專利名稱：一種植酸酶的檢測方法
一種植酸酶的檢測方法技術領域
本發(fā)明屬于生物檢測領域，涉及一種用于檢測樣品中植酸酶的方法。
背景技術：
植酸酶廣泛存在于植物、動物組織和微生物中。植酸酶分為3類肌醇六磷酸-3-磷酸水解酶，肌醇六磷酸-6-磷酸水解酶和非特性的正磷酸鹽單酯磷酸水解酶。目前發(fā)現(xiàn)的植酸酶有3種來源一是存在于植物中的天然植酸酶，如小麥、大麥、黑麥等谷物籽粒及其加工副產(chǎn)物中含有的天然植酸酶；二是微生物來源的植酸酶，也是目前認為最有潛力的植酸酶；三是從牛瘤胃中分離出的一種可以產(chǎn)生植酸酶的細菌，同時還可以產(chǎn)生有營養(yǎng)功能的其他酶類。
植酸酶能催化植酸及其鹽類水解為肌醇與磷酸(鹽)，具有特殊的空間結構，能夠依次分離植酸分子中的磷，將植酸(鹽)降解為肌醇和無機磷，同時釋放出與植酸(鹽)結合的其它營養(yǎng)物質(zhì)。
由于植酸酶能夠分解飼料的植酸為肌醇和無機磷，提高飼料中磷的利用率，減少無機磷的用量；降低植酸及其植酸鹽對蛋白質(zhì)、礦質(zhì)元素的螯合作用，提高飼料中礦質(zhì)元素和營養(yǎng)物質(zhì)的利用率，并減少植酸對動物腸胃內(nèi)相關消化酶的活性的抑制作用，最終提高動物的生產(chǎn)性能，降低磷對環(huán)境的污染作用。因此植酸酶制劑廣泛應用于飼料工業(yè)，同時在食品工業(yè)、環(huán)境保護等領域亦發(fā)揮積極作用。
在植酸酶活性測定中，一般利用植酸酶在一定溫度和pH條件下，水解植酸鈉形成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性環(huán)境中與底物反應生成藍色絡合物，通過比色測定和標準曲線，最終換算成植酸酶活力單位。然而，該方法的主要問題是未完全反應的底物亦與顯色劑反應，造成背景值干擾，從而影響到植酸酶活力的精確定量，對于特定環(huán)境樣品如土壤、水體和根際殘留物中的痕量植酸酶測定并非合適。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服上述缺點，通過納米微球的快速反應和離心去除，排除背景值的干擾，從而提供一種樣品中植酸酶的檢測方法。
—種植酸酶的檢測方法，示意圖見圖4，利用羧基-氨基化學偶聯(lián)法偶聯(lián)分散型納米微球和植酸分子，在溶劑相中形成植酸酶與植酸結合的表面快速反應體系，產(chǎn)物正磷酸直接進入溶劑相，而未反應的肌醇衍生物仍滯留于固相微球，通過低溫和高速離心去除微球，在酸性條件下在溶劑相中加入顯色劑生成藍色復合物，在波長700nm比色測定，通過制定的標準曲線，最終換算成植酸酶活力單位。
所述的分散型納米微球為單分散羧基化聚苯乙烯微球，粒徑<50nm，表面載基團為羧基。
所述的利用羧基-氨基化學偶聯(lián)法偶聯(lián)分散型納米微球和植酸分子是將單分散羧基化聚苯乙烯微球用碳化二亞胺活化2(T40min,然后加入N-輕基硫代琥拍酰亞胺15min使微球形成穩(wěn)定的活潑酯中間體，再加入植酸鈉30°C溫育1-2小時，洗滌后收集偶聯(lián)植酸分子的納米微球；其中所述的單分散羧基化聚苯乙烯微球、碳化二亞胺、N-羥基硫代琥珀酰亞胺以及植酸鈉的用量為Ig :0. 01 O.1mol O. 005 O.1mol O. 001 O. Olmol ;優(yōu)選Ig O. 05mol :0. Olmol : O. 002mol。
本發(fā)明植酸酶的檢測方法中，納米微球和植酸分子偶聯(lián)后，在37° C、PH4. 5^5. 5 條件下加入植酸酶樣品進行反應，未反應的肌醇衍生物仍滯留于固相微球；通過4°C低溫和高速離心2(T30min去除微球，于酸性條件(即pH4. 5^5. 5)下在溶劑相中加入顯色劑生成藍色復合物，在波長700nm比色測定。
本發(fā)明植酸酶的檢測方法中，采用植酸酶純蛋白為標準樣品，測定標準曲線，然后再根據(jù)樣品比色值結果測算實際植酸酶含量。
根據(jù)權利要求1或4所述的植酸酶的檢測方法，所述的高速離心為15，OOOXgo
所述的植酸酶I個酶活力單位(U)定義為在37° C、pH4. 5飛.5條件下，每分鐘從 5mM的植酸鈉溶液中釋放出Ιμπιο 的無機磷所需要的酶量定義為。
本發(fā)明的有益效果在于，通過納米微球的高效表面反應體系可以實現(xiàn)植酸酶活力的快速測定；同時，未反應的肌醇衍生物仍滯留于固相微球，避免了常規(guī)方法中未完全反應的植酸分子與顯色劑反應所造成的背景值干擾，使得痕量測定成為可能。適用于特定環(huán)境樣品如土壤、水體和根際殘留物中的痕量植酸酶樣品測定。
圖1是羧基化聚苯乙烯分子式(A)和羧基化聚苯乙烯微球掃描電鏡(B)圖
圖2是活化劑EDC (碳化二亞胺)分子式(A)和保護劑Sulfo-NHS (N-羥基硫代琥珀酰亞胺)分子式圖
圖3是植酸酶測定標準曲線
圖4是納米微球和植酸分子偶聯(lián)、催化反應和比色測定示意圖具體實施方式
實施例I
如圖1所示，納米微球為單分散羧基化聚苯乙烯微球，粒徑<50nm，表面載基團為羧基。微球和植酸分子偶聯(lián)過程采用的是羧基-氨基化學偶聯(lián)法，包括將單分散羧基化聚苯乙烯微球5mg用5ml50mM活化劑EDC(碳化二亞胺)(圖2A)活化30min，然后加入lml50mM 保護劑Sulfo-NHS (N-羥基硫代琥珀酰亞胺)(圖2B)15min使微球形成穩(wěn)定的活潑酯中間體，再加入2ml5mM植酸鈉30°C溫育1_2小時，洗滌后收集偶聯(lián)植酸分子的納米微球。
實施例2
如表I所示，將偶聯(lián)植酸分子的納米微球用O.1M乙酸緩沖液配制成2. 5%(w/v%, 重量/體積百分比，具體指g/100ml)的懸浮液，調(diào)整pH5.0。取80 μ I微球，加入樣品或植酸酶標準品20 μ I。以植酸酶純蛋白為標準品，設立8個濃度梯度(2U/ml，lU/ml,0. 5U/ ml,O. 25U/ml，0. 125U/ml，0. 0625U/ml，0. 03125U/ml 和 OU/ml)。在 37°C預熱 5min 后，混勻 5min,于37°C保溫30min。在4°C、15, 000 X g條件下離心20min,收集上清。接著,依次加入 5%(w/v%,具體指g/100ml)三氯乙酸100 μ I (終止液)和顯色劑100 μ I (1. 5%(w/v%,具體指g/100ml)鑰酸鈉和2. 7%(w/v%,具體指g/100ml)硫酸亞鐵按4:1的比例,現(xiàn)配現(xiàn)用),混勻后立即在波長700nm比色測定。酶活力單位定義在37° C、pH5. O條件下，每分鐘從5mM 的植酸鈉溶液中釋放出Iymol的無機磷定義為I個酶活力單位(U)。
如圖3所示，根據(jù)植酸酶標準品測定的標準曲線，相關系數(shù)R2=O. 993，測定的最低濃度0.03125U/ml。對植酸酶樣品1_4的吸光度值進行換算后，獲得樣品的植酸酶實測結果，如表2所示。
表I
權利要求
1.一種植酸酶的檢測方法，其特征是利用羧基-氨基化學偶聯(lián)法偶聯(lián)分散型納米微球和植酸分子，在溶劑相中形成植酸酶與植酸結合的表面快速反應體系，產(chǎn)物正磷酸直接進入溶劑相，而未反應的肌醇衍生物仍滯留于固相微球，通過低溫和高速離心去除微球，在酸性條件下在溶劑相中加入顯色劑生成藍色復合物，在波長700nm比色測定，通過制定的標準曲線，最終換算成植酸酶活力單位。
2.根據(jù)權利要求I所述的植酸酶的檢測方法，其特征是所述的分散型納米微球為單分散羧基化聚苯乙烯微球，粒徑<50nm，表面載基團為羧基。
3.根據(jù)權利要求2所述的植酸酶的檢測方法，其特征是所述的利用羧基-氨基化學偶聯(lián)法偶聯(lián)分散型納米微球和植酸分子是將單分散羧基化聚苯乙烯微球用碳化二亞胺活化2(T40min，然后加入N-羥基硫代琥珀酰亞胺反應15min使微球形成穩(wěn)定的活潑酯中間體，再加入植酸鈉30°C溫育1-2小時，洗滌后收集偶聯(lián)植酸分子的納米微球；其中所述的單分散羧基化聚苯乙烯微球、碳化二亞胺、N-羥基硫代琥珀酰亞胺以及植酸鈉的用量為Ig 0. Ol 0. Imol :0. 005 0. Imol 0. 001 0. Olmol ;優(yōu)選 Ig :0. 05mol :0. Olmol 0. 002molo
4.根據(jù)權利要求I所述的植酸酶的檢測方法，其特征是分散型納米微球和植酸分子偶聯(lián)后，在37° C、pH5. 0條件下加入植酸酶樣品進行反應，未反應的肌醇衍生物仍滯留于固相微球；通過4°C低溫和高速離心2(T30min去除微球，于酸性條件下在溶劑相中加入顯色劑生成藍色復合物，在波長700nm比色測定。
5.根據(jù)權利要求I或4所述的植酸酶的檢測方法，其特征是采用植酸酶純蛋白為標準樣品，測定標準曲線，然后再根據(jù)樣品比色值結果測算實際植酸酶含量。
6.根據(jù)權利要求I或4所述的植酸酶的檢測方法，其特征是所述的高速離心為15，000 X go
7.根據(jù)權利要求I或4所述的植酸酶的檢測方法，其特征是酶活力單位定義在37° C、pH4. 5^5. 5條件下，每分鐘從5mM的植酸鈉溶液中釋放出I U mo I的無機磷所需要的酶量定義為I個酶活力單位。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物檢測領域，涉及一種用于檢測樣品中植酸酶的方法。主要是利用羧基-氨基化學偶聯(lián)法偶聯(lián)分散型納米微球和植酸分子，在溶劑相中形成植酸酶與植酸結合的表面快速反應體系，產(chǎn)物正磷酸直接進入溶劑相，而未反應的肌醇衍生物仍滯留于固相微球。通過低溫和高速離心去除微球，在酸性條件下在溶劑相中加入顯色劑生成藍色復合物，在波長700nm比色測定。該方法在實現(xiàn)植酸酶活力快速測定的同時，使未反應的肌醇衍生物仍滯留于固相微球，避免了常規(guī)方法中未完全反應的植酸分子與顯色劑反應所造成的背景值干擾，使得痕量測定成為可能。適用于特定環(huán)境樣品如土壤、水體和根際殘留物中的痕量植酸酶樣品測定。
文檔編號G01N1/34GK102980854SQ201210574368
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月26日 優(yōu)先權日2012年12月26日
發(fā)明者陳法軍, 潘衛(wèi)東, 萬貴鈞, 趙宗潮, 郭維維 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學