專利名稱：一種石斛多糖含量的測定方法及其應(yīng)用的制作方法
一種石斛多糖含量的測定方法及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于中藥及其提取物的化學(xué)分析技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種石斛多糖含量的測定方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
多糖(polysaccharide)由多個(gè)單糖分子縮合、失水而成,是一類分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜且龐大的糖類物質(zhì)，其相對(duì)分子質(zhì)量從幾萬到幾千萬不等。多糖在自然界分布極廣，亦很重要，有的是構(gòu)成動(dòng)植物骨架結(jié)構(gòu)的組成成分，如纖維素；有的是作為動(dòng)植物儲(chǔ)藏的養(yǎng)分，如糖原和淀粉；有的具有特殊的生物活性，像人體中的肝素有抗凝血作用，肺炎球菌細(xì)胞壁中的多糖有抗原作用。近年來多糖研究越來越深入，逐漸成為生命科學(xué)研究的前沿。
多糖的測定方法有很多種，如斐林法、蒽酮_硫酸法、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、酶法和苯酚_硫酸法等，各測定方法有各自的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，如毛細(xì)管電泳法和高效液相色譜法精密度較高但需要多糖純品，對(duì)測定樣品的要求高，成本較高；蒽酮-硫酸法和苯酚-硫酸法等測定多糖時(shí)蛋白的干擾比較明顯。由于苯酚-硫酸法操作簡便，精確度較好， 是目前多糖測定中較常使用的一種方法。
石斛是我國名貴的中藥材，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，具有滋陰清熱、生津益胃、 強(qiáng)身等功效。石斛多糖是石斛的主要藥效成分之一，有抗腫瘤、降血糖、抗衰老和增強(qiáng)免疫等作用。石斛精多糖的獲得是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，需要經(jīng)過熱水浸提、粗多糖提取以及蛋白去除等步驟，其中制備Ig精多糖需要耗費(fèi)500g左右鮮石斛，傳統(tǒng)的制備及測定方法具有耗時(shí)、耗力和耗材的缺點(diǎn)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種石斛多糖含量的測定方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供所述石斛多糖含量的測定方法的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種石斛多糖含量的測定方法，包括以下步驟
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別吸取0、0. 2,0. 4,0. 6,0. 8、I. O、I. 2、I. 4、I. 6,2. Oml 的 O. 05mg · ml/1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液,各加蒸懼水補(bǔ)至2. Oml,然后各加6wt%重蒸苯酹I. Oml,搖勻后加入98wt%濃硫酸5. 0ml，搖勻，靜置5min后置沸水浴中加熱20min，冷卻至室溫，于 490nm處測定吸光度；以吸光度為縱坐標(biāo)、葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程；
換算因子(f)的測定取50μ g πιΓ1石斛精多糖溶液O. 05 1ml，加蒸餾水補(bǔ)足至2. Oml,各加6wt%重蒸苯酹溶液I. Oml,搖勻后加入98wt%濃硫酸5. Oml,搖勻，靜置5min 后置沸水浴中加熱20min，冷卻至室溫，于490nm處測定吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算石斛精多糖溶液的濃度；計(jì)算換算因子f :f = Cs/C，其中，Cs為石斛精多糖溶液的實(shí)際濃度，C為回歸方程計(jì)算石斛精多糖溶液的濃度；
石斛樣品溶液中石斛多糖含量的測定吸取石斛樣品溶液O. 05 1ml，各加蒸懼水補(bǔ)至2. Oml,然后各加6wt%重蒸苯酹I. Oml,搖勻后加入98wt%濃硫酸5. Oml,搖勻， 靜置5min后置沸水浴中加熱20min,冷卻至室溫，于490nm處測定吸光度，由回歸方程計(jì)算石斛樣品溶液中石斛多糖的濃度，由下述公式計(jì)算石斛樣品溶液中石斛多糖含量(X) X=fXC，XDX100%/ff ;
式中f-換算因子(即石斛多糖相當(dāng)于葡萄糖的校正系數(shù))，c’ -由回歸方程得到的石斛樣品溶液中的葡萄糖含量，D-樣品(石斛干燥粉末)測定中的稀釋倍數(shù)，W-石斛干燥粉末的質(zhì)量；
所述的石斛樣品溶液優(yōu)選采用以下方法進(jìn)行制備將石斛粉末按質(zhì)量體積比 lg/100 150ml加入80wt%乙醇中(B卩Ig石斛粉末加入100 150ml 80wt%乙醇)，80 90°C回流提取2 3次，每次O. 5 lh，抽濾后取濾渣；往濾渣中按質(zhì)量體積比lg/100 150ml加入蒸懼水(即Ig濾洛加入100 150ml蒸懼水),80 90°C回流提取2 3次,每次O. 5 lh，抽濾后取濾液，合并濾液，用蒸餾水定容至50mL，搖勻，得到石斛樣品溶液；
所述的石斛粉末優(yōu)選為過60目篩的干燥石斛粉末；
所述的石斛精多糖溶液優(yōu)選采用以下方法進(jìn)行制備取石斛精多糖，加蒸餾水配制成50 μ g · πιΓ1的石斛精多糖溶液；
所述的石斛精多糖優(yōu)選采用以下方法進(jìn)行制備
取石斛粉末，按質(zhì)量體積比lg/ΙΟ 15ml加入石油醚(S卩Ig石斛粉末加入10 15ml石油醚)，80 90°C回流提取2 3次，每次O. 5 lh，抽濾后取濾渣A ;按質(zhì)量體積比 lg/ΙΟ 15ml往濾禮:A中加入80wt%乙醇(B卩Ig濾禮:加入10 15ml 80wt%乙醇),80 90°C回流提取2 3次，每次O. 5 lh，抽濾后取濾渣B ;于60°C將濾渣B烘干，得到脫脂干粉；按質(zhì)量體積比lg/ΙΟ 15ml往脫脂干粉加入蒸餾水(即Ig脫脂干粉加入10 15ml 蒸餾水)，80 90°C回流提取2 3次，每次O. 5 lh，抽濾后取濾液，合并濾液，60°C減壓濃縮旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，收集濃縮液；往濃縮液中加入4°C預(yù)冷無水乙醇至溶液含醇量為80wt%，靜置過夜，離心，收集沉淀，干燥，得到石斛粗多糖；
取石斛粗多糖，配制成40mg · mr1的石斛粗多糖溶液；按體積比O. 4 :1往 40mg · πιΓ1石斛粗多糖溶液中加入Img · πιΓ1的胰蛋白酶，得到混合液，37°C恒溫處理5h后于95°C滅活5min,加入Sevag溶液,常溫震蕩培養(yǎng)5min后于10°C、3500rpm離心5min,保存上層溶液，取下層溶液，加入Sevag溶液，重復(fù)振蕩培養(yǎng)和離心操作3次，合并上層溶液，用蒸餾水過夜透析后加入預(yù)冷無水乙醇至溶液含醇量為80wt%，靜置過夜，離心，收集沉淀，干燥，得到石斛精多糖；
所述的石斛粉末優(yōu)選為過60目篩的干燥石斛粉末；
所述的石油醚優(yōu)選為沸點(diǎn)60 90°C的石油醚；
所述的濃縮優(yōu)選于60°C減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至20 50ml ；
所述的預(yù)冷無水乙醇優(yōu)選為4°C無水乙醇；
所述的靜置過夜的溫度優(yōu)選為4°C ；
所述的離心優(yōu)選為于4°C、12, OOOrpm離心5min ；
所述的干燥的條件優(yōu)選為_80°C冷凍干燥72h ；5
所述的石斛粗多糖溶液優(yōu)選采用以下方法進(jìn)行配制將石斛粗多糖加入蒸餾水中，80°C加熱溶解后冷卻至室溫，即得；
所述的Sevag溶液優(yōu)選采用以下方法進(jìn)行配制將氯仿和正丁醇按體積比為4 1 混合均勻，得到Sevag溶液；
所述的Sevag溶液的體積優(yōu)選為所述的混合液的體積的1/3 ；
所述的振蕩培養(yǎng)的頻率優(yōu)選為1，OOOrpm ；
所述的過夜透析優(yōu)選采用截留分子量7500D的透析袋；過夜透析的作用在于除去無機(jī)鹽、小分子雜質(zhì)及色素；
所述石斛多糖含量的測定方法可應(yīng)用于測定各種石斛藥材如鐵皮石斛和金釵石斛的石斛多糖的含量。
本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果
本發(fā)明采用熱水浸提法提取石斛粗多糖、采用Sevag法和透析法脫蛋白獲得石斛精多糖，所得的石斛精多糖純度高、雜質(zhì)少；與現(xiàn)有超聲波、酸堿提取等方法相比，本發(fā)明通過測定一種石斛的換算因子，依據(jù)此換算因子測定其他不同來源的石斛多糖的含量，不需要重新制備粗多糖和精多糖，能有效地降低材料的使用成本，并能夠批量的測定多種石斛的多糖含量，使石斛多糖的檢測更為方便、簡捷、科學(xué)。同時(shí)，本發(fā)明所述的石斛多糖含量的測定方法能夠精確地檢測石斛多糖的含量，給石斛品種的鑒定提供參考，給石斛育種、生產(chǎn)和市場消費(fèi)提供有效的指引。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
實(shí)施例I
一種鐵皮石斛多糖含量的測定方法，包括以下步驟
(I)石斛粉末的制備選取來自云南的組培鐵皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)成熟植株，105°C殺青15min,60°C烘干至恒重,磨成粉末,過60目篩,得到鐵皮石斛干燥粉末；
(2)粗多糖的制備稱取鐵皮石斛干燥粉末50g，加入750ml石油醚(沸點(diǎn) 60-900C )，80°C回流提取2次，每次lh，抽濾后得到濾渣A ;往濾渣A加入750ml 80wt%乙醇溶液，80°C回流提取2次，每次lh，抽濾后得到濾渣B，將濾渣B于60°C烘干，得到脫脂干粉； 往脫脂干粉加750ml蒸餾水，80°C回流提取2次，每次lh，抽濾后取濾液，合并濾液，60°C減壓濃縮，收集濃縮液；往濃縮液中加入預(yù)冷無水乙醇至溶液含醇量為80wt%，4°C放置過夜， 40C、12，OOOrpm離心5min，收集沉淀，_80°C冷凍干燥72h，得到石斛粗多糖；
(3)精多糖的制備稱取步驟(2)的粗多糖4g溶于IOOml蒸餾水中，得40mg ι Γ1 粗多糖溶液，80°C加熱溶解后冷卻至室溫，加入Img · πιΓ1的胰蛋白酶36ml，得到混合液， 37 °C恒溫處理5h，95°C滅活酶5min后，向上述處理過(加入Img -πιΓ1的胰蛋白酶36ml，37 °C 恒溫處理5h ;95°C滅活酶5min)的混合液中加入1/3體積的Sevag溶液(氯仿正丁醇體積比為4 :1)，常溫I, OOOrpm震蕩培養(yǎng)5min，然后10°C >3, 500rpm離心lOmin，保存上層溶液， 取下層溶液，按體積比3 1往下層溶液中加入Sevag溶液，重復(fù)振蕩培養(yǎng)和離心操作3次， 合并上層溶液，用蒸餾水過夜透析(透析袋截留分子量7500D)后加入4°C下預(yù)冷的無水乙醇至溶液含醇量為80wt%，4°C放置過夜，40C、12，OOOrpm離心5min，收集沉淀，_80°C冷凍干燥72h，得到石斛精多糖；
(4)樣品溶液的制備稱取過60目篩的鐵皮石斛干燥粉末O. Ig,溶于15ml80wt% 乙醇，80°C回流提取Ih后抽濾，取濾渣，重復(fù)回流提取I次后抽濾，所得濾渣溶于15ml蒸餾水，80°C回流提取Ih后抽濾，保存濾液，所得的濾渣揮干溶媒后于15ml蒸餾水重復(fù)回流提取I次，抽濾后取濾液，合并濾液，蒸餾水定容至50mL，搖勻，得到樣品溶液；
(5)改良苯酚_硫酸法測定石斛多糖的含量
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別吸取0、0. 2,0. 4,0. 6,0. 8、I. O、I. 2、I. 4、I. 6,2. Oml 的 O. 05mg · ml/1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液,各加蒸懼水補(bǔ)至2. Oml,然后各加6wt%重蒸苯酹I. Oml,搖勻后加入濃度為98wt%濃硫酸5. 0ml，搖勻，放置5min后置沸水浴中加熱20min，冷卻至室溫，于490nm處測吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為 y=0. 0586x+0. 0338 (R2=O. 997)。
換算因子(f)的測定稱取步驟(3)的干燥至恒重的石斛精多糖50mg，溶于50ml 蒸餾水，得到Img -πιΓ1的石斛精多糖溶液A ;取Img -πιΓ1的石斛精多糖溶液A 5ml，加蒸餾水定容至100ml，搖勻，得到50μ g · πιΓ1的石斛精多糖溶液B ;取50 μ g · πιΓ1石斛精多糖溶液B O. 05ml,加蒸懼水補(bǔ)足至2. Oml,各加6wt%重蒸苯酹溶液I. Oml,搖勻后加入98wt% 濃硫酸5. 0ml，搖勻，靜置5min后置沸水浴中加熱20min，冷卻至室溫，于490nm處測定吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算石斛精多糖溶液B的濃度；計(jì)算換算因子f :f = Cs/C=2. 760，其中， Cs為石斛精多糖溶液B的實(shí)際濃度，C為回歸方程計(jì)算石斛精多糖溶液B的濃度；
樣品溶液中石斛多糖含量的測定吸取步驟(4)的樣品溶液O. 08ml，各加蒸餾水補(bǔ)至2. Oml，然后各加6wt%重蒸苯酌· I. Oml,搖勻后加入98wt%濃硫酸5. Oml,搖勻， 靜置5min后置沸水浴中加熱20min,冷卻至室溫，于490nm處測定吸光度，由回歸方程 y=0. 0586X+0. 0338計(jì)算石斛樣品溶液中石斛多糖的濃度，由下述公式計(jì)算石斛樣品溶液中石斛多糖含量(X):X=fXC’ XDXlOO0Vff= (2. 760X5. 618X IO^6X2500) X 100%/0. 1=38. 8%
式中f-鐵皮石斛多糖相當(dāng)于葡萄糖的校正系數(shù)(即換算因子)，C’ -由回歸方程得到的石斛樣品溶液中的葡萄糖含量，D--樣品(石斛干燥粉末)測定中的稀釋倍數(shù)， W-石斛干燥粉末質(zhì)量。
實(shí)施例2
—種測定雜交春石斛多糖含量的方法，包括以下步驟
(I)石斛粉末的制備選取經(jīng)馴化兩年的云南野生金釵石斛(Dendrobium nobile Lindl)2年生成熟莖段，105°C殺青15min，60°C烘干至恒重，磨成粉末，過60目篩，得到野生金釵石斛干燥粉末；
分別取從日本引進(jìn)的36種雜交春石斛(Nobile-type Dendrobium)成熟莖段和組培金釵成熟莖段(均為2年生)，105°C殺青15min，60°C烘干至恒重，磨成粉末，過60目篩得雜交春石斛干燥粉末；
(2)粗多糖的制備同實(shí)施例I步驟(2)，其區(qū)別僅在于所用粉末為野生金釵石斛干燥粉末；
(3)精多糖的制備操作同實(shí)施例I步驟(3)；
(4)樣品溶液的制備分別稱取上述野生金釵石斛干燥粉末和雜交春石斛干燥粉末O. lg，溶于15ml 80￥丨％的乙醇，80°C回流提取Ih后抽濾，取濾渣，重復(fù)回流提取I次后抽濾，所得濾渣溶于15ml蒸餾水，80°C回流提取Ih后抽濾，保存濾液，所得的濾渣揮干溶媒后于15ml蒸餾水重復(fù)回流提取I次，抽濾后取濾液，合并濾液，蒸餾水定容至50mL，搖勻，得到樣品溶液；
(5)改良苯酚_硫酸法測定石斛多糖的含量
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別吸取0、0. 2,0. 4,0. 6,0. 8、I. O、I. 2、I. 4、I. 6,2. Oml 的 O. 05mg · ml/1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液,各加蒸懼水補(bǔ)至2. Oml,然后各加6wt%重蒸苯酹I. Oml,搖勻后加入98wt%濃硫酸5. 0ml，搖勻，放置5min后置沸水浴中加熱20min，冷卻至室溫，于 490nm處測吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為 y=0. 0586x+0. 0338 (R2=O. 997)。
換算因子(f)的測定稱取步驟(3)的干燥至恒重的石斛精多糖50mg，溶于50ml 蒸餾水，得到Img · πιΓ1的石斛精多糖溶液A ;取Img · πιΓ1的石斛精多糖溶液A 5ml，加蒸餾水定容至100ml，搖勻，得到50μ g · πιΓ1的石斛精多糖溶液B ;取50 μ g · πιΓ1石斛精多糖溶液B O. 5ml,加蒸懼水補(bǔ)足至2. Oml,各加6wt%重蒸苯酹溶液I. Oml,搖勻后加入98wt% 濃硫酸5. 0ml，搖勻，靜置5min后置沸水浴中加熱20min，冷卻至室溫，于490nm處測定吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算石斛精多糖溶液B的濃度；計(jì)算換算因子f :f = Cs/C=2. 445，其中， Cs為石斛精多糖溶液B的實(shí)際濃度，C為回歸方程計(jì)算石斛精多糖溶液B的濃度；
樣品中多糖含量的測定吸取步驟(4)的樣品溶液O. 5ml，各加蒸餾水補(bǔ)至2. Oml, 然后各加6wt%重蒸苯酹I. Oml,搖勻后加入98wt%濃硫酸5. Oml,搖勻，靜置5min后置沸水浴中加熱20min，冷卻至室溫，于490nm處測定吸光度，由回歸方程y=0. 0586x+0. 0338計(jì)算石斛樣品溶液中石斛多糖的濃度，由下述公式計(jì)算野生金釵石斛樣品溶液中石斛多糖含量 (X) :X=fXC’ XDXlOO0Vff= (2. 445X5. 942X 10—6X800) X 100%/0. 1=11. 62% ；
式中f_野生金釵石斛多糖相當(dāng)于葡萄糖的校正系數(shù)(即換算因子)，C’ -由回歸方程得到的石斛樣品溶液中的葡萄糖含量，D-樣品(石斛干燥粉末)測定中的稀釋倍數(shù)， W—石斛干燥粉末的質(zhì)量；
以野生金釵石斛的換算因子f作為參考值，測定其他雜交春石斛的多糖含量，結(jié)果如表I所示
表I雜交春石斛多糖含量測定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種石斛多糖含量的測定方法，其特征在于包括以下步驟 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別吸取 0,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8、I. O、I. 2、I. 4、I. 6,2. Oml 的O. 05mg · ml/1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液,各加蒸懼水補(bǔ)至2. Oml,然后各加6wt%重蒸苯酹I. Oml,搖勻后加入98wt%濃硫酸5. 0ml，搖勻，靜置5min后置沸水浴中加熱20min，冷卻至室溫，于490nm處測定吸光度；以吸光度為縱坐標(biāo)、葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程； 換算因子的測定取50μ g -mr1石斛精多糖溶液O. 05 1ml，加蒸餾水補(bǔ)足至2. Oml,各加6wt%重蒸苯酹溶液I. Oml,搖勻后加入98wt%濃硫酸5. Oml,搖勻,靜置5min后置沸水浴中加熱20min，冷卻至室溫，于490nm處測定吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算石斛精多糖溶液的濃度；計(jì)算換算因子f :f = Cs/C，其中，Cs為石斛精多糖溶液的實(shí)際濃度，C為回歸方程計(jì)算石斛精多糖溶液的濃度； 石斛樣品溶液中石斛多糖含量的測定吸取石斛樣品溶液O. 05 1ml，各加蒸餾水補(bǔ)至2. Oml，然后各加6wt%重蒸苯酌· I. Oml,搖勻后加入98wt%濃硫酸5. Oml,搖勻，靜置5min后置沸水浴中加熱20min,冷卻至室溫，于490nm處測定吸光度，由回歸方程計(jì)算石斛樣品溶液中石斛多糖的濃度，由下述公式計(jì)算石斛樣品溶液中石斛多糖含量X :X=fXC，XDX100%/ff ; 式中f-換算因子，C’ -由回歸方程得到的石斛樣品溶液中的葡萄糖含量，D-石斛干燥粉末測定中的稀釋倍數(shù)，W-石斛干燥粉末的質(zhì)量。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的石斛多糖含量的測定方法，其特征在于所述的石斛樣品溶液采用以下方法進(jìn)行制備將石斛粉末按質(zhì)量體積比lg/100 150ml加入80wt%乙醇中，80 90°C回流提取2 3次，每次O. 5 lh，抽濾后取濾渣；往濾渣中按質(zhì)量體積比lg/100 150ml加入蒸懼水,80 90°C回流提取2 3次，每次O. 5 Ih,抽濾后取濾液，合并濾液，用蒸餾水定容至50mL，搖勻，得到石斛樣品溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的石斛多糖含量的測定方法，其特征在于所述的石斛精多糖采用以下方法進(jìn)行制備 取石斛粉末，按質(zhì)量體積比lg/ΙΟ 15ml加入石油醚，80 90°C回流提取2 3次，每次O. 5 lh，抽濾后取濾渣A ;按質(zhì)量體積比lg/ΙΟ 15ml往濾渣A中加入80wt%乙醇，80 90°C回流提取2 3次，每次O. 5 lh，抽濾后取濾渣B ;于60°C將濾渣B烘干，得到脫脂干粉；按質(zhì)量體積比lg/ΙΟ 15ml往脫脂干粉加入蒸餾水，80 90°C回流提取2 3次，每次O. 5 lh，抽濾后取濾液，合并濾液，濃縮，收集濃縮液；往濃縮液中加入預(yù)冷無水乙醇至溶液含醇量為80wt%，靜置過夜，離心，收集沉淀，干燥，得到石斛粗多糖； 取石斛粗多糖，配制成40mg -πιΓ1的石斛粗多糖溶液；按體積比O. 4 :1往40mg -πιΓ1石斛粗多糖溶液中加入Img · πιΓ1的胰蛋白酶，得到混合液，37°C恒溫處理5h后于95°C滅活5min，加入Sevag溶液，常溫震蕩培養(yǎng)5min后于10°C、3500rpm離心5min，保存上層溶液，取下層溶液，加入Sevag溶液，重復(fù)振蕩培養(yǎng)和離心操作3次，合并上層溶液，用蒸餾水過夜透析后加入4°C預(yù)冷無水乙醇至溶液含醇量為80wt%,靜置過夜,離心，收集沉淀,干燥，得到石斛精多糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的石斛多糖含量的測定方法，其特征在于 所述的濃縮于60°C減壓濃縮至20 50ml ;所述的離心的條件為于4°C、12，OOOrpm離心 5min。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的石斛多糖含量的測定方法，其特征在于所述的Sevag溶液采用以下方法進(jìn)行配 制將氯仿和正丁醇按體積比為4 1混合均勻，得到Sevag溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的石斛多糖含量的測定方法，其特征在于所述的Sevag溶液的體積為所述的混合液的體積的1/3。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的石斛多糖含量的測定方法，其特征在于 所述的石斛粉末為過60目篩的干燥石斛粉末；所述的干燥的條件為_80°C冷凍干燥72h ;所述的振蕩培養(yǎng)的頻率為1，OOOrpm ； 所述的石斛粗多糖溶液采用以下方法進(jìn)行配制將石斛粗多糖加入蒸餾水中，80°C加熱溶解后冷卻至室溫，得到石斛粗多糖溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的石斛多糖含量的測定方法，其特征在于步驟(I)中所述的石斛粉末為過60目篩的干燥石斛粉末。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的石斛多糖含量的測定方法，其特征在于步驟(2)中所述的石斛精多糖溶液采用以下方法進(jìn)行制備取石斛精多糖，加蒸餾水配制成50μ g · ml—1的石斛精多糖溶液。
10.權(quán)利要求I 9任一項(xiàng)所述的石斛多糖含量的測定方法的應(yīng)用，其特征在于所述的石斛多糖含量的測定方法應(yīng)用于測定各種石斛藥材中石斛多糖的含量。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種測定石斛多糖含量的方法及其應(yīng)用。本發(fā)明采用熱水浸提法提取石斛粗多糖、采用Sevag法和透析法脫蛋白獲得石斛精多糖，通過測定一種石斛的換算因子，依據(jù)此換算因子測定其他不同來源的石斛多糖的含量，不需要重新制備粗多糖和精多糖，能有效地降低材料的使用成本，并能夠批量的測定多種石斛的多糖含量，使石斛多糖的檢測更為方便、簡捷、科學(xué)。本發(fā)明得到的石斛精多糖純度高、雜質(zhì)少；與現(xiàn)有超聲波提取、酸堿提取等方法相比，本發(fā)明的測定方法能夠精確地檢測石斛多糖的含量，給石斛品種的鑒定提供參考，也給石斛育種、生產(chǎn)和市場消費(fèi)提供有效的指引。
文檔編號(hào)G01N21/31GK102928373SQ20121048883
公開日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月26日
發(fā)明者王再花, 朱根發(fā), 葉慶生, 章金輝, 操君喜, 孫延?xùn)| 申請(qǐng)人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所, 華南師范大學(xué)