專利名稱：：磺胺甲噁唑單克隆抗體試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及獸藥殘留檢測(cè)分析
技術(shù)領(lǐng)域：
中一種檢測(cè)磺胺甲噁唑的酶聯(lián)免疫試劑盒及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：磺胺甲噁唑是應(yīng)用廣泛的磺胺類抗生素之一，它有效地控制了動(dòng)物疾病，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，在降低動(dòng)物源性病原菌排放改進(jìn)公共衛(wèi)生方面，發(fā)揮了及其重要的作用，取得了良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益；但長(zhǎng)期和大劑量使用，使得磺胺藥在體內(nèi)蓄積，造成藥物在人體和動(dòng)物組織內(nèi)殘留，從而潛在危害人體健康。人體中磺胺藥的蓄積會(huì)導(dǎo)致磺胺藥抗藥性的產(chǎn)生，且具有潛在的致癌、致突變性。因此，聯(lián)合國食品法典委員會(huì)(CAC)和許多國家規(guī)定，食品和飼料中磺胺甲噁唑等磺胺類物質(zhì)單個(gè)含量均不得超過100ng/kg。檢測(cè)磺胺甲噁唑殘留量的方法主要有微生物法、儀器檢測(cè)法、免疫化學(xué)法。其中儀器檢測(cè)法包括熒光光度法、薄層色譜法(TLC)、氣相色譜法(GM)、氣-質(zhì)聯(lián)機(jī)法(GC/MS)、高效液相色譜法(HPLC)、液-質(zhì)聯(lián)機(jī)法(HPLC/MS)、毛細(xì)管電泳法(CE)等，由于復(fù)雜的儀器設(shè)備和繁瑣的過程，不適合現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣本篩査。發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)磺胺甲噁唑的酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明所提供的檢測(cè)磺胺甲噁唑的單克隆抗體試劑盒，包括磺胺甲噁唑特異性單抗、包被的磺胺甲噁唑與載體蛋白偶聯(lián)物和酶標(biāo)二抗。其中，所述磺胺甲噁唑特異性抗體為磺胺甲噁唑單克隆抗體，為優(yōu)選的磺胺甲噁唑鼠單克隆抗體，該單抗按常規(guī)方法制備；所述載體蛋白可為牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、卵清蛋白(OVA)、血蘭蛋白(KLH)等常用載體蛋白，所述磺胺甲噁唑與載體蛋白的偶聯(lián)物可通過將磺胺甲噁唑和載體蛋白用戊二醒法或重氮化法進(jìn)行偶聯(lián)得到；所述標(biāo)記酶可為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶，優(yōu)選為辣根過氧化物酶，辣根過氧化物酶可通過戊二醛法或過碘酸鈉法交聯(lián)在二抗上；所述二抗優(yōu)選為抗鼠或抗兔抗抗體。為了更為方便現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣本篩查，上述試劑盒還包括磺胺甲噁唑標(biāo)準(zhǔn)溶液、顯色劑、顯色稀釋液、濃縮洗滌液、終止液。所述顯色劑由顯色液A液和顯色液B液組成，所述顯色液A液為過氧化氫，所述B液為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，所述顯色稀釋液為醋酸鈉溶液；所述濃縮洗滌液為0.05%-1.2%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液；所述終止液為l-2mol/L的硫酸溶液。本發(fā)明的檢測(cè)原理為將磺胺甲噁唑與載體蛋白的偶聯(lián)物做為包被原吸附于固相載體上，加入樣品和磺胺甲噁唑單克隆抗體，加入酶標(biāo)二抗，顯色后終止，測(cè)樣品吸光值，該值與樣品中磺胺甲噁唑殘留物含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出磺胺甲噁唑的含量，根據(jù)酶標(biāo)板上樣品顏色的深淺能得出大致濃度范圍。本發(fā)明的檢測(cè)磺胺甲噁唑的酶聯(lián)免疫試劑盒主要采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法定性或定量檢測(cè)動(dòng)物組織、血清、尿樣、牛奶及飼料等樣品中磺胺甲噁唑的殘留量；對(duì)樣品前處理要求低、樣品前處理過程簡(jiǎn)單、能同時(shí)快速檢測(cè)大批樣品；采用高特異性的磺胺甲噁唑單克隆抗體，主要試劑均以工作液形式提供，檢測(cè)方法簡(jiǎn)便易行；具有高特異性、高靈敏度、高精確度、高準(zhǔn)確度等特點(diǎn)，將在食品和詞料磺胺甲噁唑殘留量的檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。圖1為檢測(cè)磺胺甲噁唑的酶聯(lián)免疫試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖圖2為磺胺甲噁唑標(biāo)準(zhǔn)曲線具體實(shí)施方式實(shí)施例1抗原及抗體的制備1.磺胺甲噁唑-載體蛋白偶聯(lián)物的制備(1)參照1999年FmakeM,etal.報(bào)道的方法合成SMZ-HSA全抗原，具體步驟如下首先取20mgSMZ加到300nl二甲基甲酰胺溶液中，再緩慢加到lml0.5mol/LH2SO4中，然后在磁力攪拌下將lmllmol/LNaN02緩慢加到SMZ溶液中，反應(yīng)10min，形成重氮鹽。(2)磁力攪拌下，分別取100mgHSA和100mgOVA各加到4ml磷酸鹽緩沖液中。(3)將上述形成的重氮化鹽溶液在磁力攪拌下緩慢加到HSA溶液和OVA溶液中,用1MNaOH將pH維持在8-10，4。C反應(yīng)lh;(4)將反應(yīng)液放在生理鹽水中透析3d，每天更換2次生理鹽水，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)及SMZ等。(5)將橙色的SMZ-HSA和SMZ-OVA溶液分成兩部分，一部分于4'C下保存供紫外和液相測(cè)試用，另一部分于-20。C下保存。2.抗磺胺甲噁唑單克隆抗體的制備(1)免疫利用申請(qǐng)人所制備的磺胺甲噁唑-人血清白蛋白(HSA)偶聯(lián)物免疫Balb/C小鼠(購自中國軍事科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，免試程序是選用6-8周齡雌性Balb/c小鼠4只，體重18-22g，取免疫抗原100mg(以蛋白含量計(jì)算)，加等體積完全弗氏佐劑乳化，用注射器在安培瓶中反復(fù)抽吸攪拌，直至乳化藥液在水中呈不溶液滴(水包油狀態(tài))。于Balb/C小鼠頸背部皮下多點(diǎn)注射進(jìn)行一免，每只小鼠0.5ml;間隔兩周后，抗原量減半用弗氏不完全佐劑混合，方法同上，進(jìn)行第二次免疫，再過兩周后，進(jìn)行第三次免疫，方法同前次。三免后10d免疫鼠尾靜脈采血，通過間接ELISA方法測(cè)定免疫鼠血清抗體效價(jià)。選擇抗體效價(jià)較高者用于細(xì)胞融合，融合前二天給小鼠脾內(nèi)注射含30嗎免疫抗原水劑進(jìn)行加強(qiáng)免疫。(2)單抗制備免疫鼠眼眶取血后，脊椎脫臼處死，消毒后置于超凈工作臺(tái)上的消毒表面皿中，小心取出經(jīng)免疫已腫大的脾臟，用DMEM培養(yǎng)基沖洗2次，每次3ml。經(jīng)計(jì)數(shù)細(xì)胞共有5.6"08個(gè)，在37。C水浴中，將SP2/0細(xì)胞(由北京大學(xué)生命學(xué)院?jiǎn)慰故姨峁?和脾細(xì)胞按10:1比例混合于50ml離心管中，輕輕攪勻，1000rpm離心5min，棄上清，彈擊管底使細(xì)胞混勻成糊狀。將離心管置于37'C水浴中，吸管吸取37'C預(yù)熱的0.8ml50%PEG1500(購自Sigma公司)，將吸管插入離心管的底部，左手慢慢旋管，右手邊攪邊加，lmin內(nèi)加完，將融合液緩緩吸入吸管中，保持0.5min，然后慢慢放出，lmin內(nèi)完全放出，并于離心管中靜置lmin。靜置之后，立即沿管壁滴加5mlIDMEM不完全培養(yǎng)基(配方DMEM(袋裝)13.5g，青霉素鈉(注射用)10萬單位，硫酸鏈霉素(注射用)IO萬單位，NaHC033.7g，用重蒸水稀釋至1000ml，并用O.lmol/LNaOH或HC1調(diào)節(jié)pH為7.4)終止融合反應(yīng)，邊加邊緩慢攪拌，前0.5min加入2ml，后0.5min加入3ml，然后在lmin內(nèi)加完5ml。補(bǔ)加IDMEM培養(yǎng)基至40ml，1000rpm離心5min，棄上清。吸管吸取lmlHAT(配方20ml胎牛血清，lmlHAT,79mlDMEM配成100ml)選擇培養(yǎng)基后，插入離心管底部，邊輕輕攪拌邊加入，使細(xì)胞懸浮，不能吹，然后補(bǔ)加HAT至40ml，并輕輕混勻細(xì)胞，每孔O.lml加入已鋪好飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中，共鋪4塊板。融合后隔日更換HAT培養(yǎng)液。融合3-4天后，可見有小量細(xì)胞克隆，在融合10天后，換用HT培養(yǎng)基(配方20ml胎牛血清，lmlHT'80mlDMEM配成1OOml)，大約在12-16天左右，雜交瘤細(xì)胞克隆生長(zhǎng)至孔底1/4，采用間接ELISA檢測(cè)培養(yǎng)液上清中的特異性抗體，統(tǒng)計(jì)有雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和陽性雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的孔數(shù)，計(jì)算融合率和陽性率。采用磺胺甲噁唑-卵清蛋白作為篩選抗原，利用ELISA方法篩選出分泌抗磺胺甲噁唑的陽性孔。對(duì)篩選出來的陽性孔立刻用有限稀釋法按每孔10、5、2個(gè)細(xì)胞的比例，將細(xì)胞放入預(yù)先鋪好飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)板中培養(yǎng)。觀察克隆化細(xì)胞數(shù)目及狀態(tài)，并及時(shí)測(cè)定每孔上清液陽性，直至找到陽性的單克隆細(xì)胞株，最終篩選出分泌抗磺胺甲噁唑的單克隆雜交瘤細(xì)胞系，該細(xì)胞系編號(hào)為A-7-l，于2008年3月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號(hào)CGMCCNo.2411。對(duì)該細(xì)胞系進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示SP2/0骨髓瘤細(xì)胞的染色體數(shù)為36對(duì)，Balb/C小鼠脾臟細(xì)胞的染色體數(shù)為20對(duì)，而該雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目為96-102條之間，可見本試驗(yàn)所得的單克隆抗體細(xì)胞株的染色體數(shù)與兩親本細(xì)胞的染色體數(shù)之和基本相似，證明此細(xì)胞為兩親本細(xì)胞融合的產(chǎn)物。將該細(xì)胞系注射Balb/C小鼠腹腔，生產(chǎn)出單克隆抗體。采用購自Sigma公司的鼠單抗定型ImmunotypeTM試劑盒對(duì)本發(fā)明所得到的單克隆抗體進(jìn)行亞型鑒定，結(jié)果為小鼠IgG,亞類。3、抗磺胺甲噁唑單克隆抗體的純化具體步驟如下4ml0.06mol/LpH4.8的HAc-NaAc緩沖液分為兩部分，大部分與lml腹水混合，并輕輕攪拌均勻；另有少量的HAc-Aac緩沖液與辛酸(共需辛酸33pL)混合成乳濁液。將辛酸乳濁液慢慢滴加入腹水溶液中，邊加邊輕輕攪拌，加完后持續(xù)攪拌30min,此時(shí)有大量的白色沉淀。室溫下12000rpm離心30min，留上清液棄掉沉淀，滴加等體積4°CpH7.4的飽和硫酸銨溶液，邊加邊攪拌，用1.0mol/LNaOH溶液調(diào)pH為7.4，溶液析出大量沉淀，溶液4。C靜置2h后，4。C12000卬m離心30min。去上清，將沉淀溶解于0.01mol/LpH7.4PBS中，對(duì)PBS透析除鹽4次，最后抗體溶液中滴加0.02%NaN3，分裝置于-2(TC保存。測(cè)定蛋白濃度為8.25mg/ml。用MbaTrapTMG親和層析柱純化抗體，腹水經(jīng)平衡緩沖液(PB，0.02mol/LpH7.0)適當(dāng)稀釋后，上樣用于平衡緩沖液平衡好的MbaTarpTMG親和柱，用平衡緩沖液徹底洗去雜蛋白后，換洗脫液(Gly-HCI，0.01mol/L，pH2.7)將抗體洗下，洗下的抗體立即用中和緩沖液(Tris-HCI，lmol/L，PH9.0)中和，使pH恢復(fù)至7.0左右，以免失去活性。4、磺胺甲噁唑兔多克隆抗體的制備新西蘭大白兔3只，平均體重2.5kg，單籠飼養(yǎng)。首免取適量合成的免疫原，用滅菌生理鹽水稀釋后與等量的弗氏完全佐劑混勻，用無菌注射器充分乳化。每只兔子注射抗原量為lmg/mL，經(jīng)背部皮內(nèi)多點(diǎn)注射；二免和三免時(shí)將弗氏完全佐劑更換為弗氏不完全佐劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，三免后第7天，兔耳緣靜脈采lmL全血，取血清，用間接ELISA測(cè)定血清效價(jià)。效價(jià)達(dá)到要求后，進(jìn)行加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫后第7天頸動(dòng)脈采血。經(jīng)飽和硫酸銨沉淀法得到純化的多克隆抗體。5、二抗的制備以羊作為免疫動(dòng)物，以鼠或兔IgG為免疫原進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠或羊抗兔抗抗體實(shí)施例2檢測(cè)磺胺甲噁唑單克隆抗體試劑盒組裝1.磺胺甲噁唑單克隆抗體試劑盒的結(jié)構(gòu)試劑盒的結(jié)構(gòu)如圖l所示，主要包括l盒體，2鋁膜真空包裝96孔酶標(biāo)板，3標(biāo)準(zhǔn)磺胺甲噁唑抗原，4酶結(jié)合物工作液，5磺胺甲噁唑單克隆抗體工作液，6顯色液A液，7顯色液B液，8顯色液稀釋液，9濃縮洗滌液，IO終止液，ll泡沬托架，泡沫托架上有凹孔，上述試劑瓶均放在凹孔內(nèi)，泡沫托架和酶標(biāo)板放在盒體內(nèi)。其中酶標(biāo)板由塑料支架和可拆分的塑料條組成。2.所用試劑的配制A標(biāo)準(zhǔn)磺胺甲嗞唑抗原磺胺甲噁唑標(biāo)準(zhǔn)溶液6瓶，其濃度范圍在l-1000Mg/L。B包被液PH9.6，0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液。C封閉液10%的小牛血清。D濃縮洗滌液0.05°/。-1.2%吐溫的磷酸鹽緩沖液(0.01M,PH7.4)，是正常使用濃度的15倍，l瓶。E磺胺甲噁唑單克隆抗體工作液將抗體進(jìn)行104倍稀釋使用，即含有0.3-30mg/L的磺胺甲噁唑鼠源單克隆抗體，6-10ml/瓶，l瓶。F酶結(jié)合物工作液酶標(biāo)記抗鼠的抗抗體稀釋液，6-10ml/瓶，l瓶。G底物顯色液A液過氧化氫，6-10ml/瓶，l瓶。H底物顯色B液四甲基聯(lián)苯胺(TMB)lml/瓶，1瓶。I顯色液稀釋液0.2mol/L醋酸鈉溶液，10ml/瓶，1瓶。J終止液l-2M硫酸溶液，6-10ml/瓶，l瓶。3.酶標(biāo)板的制備磺胺甲噁唑和卵清蛋白偶聯(lián)物包被的酶標(biāo)板，制備方法如下用包被緩沖液將磺胺甲噁唑和卵清蛋白偶聯(lián)物稀釋成lug/ml，每孔100yl，4'C過夜，倒去包被液，用洗滌液洗三次，每次3min，拍干，然后每孔中加200ul封閉液，37'C溫育2h，倒去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。4.酶標(biāo)二抗的制備用改良的過碘酸鈉法來標(biāo)記辣根過氧化物酶。實(shí)施例3檢測(cè)樣品中殘留的磺胺甲噁唑l.樣品前處理(1)豬尿的預(yù)處理將供試尿液3000卬ra離心lOmin，取上清液體蒸干或在氮?dú)饬髦写蹈?，用lml0.01MpH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)(配方NaC18g,KC10.2g，Na2HPO4'12H2O2.9g,KH2PO40.2g)溶解殘留物。(2)牛奶樣品的預(yù)處理牛奶樣品經(jīng)3500rpm離心10min，取3ml加入6ml乙酸乙酯上下振蕩10min，室溫3000rpm離心10min，取2ml上層液體蒸干或在氮?dú)饬髦写蹈?，用lml0.01MpH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解殘留物。(3)組織樣品的預(yù)處理將待檢組織樣品勻漿，取3g待檢組織樣品加入6ml乙酸乙酯上下振蕩10min，室溫3000rpm離心10min，取2ml上層液體蒸干或在氮?dú)饬髦写蹈?，用lml0.01MpH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解殘留物。(4)雞蛋樣品的預(yù)處理吸取3ml蛋黃加入6ml乙酸乙酯上下振蕩10min，室溫3000rpm離心10min，取2ml上層液體蒸干或在氮?dú)饬髦写蹈?，用lml0.01MpH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解殘留物。(5)飼料樣品的預(yù)處理稱取飼料lg，加甲醇-水溶液，超聲波提取30min，取3ml上層液氮?dú)獯蹈?，用lml0.01MpH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解殘留物。2.檢測(cè)方法；(1)向96孔酶標(biāo)板各孔中預(yù)孵育30min的樣品或孵育30min的不同濃度標(biāo)準(zhǔn)抗原5(^1然后加磺胺甲噁唑單克隆抗體工作液5(Hi1，37'C孵育30min，洗滌三次，拍干。(2)加酶標(biāo)二抗每孔加入5000^羊抗鼠酶標(biāo)二抗100pl,37T:孵育30min，洗滌五次，拍干。(3)加底物加底物溶液，每孔100nl，室溫放置5min。(4)終止反應(yīng)加終止液5(V1,輕輕振蕩混勻。(5)讀數(shù)酶標(biāo)儀測(cè)定每孔的吸光光度值(OD值)。3.結(jié)果分析(1)計(jì)算每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品，待測(cè)樣和參照樣的OD450值。(2)以標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度為X軸，以抑制率為Y軸作圖，此圖為線性圖，其中，抑制率=(參照OD450-待測(cè)OD450)/參照孔x100。/。(3)利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣品中的抗原量如圖2所示。相對(duì)應(yīng)的每個(gè)樣品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出，也可以用回歸方程法，計(jì)算出樣品溶液濃度，利用計(jì)算機(jī)專業(yè)軟件，更利于大批量樣品的快速分析。根據(jù)酶標(biāo)板上的樣品顏色的深淺，與系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液顏色的比較，可判斷出樣品濃度大致范圍。實(shí)施例4試劑盒的靈敏度，特異性，精密度的測(cè)定和保存期實(shí)驗(yàn)(1)靈敏度的測(cè)定最低檢測(cè)限的定義有多種，本試驗(yàn)采用抑制率的10%表示最低檢測(cè)限。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，確定最低檢測(cè)限為10ng/mL。(2)特異性的測(cè)定選擇7種磺胺藥物，將不同濃度的磺胺藥代替SMZ標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定其標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算抑制濃度，計(jì)算交叉反應(yīng)率。公式交叉反應(yīng)率=50%抑制的SMZ濃度/50%競(jìng)爭(zhēng)物濃度X100%。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>圖中結(jié)果表明，試劑盒對(duì)其他7中磺胺藥的交叉反應(yīng)率均低于0.1%，說明該試劑盒針對(duì)磺胺甲噁唑特異性很高，可保證對(duì)動(dòng)物食品及飼料中磺胺甲噁唑殘留檢測(cè)結(jié)果的可靠性。(3)精密度試驗(yàn)精密度又可稱為可重復(fù)性，反映測(cè)定方法對(duì)某一特定樣本的多次測(cè)定所得結(jié)果的重復(fù)程度，這是質(zhì)量評(píng)價(jià)的基本參數(shù)，可以用變異系數(shù)表示。板內(nèi)變異系數(shù)從眾多的樣品中隨機(jī)抽取6個(gè)樣本按照試劑盒檢測(cè)模式進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣本8個(gè)重復(fù)。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>板間變異系數(shù):本試驗(yàn)共選擇5塊板，每塊板3個(gè)重復(fù)。隨機(jī)抽取2個(gè)樣品進(jìn)行板間變異系數(shù)的檢測(cè)。樣品酶標(biāo)板123'45NO.70.42'10.4100.4200.420NO.70.'1180.3750.3790.'Ill0.他肌70.4380.4080.4390.4000.380Ms3110.42670.4010.41570.41030.柳平均依:0.41342標(biāo)準(zhǔn)港0.02186變異系數(shù)5.1$NO.80.8230.8350.7910.7790.795肌80.7970.8080.7860.7890.813肌80.8310.7820.807.0.7920.802Ms3n0.8170.80830.79670.7900.8033f-均但:0.80818:0.01892變異系數(shù)2.3%_總的板問變異系數(shù)3.7%_(4)保存期實(shí)驗(yàn)試劑盒保存條件為2-8°C，經(jīng)過6個(gè)月的測(cè)定，試劑盒的最大吸光度值、磺胺甲噁唑添加實(shí)際測(cè)定值、50%濃度均在正常范圍之內(nèi)。同時(shí)做加速老化試驗(yàn)，將試劑盒放在37'C狀態(tài)下6天，測(cè)定結(jié)果表明試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全符合要求，再將試劑盒放入-2(TC冷凍6天，測(cè)定結(jié)果也表明試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全正常。從以上結(jié)果可得到試劑盒可以在2-8'C至少可以保存6個(gè)月以上。盡管本發(fā)明的內(nèi)容是結(jié)合本實(shí)施例進(jìn)行說明，但是不能認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明范圍的限制，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書限定。另外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在所附權(quán)利要求書限定的范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)或修飾，這些改動(dòng)或修飾形式同樣落在本發(fā)明的保護(hù)范圍。權(quán)利要求1.一種檢測(cè)磺胺甲噁唑的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括磺胺甲噁唑特異性抗體、包被了抗原的固相載體、磺胺甲噁唑標(biāo)準(zhǔn)溶液、酶結(jié)合物工作液、顯色劑、顯色劑稀釋液、濃縮洗滌液、終止液；所述顯色劑由顯色液A液和顯色液B液，所述顯色液A液為過氧化氫，所述B液為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)；所述顯色稀釋液為醋酸鈉溶液；所述洗滌液為0.05％-1.2％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液；所述終止液為1-2M的硫酸溶液；所述包被抗原過程中所用的包被緩沖液為PH9.6的碳酸鹽緩沖液，所用的封閉液為10％小牛血清。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述磺胺甲噁唑特異性抗體為磺胺甲噁唑單克隆抗體。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述二抗為抗鼠或抗兔抗抗體。4.根據(jù)權(quán)利要求1，2或3所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的酶結(jié)合工作液是通過改良的過碘酸納法來標(biāo)記辣根過氧化物酶。全文摘要本發(fā)明公開了一種檢測(cè)磺胺甲噁唑的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測(cè)方法。本發(fā)明所提供的檢測(cè)磺胺甲噁唑的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括磺胺甲噁唑特異性單抗及包被的磺胺甲噁唑與載體蛋白的偶聯(lián)物和酶標(biāo)二抗。該單克隆抗體由雜交瘤細(xì)胞系(保藏號(hào)為CGMCCNo.2411)所分泌得到的。本發(fā)明的的檢測(cè)磺胺甲噁唑的酶聯(lián)免疫試劑盒能同時(shí)快速檢測(cè)大批樣品；主要試劑以工作液形式提供，檢測(cè)方法方便易行；具有高特異性、高靈敏度、高精確度、高準(zhǔn)確度等特點(diǎn)，將在動(dòng)物性食品和飼料磺胺甲噁唑殘留量的檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。文檔編號(hào)G01N33/543GK101275947SQ20081009741公開日2008年10月1日申請(qǐng)日期2008年5月26日優(yōu)先權(quán)日2008年5月26日發(fā)明者吳國娟,吳紅軍,張中文,紅沈,王彥英,王星星,瑋郭,彥陸申請(qǐng)人:北京農(nóng)學(xué)院