本發(fā)明涉及一種自然殺傷細胞活性測定方法，屬于生物檢測領域。

背景技術：

nk細胞(naturalkillercells，nkcell，自然殺傷細胞)最初因為無需預先致敏便可殺傷自體腫瘤細胞，而被稱為天然免疫淋巴毒性細胞。經過數(shù)十年來對其表型及功能的細致研究，發(fā)現(xiàn)nk細胞的主要生物學功能主要有分泌細胞因子參與免疫調節(jié)及對靶細胞的直接殺傷作用[1，2]。nk細胞分布在不同組織中功能各異，不僅具有抗腫瘤、參與各種病理過程、維持免疫穩(wěn)態(tài)，還可促進妊娠期胎盤血管形成過程。與之相應，惡性腫瘤、各種感染、自身免疫性疾病等均涉及nk細胞紊亂[3-6]。

nk細胞殺傷活性是評價免疫狀態(tài)的重要指標，可用于監(jiān)測免疫治療過程中免疫狀態(tài)的改變等方面。已有文獻報道，其還與惡性宮頸癌化療療效、胰腺癌化療后生存情況及阿爾茨海默病進展速度相關[7-9]。在家族性或獲得性噬血細胞性淋巴組織細胞增多癥、炎癥、自身免疫性疾病及免疫缺陷病中nk殺傷活性受損是其特點之一，但由于該指標各實驗室結果無法比較，缺少正常參考值范圍，在相關疾病診斷中常作為其他診斷指標的確證指標[10]。nk殺傷活性檢測急需嚴謹、標準化的檢測分析方法及相應正常參考值范圍，解決其應用的瓶頸問題。

nk殺傷檢測方法的“金標準方法”是51cr釋放實驗，但由于放射性污染等問題限制了其在臨床檢測中的應用[11，12]。其他用于nk細胞殺傷活性檢測的方法還包括低毒染料calcein-am釋放實驗、ldh釋放實驗、基于流式細胞術或生物發(fā)光的檢測方法[13-17]。其中基于流式細胞術的檢測方法具有操作簡便、穩(wěn)定、污染少、基線低且與51cr釋放實驗方法相關性好等優(yōu)點，現(xiàn)臨床多采用此方法進行nk細胞殺傷活性檢測[14，18]。

但現(xiàn)有技術的方法僅以有核細胞數(shù)與靶細胞數(shù)計算，可能會導致檢測結果的偏移，無法實現(xiàn)對nk細胞殺傷能力的嚴謹評估。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種自然殺傷細胞活性測定方法，其特征在于包括以下步驟：

1)將靶細胞傳代培養(yǎng)；

2)對效應細胞中自然殺傷細胞比例進行分析；

3)將靶細胞與效應細胞按照設定的效靶比進行培養(yǎng)；

4)檢測步驟3)中待測靶細胞死亡率；

5)將步驟4)中靶細胞死亡率帶入公式計算自然殺傷細胞活性：

自然殺傷細胞活性＝(待測靶細胞死亡率-對照組靶細胞死亡率)/(1-對照組靶細胞死亡率)×100％。

進一步地，步驟3)中的效靶比為4以上。

進一步地，步驟1)中對傳代細胞進行密度和/或死亡率的質量控制。

進一步地，步驟2)中對效應細胞進行細胞密度、活細胞率及自然殺傷細胞比例至少之一的質量控制。

進一步地，所述質量控制方法包括將傳代培養(yǎng)的靶細胞進行染料標記。

進一步地，包括用抗體對自然殺傷細胞進行標記。

進一步地，控制靶細胞自然死亡率在3％以內。

進一步地，靶細胞與效應細胞fh1通道m(xù)if(平均熒光強度)值之比為80倍以上。

進一步地，步驟4)中，舍棄如下檢測度數(shù)：與僅有靶細胞對照管相比，效靶細胞混合孵育檢測管內靶細胞濃度低于前者85％。

進一步地，依據(jù)檢測對象是否患過腫瘤選擇效靶比。

本發(fā)明建立了一種全新的nk細胞殺傷活力檢測方法，在效應細胞與靶細胞比例計算時引入“nk細胞比例”及“有核細胞活率”參數(shù)，提高了該檢測的嚴謹性，同時與將nk細胞分選后進行檢測相比，不存在nk細胞磁珠分選成本高昂及流式細胞儀分選的機械損傷等問題。

本方法與以往傳統(tǒng)檢測方法相比，提高了不同來源樣本間nk細胞殺傷活力評估的可比性，具有更廣闊的應用前景。

本發(fā)明首次提出對該檢測各環(huán)節(jié)進行質量控制，目的是降低室間檢測的差異性，有望解決各實驗室檢測結果不能互相參考的現(xiàn)狀。

本發(fā)明首次評估可供不同實驗室參考的人外周血nk細胞殺傷活力正常參考值范圍。

附圖說明

圖1待檢標本有核細胞中nk細胞比例分布規(guī)律

圖2腫瘤患者組與健康志愿者組外周血nk細胞殺傷活性

具體實施方式

1資料與方法

1.1研究對象選取2014年6月至2016年10月在軍事醫(yī)學科學院附屬醫(yī)院就診查體健康志愿者及腫瘤患者共108例，收集年齡、性別及nk殺傷活性檢測相關結果。另收集其他nk殺傷活性檢測標本158例的有核細胞nk比例信息。參考值組入選標準：①健康人群；②血象正常；③簽署知情同意書。參考值排除標準：①免疫相關疾病者；②有服用激素及免疫調節(jié)劑應用史者；③3周內有明確感染者；④有心腦血管疾病者；⑤疑似或明確診斷為腫瘤患者；⑥其他影響免疫功能疾病或病史。

1.2試劑與儀器pi熒光染料、人nk細胞亞群分析用單克隆抗體(cd45-apc、cd56-pe、cd3-percp)及其同型對照購于美國bd公司，csfe熒光染料購于日本同仁公司，人淋巴細胞分離液購于天津灝洋華科生物科技有限公司，細胞培養(yǎng)用1640培養(yǎng)基及胎牛血清購于thremofisher公司。檢測用bdaccuric6流式細胞儀。

1.3實驗方法

1.3.1靶細胞的傳代培養(yǎng)：k562細胞按1-2×10⁵cells/ml密度，接種于含有20ml的1640完全培養(yǎng)基t75培養(yǎng)瓶中，每三天傳代一次，維持其良好增殖狀態(tài)。

1.3.2靶細胞的染料標記：收集k562細胞培養(yǎng)懸液于15ml離心管內，置于水平離心機內1000rpm離心10分鐘。用生理鹽水洗滌兩次后，單細胞狀態(tài)重懸于500ul無血清1640培養(yǎng)基中，充分混勻后取樣，使用c6計數(shù)待用。另取一定體積1640無血清培養(yǎng)基稀釋csfe染料工作液并充分混勻，將其迅速加入待用的k562細胞懸液中混勻，使csfe染料終濃度為5μm，細胞懸液密度為1×10⁷cells/ml。置于37℃的5％co2孵育箱內，每5分鐘搖動一次。孵育10分鐘后加入等體積4℃預冷的胎牛血清，置于4℃冰箱內終止染色反應10分鐘。補足生理鹽水混勻后1000rpm離心10分鐘，棄上清重懸于1640完全培養(yǎng)基中，置于孵育箱內孵育1小時。收集細胞，生理鹽水洗滌一次，1640完全培養(yǎng)基重懸細胞，取樣用c6計數(shù)待用。

1.3.3效應細胞的分離：如樣本是全血，則進行外周血單個核細胞(peripheralbloodmononuclearcell，pbmc)的分離，即將全血樣本1800rpm離心10分鐘，去血漿后等體積生理鹽水重選細胞，輕輕加在淋巴細胞分離液上離心后，小心吸走白膜層。用生理鹽水洗滌兩次，1640完全培養(yǎng)基重懸細胞，取樣稀釋于白細胞計數(shù)液，用c6計數(shù)待用。如樣本為免疫細胞培養(yǎng)產物，則僅用生理鹽水洗滌兩次。取樣稀釋于1640完全培養(yǎng)基中，用c6計數(shù)待用。

1.3.4效應細胞nk細胞亞群的標記：取約含5×10⁵個單個核細胞(pbmc)的100ul效應細胞懸液，按流式檢測抗體說明書進行cd3-cd56+nk細胞亞群抗體標記，用bdfacscalibur流式細胞儀進行檢測，分析有核細胞中nk細胞比例。如是pbmc則進行紅細胞裂解步驟，如是免疫細胞培養(yǎng)產物則不進行紅細胞裂解步驟。

1.3.5效應細胞活細胞率的檢測：如樣本為免疫細胞培養(yǎng)產物，則需檢測其有核細胞活細胞率。取100ul細胞懸液，加入pi染料至終濃度3.75ug/ml，平衡5-10分鐘，流式細胞儀檢測效應細胞死亡率。

1.3.6效應細胞與靶細胞混合培養(yǎng)：設定效靶比(nk細胞與標記csfe的靶細胞之比)為0∶1、1∶1、2∶1、4∶1及6∶1，依據(jù)效應細胞有核細胞密度、效應細胞活率及其有核細胞中nk細胞比例計算所需效應細胞體積，混合效應細胞及靶細胞，用1640完全培養(yǎng)基補足至200ul共培養(yǎng)體系。各組至少三個復孔，混勻共孵育2.5小時。

1.3.7靶細胞死亡率檢測：重懸1.3.6步的混合培養(yǎng)細胞，加入pi染料至終濃度3.75ug/ml，平衡5-10分鐘，流式細胞儀檢測各管csfe陽性的靶細胞死亡率。

1.3.8nk細胞殺傷活力的計算：將各管靶細胞死亡率帶入公式(實驗組靶細胞死亡率-對照組靶細胞死亡率)/(1-對照組靶細胞死亡率)×100％，計算各效靶比nk細胞殺傷活性平均值。

1.4質量控制

1.4.1靶細胞的質量控制按固定密度接種傳代k562細胞，觀察生長狀態(tài)及速度，必要時檢測細胞周期等指標?？刂芻sfe標記后k562在1640完全培養(yǎng)基中的平衡時長，要求標記后的k562細胞系自然死亡率低于3％，靶細胞與效應細胞fh1通道平均熒光強度(medianfluorescenceintensity，mif)值之比為80倍以上，以此保障每次檢測所用靶細胞的一致性。

1.4.2效應細胞的質量控制edta抗凝管采集外周血標本，離體后3小時內送達實驗室，置于室溫放置，效應細胞備用時重懸于1640完全培養(yǎng)基中。如非新鮮血液樣本或長時間放置于其他條件，需檢測有核細胞活率，以有核細胞的細胞密度、活細胞率及nk比例計算各效靶比所需pbmc懸液體積。

1.4.3流式細胞儀的質量控制按儀器固定維護校準，用fh3通道檢測pi熒光染料信號，用accuric6計量細胞絕對數(shù)功能替代手工計量效應細胞或靶細胞懸液密度。

1.4.4數(shù)據(jù)分析的質量控制同一名技術人員在同一標準下進行讀數(shù)，如有數(shù)據(jù)的取舍和分析則由固定三名技術人員共同完成。與僅有靶細胞對照管相比，效靶細胞混合孵育檢測管內靶細胞濃度低于前者85％時，認為部分靶細胞死亡后完全破裂，致使檢測結果低于實際靶細胞死亡率，則該檢測結果不可信。

1.5統(tǒng)計學方法采用spss21.0軟件進行統(tǒng)計學分析，各指標以x±s表示，因素相關性分析采用多重線性回歸分析，兩組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗。p＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1納入研究對象本基本情況

正常參考值組包含健康志愿者47例，女性22例[28歲-68歲，平均(47.5±9.1)歲]，男性25例[27歲-69歲，平均(47.3±11.2)歲]。腫瘤組包含各類腫瘤患者61例[肝癌23例，胰腺癌8例，肺癌與結腸癌各5例，直腸癌、胃癌、乳腺癌和卵巢癌各3例，甲狀腺癌2例，腎癌、陰道癌、下咽癌、食道癌、肝膽管癌及膽管癌各1例]，女性18例[36歲-84歲，平均(60.2±11.9)歲]，男性43例[17歲-85歲，平均(53.9±13.5)歲]，詳見表1。

表1一般情況表(例)

2.2nk比例差異

分析nk殺傷活性檢測中各來源標本中nk細胞占有核細胞比例分布情況(見圖1)，結果提示腫瘤患者組中該參數(shù)分布情況為10.8％±7.87％(3％-42％)，偏度為1.714，峰度為3.609；健康志愿者者組中該參數(shù)分布情況為12.31％±5.25％(4％-23％)，偏度為0.576，峰度為-0.860；其他來源組中該參數(shù)分布情況為13.48％±12.30％(0.11％-75.19％)，偏度為3.095，峰度為11.283，由此可見各來源nk殺傷活性待檢標本有核細胞中nk細胞比例分布規(guī)律各異，如在計算效應細胞與靶細胞比例時不考慮該參數(shù)的巨大差異，僅以有核細胞數(shù)與靶細胞數(shù)計算，可能會導致檢測結果的偏移，無法實現(xiàn)對nk細胞殺傷能力的嚴謹評估。

2.3nk細胞殺傷活性相關因素分析

將年齡按44歲以下、45歲-59歲、60歲以上進行分組，分析了年齡、性別及是否患過腫瘤與nk殺傷活性之間的相關。結果提示當效靶比為1和2時年齡、性別及是否患過腫瘤三者與nk殺傷活性之間無相關性(p＞0.05)。效靶比為4及6時，性別、年齡與其相關性無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)，患過腫瘤與否與其相關性有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)?；诒狙芯繑?shù)據(jù)的分析，未發(fā)現(xiàn)年齡及性別影響外周血nk細胞殺傷能力，而是否患過腫瘤將會對該指標產生影響，且應將效靶比設定在4或6以上。

2.4nk細胞殺傷活性正常參考值范圍

考慮本研究健康對照組數(shù)據(jù)表現(xiàn)為年齡和性別均與nk細胞殺傷活性無關，故在確定參考值范圍時，不再依據(jù)年齡或性別進行分組。參考范圍的確定采用百分位數(shù)法，設定nk細胞殺傷活性雙側90％參考值范圍，結果見表2。

表2外周血nk細胞殺傷活性正常參考值范圍(％)

2.5腫瘤患者的nk殺傷活性特征

比較腫瘤患者組與健康志愿者組外周血nk細胞殺傷活性差異，結果提示效靶比分別為4和6時，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。當效靶比為1與2時，兩組間差異無統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。提示腫瘤患者該指標低于健康供者，且該檢測項目應考慮設定效靶比為4與6。

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