緩沖液中)。
在5、10和15分鐘后讀取產(chǎn)物溶液的光吸收，扣除底物空白(100μl堿性磷酯酶底物保溫同樣的時(shí)間)。
結(jié)果示于圖5中。應(yīng)當(dāng)注意，在標(biāo)準(zhǔn)的參考o(jì)Np檢測(cè)中，保溫時(shí)間為90分鐘。假如產(chǎn)生信號(hào)的保溫時(shí)間至少為10分鐘，則本發(fā)明的檢測(cè)法比標(biāo)準(zhǔn)的參考檢測(cè)法更為靈敏。
實(shí)例7香豆素-半乳糖基底物交叉反應(yīng)的測(cè)定根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)法制備半乳糖基-香豆素-3-乙酸。通過(guò)放射性免疫分析、利用3H標(biāo)記的7-羥基香豆素-3-乙酸衍生物和兔抗7-羥基香豆素-3-乙酸測(cè)定交叉反應(yīng)。
采用標(biāo)準(zhǔn)的葡聚糖包膜的木炭法，并用常規(guī)的50%抑制公式去計(jì)算交叉反應(yīng)數(shù)據(jù)，結(jié)果是0.008-0.018%。很低的交叉反應(yīng)表明，香豆素和半乳糖基香豆素對(duì)香豆素抗體的親和性有很大的差別。
實(shí)例8香豆素-半乳糖基底物雌二醇(半抗原部分)結(jié)合物的制備和性質(zhì)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的有機(jī)化學(xué)方法制備和純化香豆素-3-乙酸和17β-雌二醇3-羥甲基醚的結(jié)合物，并接上1，8-二氨基辛烷作為臂。還制備一種可溶形式的結(jié)合物(見(jiàn)圖6)。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法將半乳糖接在結(jié)合物中香豆素的7-羥基功能團(tuán)上。
通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的ELISA法，分析結(jié)合物和底物結(jié)合物的免疫活性。
用兔抗香豆素包膜微量滴定板。在包膜孔中加入一系列濃度的結(jié)合物和底物，使其反應(yīng)，洗滌后在孔中加入用堿性磷酯酶標(biāo)記的抗雌二醇抗體，并使其反應(yīng)。
洗滌以后，用pNp磷酸酯測(cè)量孔中保留的堿性磷酯酶活性。
結(jié)果表明底物和產(chǎn)物的反應(yīng)活性顯著不同。底物S1對(duì)抗香豆素抗體的親和性低得多，這是由于抗原決定簇(香豆素部分)掩蔽所至。去掉半乳糖(S1→P1)而使抗原決定簇暴露出來(lái)，能使親和性提高大約1000倍。溶解性更好的結(jié)合物(S2-P2)的反應(yīng)活性稍好一些，交叉反應(yīng)的數(shù)據(jù)證實(shí)了這些結(jié)果。
實(shí)例9利用標(biāo)準(zhǔn)方法和放大式方法檢測(cè)β-半乳糖苷酶由貯備液(商業(yè)制劑，大約1mg/ml)制備一系列稀釋的大腸桿菌β-半乳糖苷酶。
標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)法如下述進(jìn)行在微量滴定板的孔中，把10μlβ-半乳糖苷酶加入100μlpNp-半乳糖苷中，90分鐘后加入100μl終止緩沖液停止反應(yīng)，讀取光吸收。
放大式檢測(cè)法如下述進(jìn)行在微量滴定板的孔中，把10μl酶加到100μl50μg/ml半乳糖基-香豆素二氨基辛烷-雌二醇3CME結(jié)合物中。保溫20分鐘后，反應(yīng)產(chǎn)物稀釋至1/256，取100μl轉(zhuǎn)移至用抗香豆素包膜的微量滴定板孔中。20分鐘后洗滌平板，加入抗雌二醇-堿性磷酯酶，使其反應(yīng)20分鐘后洗滌，在10-30分鐘起測(cè)量磷酯酶活性。
圖7表明了對(duì)β-半乳糖苷酶稀釋度作圖的光吸收。放大式檢測(cè)法的靈敏度比標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)法大約高1000倍(見(jiàn)上)。(沒(méi)有考慮在加入抗香豆素抗體包膜的孔中之前產(chǎn)物的稀釋因素)。
實(shí)例1017α-羥基黃體酮的酶免疫檢測(cè)法(競(jìng)爭(zhēng)性檢測(cè)法)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)法和放大式方法之間的比較試劑和步驟通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的溴化氰活化法，將羊抗17-羥基黃體酮偶聯(lián)在顆粒上。
通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法制備17-羥基-黃體酮-3-羥甲基肟，并與大腸桿菌β-半乳糖苷酶(商業(yè)制劑)結(jié)合。
建立競(jìng)爭(zhēng)性酶免疫檢測(cè)法(游離的標(biāo)準(zhǔn)分析物與酶標(biāo)記的分析物競(jìng)爭(zhēng)磁性顆粒上的抗體)。利用標(biāo)準(zhǔn)的pNp-半乳糖苷測(cè)量結(jié)合部分的示蹤物的活性，而在放大式方法中，則利用半乳糖苷基-香豆素-二氨基辛烷-雌二醇3CME作為第一底物進(jìn)行測(cè)量，用偶聯(lián)在磁性顆粒上的抗香豆素制劑捕獲產(chǎn)物1(或其中的一部分)。利用抗雌二醇?jí)A性磷酯酶和結(jié)合物測(cè)量捕獲的產(chǎn)物1的水平，并用pNp-磷酸酯測(cè)量磷酯酶活性。
圖8給出了所得結(jié)果的一個(gè)例子。即使只有一小部分P1進(jìn)入檢測(cè)法的第二步，放大式方法也使產(chǎn)生的信號(hào)大大加強(qiáng)。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)樣品中分析物的方法，它是通過(guò)使用第一酶及能夠與其作用產(chǎn)生第一產(chǎn)物的第一底物，該方法包括以下步驟a)使樣品進(jìn)入檢測(cè)程序，從而以預(yù)定狀態(tài)和與樣品中分析物濃度有關(guān)的量產(chǎn)生第一酶，b)使預(yù)定狀態(tài)的第一酶在合適條件下與第一底物接觸，以產(chǎn)生其數(shù)量與樣品中分析物濃度有關(guān)的第一產(chǎn)物，c)使步驟b產(chǎn)生的第一產(chǎn)物在合適條件下與第一產(chǎn)物的特異性結(jié)合劑接觸，從而使二者結(jié)合在一起，來(lái)確定該第一產(chǎn)物的存在或含量，d)利用c的結(jié)果確定樣品中分析物的存在或濃度。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中的第一底物是以與基質(zhì)結(jié)合的形式提供的，而步驟b中的第一產(chǎn)物是以與基質(zhì)結(jié)合的形式產(chǎn)生的。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中的第一底物是以溶液形式提供的，而步驟b的第一產(chǎn)物產(chǎn)生于該溶液中。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中步驟a的第一酶是以與基質(zhì)結(jié)合的形式產(chǎn)生的。
5.如權(quán)利要求3或4所述的方法，其中步驟b產(chǎn)生的第一產(chǎn)物在進(jìn)行步驟c之前由溶液轉(zhuǎn)化成與基質(zhì)結(jié)合的形式。
6.如權(quán)利要求1至5中任何一個(gè)所述的方法，其中的步驟c按下述進(jìn)行使第一產(chǎn)物在合適條件下與第一產(chǎn)物的標(biāo)記的特異性結(jié)合劑接觸，從而使二者結(jié)合在一起，然后測(cè)定與第一產(chǎn)物結(jié)合或未結(jié)合的標(biāo)記物。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中的特異性結(jié)合劑是用酶標(biāo)記的。
8.如權(quán)利要求1至7中任何一個(gè)所述的方法，其中的第一酶是β-半乳糖苷酶。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中的第一底物是二-半乳糖基-熒光素胺-半琥珀酸或單一半乳糖苷-熒光素底物。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中的第一底物是半乳糖基-香豆素一雌二醇底物。
11.如權(quán)利要求1至10中任何一個(gè)所述的方法，其中提供了一種與基質(zhì)結(jié)合形式的分析物類(lèi)似物和在溶液中的酶標(biāo)記的分析物-抗體，步驟a的檢測(cè)程序包括使樣品中的分析物與基質(zhì)上的分析物類(lèi)似物競(jìng)爭(zhēng)性地與酶標(biāo)記的抗體結(jié)合。
全文摘要
一種免疫檢測(cè)方法，包括使用一種或更好是兩種酶放大步驟以提高檢測(cè)速度或靈敏度。在第一步中，以與樣品中分析物濃度相關(guān)的量產(chǎn)生第一酶。在第二步中，第一酶作用于第一底物以暴露第一產(chǎn)物的抗原決定基。在第三步中，使第一產(chǎn)物與抗體反應(yīng)。測(cè)定此免疫反應(yīng)的程度，最好是通過(guò)酶信號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定。描述了用β—半乳糖苷酶作為第一酶檢測(cè)異羥基毛地黃毒苷的兩種方法和檢測(cè)17α—羥基黃體酮的一種方法。
文檔編號(hào)G01N33/543GK1034273SQ8810845
公開(kāi)日1989年7月26日 申請(qǐng)日期1988年10月22日 優(yōu)先權(quán)日1987年10月22日
發(fā)明者拉馬丹·阿拉比·阿布克內(nèi)沙, 休·彼得·本內(nèi)托, 菲利普·賈爾斯·紐金特, 約翰·萊恩·斯特林 申請(qǐng)人:艾爾坎國(guó)際有限公司