本發(fā)明屬于食品與發(fā)酵產(chǎn)品檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速特異性檢測凝膠多糖含量的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

凝膠多糖(curdlan)是由β-1，3-d糖苷鍵聚合而成的葡聚糖，可由微生物利用葡萄糖、蔗糖等碳源發(fā)酵產(chǎn)生。凝膠多糖在食品、醫(yī)藥、飼料、保健等領(lǐng)域用途廣泛，是一種高附加值的產(chǎn)品。

目前對于凝膠多糖含量的測定主要通過苯酚硫酸比色法、剛果紅顯色法和提取稱重法等方式。其中苯酚硫酸比色法測定多糖的原理是先將多糖在濃酸作用下水解成單糖如葡萄糖再迅速生成糠醛衍生物進而與苯酚發(fā)生顯色反應(yīng)，所以這種方法不能區(qū)分多糖的種類和糖苷鍵類型，也不能區(qū)分多糖和小分子糖混合物，故而對凝膠多糖的檢測缺乏特異性；剛果紅顯色法利用剛果紅可以和多糖絡(luò)合發(fā)生吸收波長的位移，也能測定許多種多糖的含量，但是可以與剛果紅發(fā)生顯色反應(yīng)的多糖種類較多，比如纖維素、殼聚糖、右旋糖酐(α-d-1-6-葡聚糖)等等，故剛果紅顯色法依然沒有凝膠多糖特異性；提取稱重法需要利用凝膠多糖的特性將含凝膠多糖樣品進行堿溶解離心后再加酸沉淀，再經(jīng)數(shù)次洗滌和酒精沉淀得到純的凝膠多糖樣品后干燥至恒重，過程繁瑣耗時很長。這些方法都很難及時準確地分析各種產(chǎn)品中的凝膠多糖含量，也很難及時準確地反映發(fā)酵過程中凝膠多糖產(chǎn)量的動態(tài)變化。比如，如果液體產(chǎn)品或發(fā)酵液中同時包含有不同種類多糖、單糖和寡糖，不經(jīng)過分離純化用苯酚硫酸法和剛果紅顯色法都無法準確測定，而如果需要分離純化各種糖類再行檢測則費時費力。因此，開發(fā)一種能夠快速特異性檢測凝膠多糖含量的方法具有重要的意義。

已有研究表明β-1，3-d-葡聚糖能專一地被苯胺藍染色,這被應(yīng)用于在固體培養(yǎng)基添加苯胺藍對凝膠多糖產(chǎn)生菌進行染色識別，但是由于苯胺藍只有在中性和酸性條件下才顯現(xiàn)出穩(wěn)定的藍色，而凝膠多糖卻只能在堿性條件下溶解，這使得長期以來苯胺藍染色法只能應(yīng)用于凝膠多糖產(chǎn)生菌在固體平板培養(yǎng)基上的初篩而無法用于凝膠多糖的定量分析。我們在研究中發(fā)現(xiàn)，苯胺藍與凝膠多糖在堿性條件下初期呈現(xiàn)棕紅色，然后快速褪色，待一定時間后呈色才逐漸穩(wěn)定并伴有相應(yīng)穩(wěn)定的光譜吸收，此時其od值與凝膠多糖濃度線性相關(guān)。這種凝膠多糖與苯胺藍在堿溶液里的反應(yīng)受到底物濃度、反應(yīng)體系、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間等因素的顯著影響，需要經(jīng)過各種條件的優(yōu)化，才能得出利用苯胺藍快速特異性檢測凝膠多糖含量的方法，尤其是快速檢測液體中的凝膠多糖含量，對于凝膠多糖菌種選育和發(fā)酵生產(chǎn)過程控制、工藝條件優(yōu)化有著極其重要的意義。

公開于該背景技術(shù)部分的信息僅僅旨在增加對本發(fā)明的總體背景的理解，而不應(yīng)當被視為承認或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種快速特異性檢測凝膠多糖含量的方法，該方法中凝膠多糖含量與吸光度呈良好線性相關(guān)，可得到r²>0.9的標準曲線。

一種快速特異性檢測凝膠多糖含量的方法，包括以下步驟：

(1)苯胺藍溶液的制備：稱取苯胺藍固體，加入去離子水攪拌，待充分溶解后用容量瓶定容，配制成苯胺藍溶液；

(2)凝膠多糖標準堿溶液的制備：準確稱取烘干至恒重的凝膠多糖標品于燒杯中，加入60ml0.1mol/lnaoh溶液攪拌至多糖完全溶解，再用0.1mol/lnaoh溶液定容至100ml，得到凝膠多糖標準堿溶液；

(3)凝膠多糖標準曲線的制作：分別取一系列不同體積的凝膠多糖標準堿溶液，加入0.1mol/lnaoh溶液補足到1ml，得到一系列不同凝膠多糖終濃度的待測液，再分別加入100μl苯胺藍溶液與之混勻，迅速置于25-40℃的水浴反應(yīng)20-40min，然后迅速置于冰水浴中，吸取200μl反應(yīng)液加入酶標板中，用酶標儀測定吸光度，然后以吸光度為縱坐標，以凝膠多糖標品濃度為橫坐標，繪制標準曲線；

(4)凝膠多糖樣品含量測定：將含凝膠多糖的發(fā)酵液樣品加入naoh溶液，用振蕩器振蕩均勻，至完全溶解，以6000-10000r/min離心5-10min，取上清液即是凝膠多糖樣品堿溶液，用去離子水稀釋凝膠多糖樣品堿溶液使其naoh終濃度為0.1mol/l，然后按標準曲線測定方法同樣的步驟測定吸光度，代入標準曲線計算樣品含量。

作為優(yōu)選，步驟(1)中苯胺藍溶液的質(zhì)量百分比為0.1-1％。

作為優(yōu)選，步驟(3)、(4)中所述酶標儀的測定波長為540-560nm。

作為優(yōu)選，步驟(3)、(4)中所述的凝膠多糖與苯胺藍是在ph8-14的堿性溶液中反應(yīng)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

1.利用本方法可以解決目前常用的苯酚硫酸比色法、剛果紅比色法對凝膠多糖無特異性的缺點，也可以解決提取稱重法過程繁瑣、耗時太長的不足。

2.本方法能夠快速檢測各種溶液如發(fā)酵液中凝膠多糖的含量、快速跟蹤發(fā)酵過程中凝膠多糖產(chǎn)量的變化并相應(yīng)調(diào)整發(fā)酵生產(chǎn)策略、快速比較不同菌株在液體發(fā)酵過程中的生產(chǎn)能力，從而促進凝膠多糖菌種選育和發(fā)酵控制水平。

3.利用本方法還可以對各種固體、液體、固液混合體產(chǎn)品中的凝膠多糖含量進行檢測，對于含凝膠多糖的固體樣品可以制備成堿溶液后測定。

附圖說明

圖1為本發(fā)明方法以市售凝膠多糖作為標準品制作的凝膠多糖含量標準曲線；

圖2為本發(fā)明方法以從發(fā)酵液中提取的凝膠多糖制作的凝膠多糖含量標準曲線；

圖3為本發(fā)明方法對左聚糖、可溶性淀粉、羧甲基纖維素鈉鹽、右旋糖酐和凝膠多糖5種樣品的測定結(jié)果比較圖；

圖4為本發(fā)明方法中酶標儀使用波長掃描圖譜。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的具體實施方式進行詳細描述，但應(yīng)當理解本發(fā)明的保護范圍并不受具體實施方式的限制。

本發(fā)明使用的菌種可以從菌種保藏中心購買，也可以通過野外采集或者其他途徑獲得。微生物培養(yǎng)和凝膠多糖提取等相關(guān)的技術(shù)方案是本領(lǐng)域中常用的成熟技術(shù)，涉及的專業(yè)術(shù)語也是本領(lǐng)域中常見的專業(yè)術(shù)語，實施例是說明性的，而不是限定性的，不能被解釋為限定本發(fā)明的保護范圍。

實施例1：

一種快速特異性檢測凝膠多糖含量的方法，以市售凝膠多糖為標品制作標準曲線，包括以下步驟：

(1)苯胺藍溶液的制備：準確稱取0.5g苯胺藍固體，加入去離子水攪拌，待充分溶解后用容量瓶定容至100ml，配制成0.5％的水溶性苯胺藍溶液；

(2)凝膠多糖標準堿溶液的制備：將市售凝膠多糖標品烘干至恒重，準確稱取0.25g于燒杯中，加入60ml0.1mol/lnaoh溶液磁力攪拌至多糖完全溶解，再用0.1mol/lnaoh溶液定容至100ml，得到0.25％凝膠多糖標準堿溶液；

(3)凝膠多糖標準曲線的制作：以0.25％凝膠多糖標準堿溶液，分別取一系列不同體積的凝膠多糖標準堿溶液，加入0.1mol/lnaoh溶液補足到1ml，得到凝膠多糖終濃度為0.05-0.10％的待測液，再加入100μl苯胺藍溶液，迅速置于35℃水浴反應(yīng)30min，然后迅速置于冰水浴中，吸取200μl反應(yīng)液加入酶標板中，用酶標儀測定吸光度od550，以od550為縱坐標，以凝膠多糖標品濃度為橫坐標繪制標準曲線；

結(jié)果如圖1所示，得到標準曲線方程為y＝9.58794x-0.27211，其r²＝0.99788，線性良好，說明本發(fā)明方法可以進行定量分析。

實施例2：

一種快速特異性檢測凝膠多糖含量的方法，從發(fā)酵液中提取凝膠多糖純品制作標準曲線并應(yīng)用于發(fā)酵液中凝膠多糖含量比色測定，包括以下步驟：

(1)凝膠多糖發(fā)酵液制備：以廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院保藏的菌種agrobacteriumradiobactera-15為例，從斜面轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基于32℃、220r/min搖床培養(yǎng)18h，再按接種量12％轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于32℃、240r/min搖床培養(yǎng)120h得到凝膠多糖發(fā)酵液；

所述的種子培養(yǎng)基為0.3％(nh4)2hpo4，2％一水葡萄糖，0.15％kh2po4，0.1％mgso4，0.1％玉米漿，ph7.2；

所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為5％葡萄糖，0.03％(nh4)2hpo4，0.2％kh2po4，0.05％mgso4，0.05％玉米漿，ph7.2。

(2)從發(fā)酵液提取凝膠多糖：吸取1ml本實施例步驟(1)所述的發(fā)酵液于2mlep管中，補加1mol/lnaoh至2ml，用振蕩器振蕩均勻，至完全溶解，8000r/min離心5min。吸取1ml上清液于2mlep管中，補加2mol/lhcl至2ml，用振蕩器振蕩均勻，12000r/min離心10min，棄掉上清，得到凝膠多糖沉淀；

將凝膠多糖沉淀補加去離子水至2ml，用振蕩器振蕩均勻，靜置10min，然后12000r/min離心10min，棄掉上清，沉淀補加無水乙醇至2ml，用振蕩器振蕩均勻，靜置10min，12000r/min離心10min，棄掉上清。重復(fù)本步驟三次，棄去上清，在ep管中保留提取的凝膠多糖沉淀；

將提取的凝膠多糖沉淀和ep管一起置于旋轉(zhuǎn)真空干燥儀中60℃干燥3h-5h至恒重，即得到發(fā)酵液提取凝膠多糖的固體標品；

(3)苯胺藍溶液的制備：準確稱取0.5g苯胺藍固體，加入去離子水攪拌，待充分溶解后用容量瓶定容100ml，配制成0.5％的水溶性苯胺藍溶液；

(4)發(fā)酵液提取凝膠多糖標準堿溶液的制備：將本實施例步驟(2)所得的從發(fā)酵液提取的凝膠多糖固體標品烘干至恒重，準確稱取0.25g于燒杯中，加入60ml0.1mol/lnaoh溶液磁力攪拌至多糖完全溶解，再用0.1mol/lnaoh溶液定容至100ml，得到濃度為0.25％的發(fā)酵液提取凝膠多糖標準堿溶液；

(5)發(fā)酵液提取凝膠多糖標準曲線的制作：分別取一系列不同體積本實施例步驟(4)所得的發(fā)酵液提取凝膠多糖標準堿溶液，加入0.1mol/lnaoh溶液補足到1ml，得到凝膠多糖終濃度為0.1-0.2％的待測液，再加入100μl苯胺藍溶液，迅速置于35℃水浴反應(yīng)30min，然后迅速置于冰水浴中，吸取200μl反應(yīng)液加入酶標板中，用酶標儀測定吸光度od550，以吸光度od550為縱坐標，以發(fā)酵液提取凝膠多糖的濃度為橫坐標繪制標準曲線；

(6)發(fā)酵液中凝膠多糖含量的比色測定：取1ml發(fā)酵液加入1mol/lnaoh溶液至2ml，用振蕩器振蕩均勻，至完全溶解，8000r/min離心5min，取上清液即是凝膠多糖發(fā)酵液樣品堿溶液，用去離子水稀釋凝膠多糖發(fā)酵液樣品堿溶液使其naoh終濃度為0.1mol/l，然后按本實施例步驟(5)同樣的過程進行反應(yīng)，測定吸光度od550，代入本實施例步驟(5)所得標準曲線計算發(fā)酵液樣品中凝膠多糖的含量。

本實施例所得結(jié)果如圖2所示，得到標準曲線方程為y＝5.37361x-0.3208，其r²＝0.99738，線性良好，說明本發(fā)明方法可以進行定量分析。參照本實施例所得標準曲線，用本發(fā)明方法苯胺藍比色法檢測本實施例步驟(1)所得發(fā)酵液中凝膠多糖的含量，并與提取稱重法比較，結(jié)果見表1。

表1比色法和干重法測定發(fā)酵液凝膠多糖含量的比較

如表1所示，本發(fā)明方法與提取稱重法測量的結(jié)果較吻合。本實施例中，用本發(fā)明方法測定發(fā)酵液凝膠多糖濃度的標準偏差在0.019-0.069％，與提取稱重法測定結(jié)果比較，平均相對誤差為4.98％。

本發(fā)明方法可以用于發(fā)酵液凝膠多糖含量的比色測定，其測定結(jié)果與提取稱重法接近，但過程比提取稱重法簡單快速。

實施例3：

一種快速特異性檢測凝膠多糖含量的方法，對凝膠多糖特異性的檢測，包括以下步驟：

(1)苯胺藍溶液的制備：準確稱取0.5g苯胺藍固體，加入去離子水攪拌，待充分溶解后用容量瓶定容至100ml，配制成0.5％的水溶性苯胺藍溶液；

(2)凝膠多糖標準堿溶液的制備：將市售凝膠多糖標品烘干至恒重，準確稱取0.25g于燒杯中，加入60ml0.1mol/lnaoh溶液磁力攪拌至多糖完全溶解，再用0.1mol/lnaoh溶液定容至100ml，得到0.25％凝膠多糖標準堿溶液；

(3)其他類型多糖標準堿溶液的制備：分別將市售可溶性淀粉、羧甲基纖維素鈉鹽、右旋糖酐標品和廣西大學(xué)自制的左聚糖樣品烘干至恒重，準確稱取0.25g于燒杯中，加入60ml0.1mol/lnaoh溶液磁力攪拌至多糖完全溶解，再用0.1mol/lnaoh溶液定容至100ml，得到濃度均為0.25％的左聚糖、可溶性淀粉、羧甲基纖維素鈉鹽、右旋糖酐標準堿溶液；

(4)特異性檢測：以不添加糖的0.1mol/lnaoh溶液為空白對照，分別取400μl濃度均為0.25％的凝膠多糖標準堿溶液、左聚糖標準堿溶液、可溶性淀粉標準堿溶液、羧甲基纖維素鈉鹽標準堿溶液、右旋糖酐標準堿溶液，均用0.1mol/lnaoh溶液補足到1ml，得到各類型多糖待測液，再加入100μl苯胺藍溶液，迅速置于35℃水浴反應(yīng)30min，然后迅速置于冰水浴中，吸取200μl反應(yīng)液加入酶標板中，用酶標儀測定吸光度od550，比較測定結(jié)果。

結(jié)果如圖3所示，依次用空白和同等濃度的左聚糖、可溶性淀粉、羧甲基纖維素鈉鹽、右旋糖酐和凝膠多糖標品作比較測定，結(jié)果表明除了凝膠多糖有明顯的od550吸光值外，其余幾種常見的非β-1，3-d糖苷鍵組成的多糖的od550與空白相當，遠低于同等條件下凝膠多糖的吸收，說明非β-1，3-d糖苷鍵組成的多糖對本方法干擾可忽略，本發(fā)明方法對凝膠多糖的特異性較好。

實施例4：

一種快速特異性檢測凝膠多糖含量的方法，所述酶標儀測定時使用的波長是通過將凝膠多糖與苯胺藍在堿性條件下反應(yīng)，結(jié)束后將反應(yīng)液進行吸收波長掃描，選擇吸光度較大的波長段用于檢測，包括以下步驟：

(1)吸收波長掃描：采用按照實施例1步驟(2)所制得的凝膠多糖標準堿溶液的0.075％待測液，加入100μl苯胺藍溶液，迅速置于30℃水浴反應(yīng)20min，然后迅速置于冰水浴中，吸取200μl反應(yīng)液加入酶標板中，用酶標儀在450-600nm范圍進行吸收波長掃描。

結(jié)果如圖4所示，說明本發(fā)明方法在波長540-560nm范圍內(nèi)吸光度較大，且od值在0.2-0.8范圍內(nèi)，故該波長段可以用于本發(fā)明方法比色測定。

前述對本發(fā)明的具體示例性實施方案的描述是為了說明和例證的目的。這些描述并非想將本發(fā)明限定為所公開的精確形式，并且很顯然，根據(jù)上述教導(dǎo)，可以進行很多改變和變化。對示例性實施例進行選擇和描述的目的在于解釋本發(fā)明的特定原理及其實際應(yīng)用，從而使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)并利用本發(fā)明的各種不同的示例性實施方案以及各種不同的選擇和改變。本發(fā)明的范圍意在由權(quán)利要求書及其等同形式所限定。