一種豬cik細(xì)胞的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種豬CIK細(xì)胞的制備方法，該方法主要包括收集外周血淋巴細(xì)胞層，并對收集的外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，該方法通過對CIK細(xì)胞制備方法進(jìn)行優(yōu)化試驗，建立了適用于豬CIK細(xì)胞的培養(yǎng)體系，利用該培養(yǎng)體系培養(yǎng)豬外周血淋巴細(xì)胞5d后，可以使體系中淋巴細(xì)胞的總數(shù)增長近16倍，利用該培養(yǎng)體系可以為體外細(xì)胞免疫試驗提供大量的具有NK細(xì)胞表型的免疫細(xì)胞。
【專利說明】
一種豬CIK細(xì)胞的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于CIK細(xì)胞制備領(lǐng)域，特別涉及一種豬CIK細(xì)胞的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] ΝΚ細(xì)胞，即自然殺傷細(xì)胞，是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，具有殺傷性強(qiáng)、殺傷效果高效、 可直接殺死癌細(xì)胞等特點，ΝΚ細(xì)胞的靶細(xì)胞主要有某些腫瘤細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞、某些自身 組織細(xì)胞和寄生蟲等。ΝΚ細(xì)胞現(xiàn)已被越來越多地應(yīng)用于各種臨床研究之中，尤其是對人類 及嚙齒類的研究較為透徹。但某些大型動物如豬、牛等，其細(xì)胞表征與嚙齒類相比差異很 大，目前臨床研究也相對較少，因此能建立一種能夠高效地分離豬ΝΚ細(xì)胞并使其能在體外 穩(wěn)定增殖的方法便尤為方便重要。
[0003] CIK細(xì)胞(cytokine-induced killer，細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞)是將人外周血、 臍血或骨髓的單個核細(xì)胞在體外用細(xì)胞因子培養(yǎng)一段時間后獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞。由于該 種細(xì)胞同時表達(dá)CD3和CD56兩種膜蛋白分子，故又被稱為NK細(xì)胞樣T淋巴細(xì)胞。
[0004] 通過細(xì)胞因子而誘導(dǎo)細(xì)胞培養(yǎng)的方法在近些年中已有大量報道，而目前人的CIK 細(xì)胞已研發(fā)成功并投入到臨床應(yīng)用。該細(xì)胞的培養(yǎng)方法是通過在無血清的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)基 中，分別在不同培養(yǎng)時期加入CD3、IFN-y以及IL-2等細(xì)胞因子，以達(dá)到增強(qiáng)細(xì)胞殺傷性、促 進(jìn)細(xì)胞體外增殖的目的。根據(jù)已有報道，通過該方法培養(yǎng)的殺傷細(xì)胞可在體外連續(xù)培養(yǎng)20d 左右，增殖約15代左右，是在短時間內(nèi)大量獲得殺傷性細(xì)胞的有效方法;例如CN101063108 還公開了一種高增殖力、高細(xì)胞毒活性CIK細(xì)胞的制備方法，CN105274053還公開了一種高 細(xì)胞毒活性的CIK細(xì)胞的制備方法，但是通過上述方法制備的豬CIK細(xì)胞的增殖力差，并且 細(xì)胞毒活性低;現(xiàn)有技術(shù)中，為了提高CIK細(xì)胞的增殖力或細(xì)胞毒活性，還公開了一些中藥 提取物，例如CN102755512公開的由紅參、麥冬和黃芪組成的用于提高CIK細(xì)胞增殖速率的 中藥提取物，但是該提取物對提高豬CIK細(xì)胞的增殖效率不明顯。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種豬CIK細(xì)胞的制備方法，通過該方法制備 的豬CIK細(xì)胞具有高的細(xì)胞增殖力和強(qiáng)的細(xì)胞毒活性。
[0006] 本發(fā)明具體技術(shù)方案如下：
[0007] 本發(fā)明一方面提供一種豬CIK細(xì)胞的制備方法，該制備方法包括如下步驟：
[0008] S1:采用濃度為1.110ng/L的Percoll密度梯度離心法分離豬血液內(nèi)的外周血淋巴 細(xì)胞，收集外周血淋巴細(xì)胞層，用PBS洗滌2次，備用；
[0009] 32:向步驟31分離的外周血淋巴細(xì)胞中按終濃度加入10001]/11^的1?1丫和200-300ng/mL的完全培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，按終濃度補(bǔ)加50ng/mL的⑶3和1000u/mL 的IL-2;每2-3天添加完全培養(yǎng)基和IL-2,并保持完全培養(yǎng)基的終濃度為200-300ng/mL，IL-2的終濃度為1000u/mL，培養(yǎng)3-10天，制得CIK細(xì)胞。
[0010] 通過本發(fā)明提供的制備方法制備的CIK細(xì)胞具有很好的增殖力和很強(qiáng)的細(xì)胞毒活 性。
[0011]進(jìn)一步的改進(jìn)，完全培養(yǎng)基為1640培養(yǎng)液與胎牛血清組成的混合液、或KBM581無 血清培養(yǎng)液。
[0012] 進(jìn)一步的改進(jìn)，完全培養(yǎng)基為1640培養(yǎng)液與胎牛血清組成的混合液，其中每毫升 混合液中含有5%的胎牛血清。
[0013] 進(jìn)一步的改進(jìn)，上述制備方法還包括向完全培養(yǎng)基中加入培養(yǎng)溶質(zhì)。
[0014] 進(jìn)一步的改進(jìn)，上述制備方法中加入的培養(yǎng)溶質(zhì)包括提取混合物，
[0015] 所述提取混合物是由如下重量份數(shù)的成分組成：
[0016] 蒲公英提取物10-15半枝蓮提取物5-7.5 [0017] 芡實提取物1.2-3.5金銀花提取物15-20。
[0018] 進(jìn)一步的改進(jìn)，所述提取混合物的制備方法如下：
[0019] a.稱取蒲公英、半枝蓮、芡實和金銀花，粉碎，加濃度為75 %的乙醇水溶液，回流提 取三次，第一次加入乙醇水溶液的量為蒲公英、半枝蓮、芡實和金銀花總量的7倍，回流2小 時，第二次加入乙醇水溶液的量為蒲公英、半枝蓮、芡實和金銀花總量的5倍，回流2小時，第 三次加入乙醇水溶液的量為蒲公英、半枝蓮、芡實和金銀花總量的3倍，回流1小時，合并回 流液，過濾，濾液濃縮至稠膏；
[0020] b.向步驟a所得稠膏中加入2倍乙醇，過濾，濾液上大孔吸附樹脂柱，以水洗脫，除 去餾分，再用濃度為30-60 %的乙醇水溶液洗脫10個柱體積，收集餾分，濃縮，噴霧干燥，制 得提取混合物。
[0021] 進(jìn)一步的改進(jìn)，本發(fā)明的制備方法中進(jìn)一步加入了提取混合物，該提取混合物能 夠顯著提高制備的CIK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。
[0022] 進(jìn)一步的改進(jìn)，上述制備方法中加入的培養(yǎng)溶質(zhì)還包括重量份數(shù)為0.5-1.5份的 甲殼素、0.1-0.3份的聚甲基丙烯酸甲酯、0.4-0.7份的氧化鐵、5-10份的多聚谷氨酸和1-3 份的阿拉伯膠。
[0023] 本發(fā)明的制備方法中進(jìn)一步加入了甲殼素、聚甲基丙烯酸甲酯、氧化鐵、多聚谷氨 酸和阿拉伯膠能夠顯著提高CIK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性的靶向性，并且能夠顯著提高細(xì)胞活力。
[0024] 進(jìn)一步的改進(jìn)，上述制備方法中加入的培養(yǎng)溶質(zhì)還包括重量份數(shù)為2-5份的磷酯 酰絲氨酸、1-2份的沙苑子提取物、5-10份的威靈仙提取物和1-3份的膽固醇棕櫚酸酯。
[0025] 本發(fā)明通過在制備方法中加入磷酯酰絲氨酸、沙苑子提取物、威靈仙提取物和膽 固醇棕櫚酸酯的混合物能夠顯著提高制備的CIK細(xì)胞的增殖力。
[0026] 本發(fā)明另一方面提供一種用于提高豬CIK細(xì)胞增殖力的組合物，該組合物是由如 下重量份數(shù)的成分組成：
[0027]磷酯酰絲氨酸2-5 沙苑子提取物1-2 [0028]威靈仙提取物5-10膽固醇棕櫚酸酯1-3。
[0029] 本發(fā)明另一方面提供一種組合物的制備方法，該制備方法包括如下步驟：
[0030] 1)稱取沙苑子粉碎，加水煎煮2次，第一次加入水的量為沙苑子重量的7倍，煎煮3 小時，第二次加入水的量為沙苑子重量的5倍，煎煮2小時，合并煎煮液，過濾，向濾液中加入 乙醇，使乙醇的濃度達(dá)到53 %，靜置，過濾，收集濾液，濃縮，噴霧干燥，制得沙苑子提取物；
[0031] 2)稱取威靈仙粉碎，加濃度為50%的乙醇水溶液，回流提取兩次，第一次加入乙醇 水溶液的量為威靈仙重量的7倍，回流2小時，第二次加入乙醇水溶液的量為為威靈仙重量 的5倍，回流2小時，合并回流液，過濾，濾液濃縮至稠膏；
[0032] 3)向步驟2)所得稠膏中加入2倍水，過濾，濾液上大孔吸附樹脂柱，以水洗脫，除去 餾分，再用濃度為75-95 %的乙醇水溶液洗脫10個柱體積，收集餾分，濃縮，噴霧干燥，制得 威靈仙子提取物；
[0033] 4)將沙苑子提取物、威靈仙提取物與磷酯酰絲氨酸和膽固醇棕櫚酸酯混合均勻， 制得組合物。
[0034] 本發(fā)明另一方面還提供了沙苑子提取物的制備方法，其具體步驟如下：稱取沙苑 子粉碎，加水煎煮2次，第一次加入水的量為沙苑子重量的7倍，煎煮3小時，第二次加入水的 量為沙苑子重量的5倍，煎煮2小時，合并煎煮液，過濾，向濾液中加入乙醇，使乙醇的濃度達(dá) 到53 %，靜置，過濾，收集濾液，濃縮，噴霧干燥，制得沙苑子提取物。
[0035] 本發(fā)明另一方面還提供了威靈仙提取物的制備方法，其具體步驟如下：
[0036] 1)稱取威靈仙粉碎，加濃度為50%的乙醇水溶液，回流提取兩次，第一次加入乙醇 水溶液的量為威靈仙重量的7倍，回流2小時，第二次加入乙醇水溶液的量為為威靈仙重量 的5倍，回流2小時，合并回流液，過濾，濾液濃縮至稠膏；
[0037] 2)向步驟1)所得稠膏中加入2倍水，過濾，濾液上大孔吸附樹脂柱，以水洗脫，除去 餾分，再用濃度為75-95 %的乙醇水溶液洗脫10個柱體積，收集餾分，濃縮，噴霧干燥，制得 威靈仙子提取物。
[0038]本發(fā)明的有益效果是：
[0039] 1.本發(fā)明提供的豬CIK細(xì)胞的制備方法能夠快速獲得大量具有腫瘤細(xì)胞殺傷活性 的豬CIK細(xì)胞群。
[0040] 2.通過對CIK細(xì)胞制備方法進(jìn)行優(yōu)化試驗，建立了適用于豬CIK細(xì)胞的培養(yǎng)體系， 利用該培養(yǎng)體系培養(yǎng)豬外周血淋巴細(xì)胞5d后，可以使體系中淋巴細(xì)胞的總數(shù)增長近16倍， 利用該培養(yǎng)體系可以為體外細(xì)胞免疫試驗提供大量的具有NK細(xì)胞表型的免疫細(xì)胞。
[0041 ] 3.利用流式細(xì)胞術(shù)分析豬CIK細(xì)胞在培養(yǎng)過程中的比例變化結(jié)果表明，培養(yǎng)5d后， 淋巴細(xì)胞中具有NK細(xì)胞表型（CD2+/CD87CD3J的細(xì)胞比例較最初分離的淋巴細(xì)胞提高 5.59倍;焚光定量?0?結(jié)果也表明，疆細(xì)胞相關(guān)的其它表面標(biāo)志(0)2、0)3、0)8€[、31^與?1^1) 的表達(dá)也在培養(yǎng)第5天達(dá)到了頂峰，與流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果一致。
[0042] 4.豬CIK細(xì)胞毒活性實驗結(jié)果表明，誘導(dǎo)培養(yǎng)第5d的CIK細(xì)胞在效靶比為12:1時達(dá) 到對腫瘤細(xì)胞系（YAC-1)最佳的殺傷活性，殺傷率達(dá)到近80%;而最初分離的淋巴細(xì)胞對 YAC-1的殺傷率僅為56.86 %。
[0043]綜上所述，本發(fā)明建立了一種豬CIK細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，利用該培養(yǎng)體系可以在短 時間內(nèi)獲得大量具有NK細(xì)胞體外殺傷活性的豬CIK細(xì)胞，進(jìn)而可以為體外抗腫瘤細(xì)胞免疫 研究和病原微生物引起的細(xì)胞免疫研究提供大量、優(yōu)質(zhì)的效應(yīng)細(xì)胞，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0044] 圖1豬CIK細(xì)胞形態(tài)圖；
[0045] A-實施例1的方法培養(yǎng)3d，B-實施例2的方法培養(yǎng)3d;
[0046] 圖2豬CIK細(xì)胞增殖活性圖；
[0047] A-C分別為實施例1的方法分別培養(yǎng)ld、3d、5d用流式測得的細(xì)胞增殖結(jié)果；
[0048] D-F分別為實施例2的方法分別培養(yǎng)ld、3d、5d用流式測得的細(xì)胞增殖結(jié)果；
[0049] 圖3豬CIK細(xì)胞培養(yǎng)過程比例變化圖；
[0050] A-E分別為CIK誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中不同時間（1(1、3(1、5(1、7(1、9(1)具有疆細(xì)胞表型（〇02 +/CD8+/⑶:Γ)的細(xì)胞比例變化情況；
[0051 ] F為⑶27⑶87⑶3-細(xì)胞數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果；
[0052]圖4豬外周血淋巴細(xì)胞表型圖；
[0053]需要指出的是，本發(fā)明所提出的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法就是指實施例1和實施例2的制備方 法。
【具體實施方式】 [0054] 實施例1
[0055] -種豬CIK細(xì)胞的制備方法，該制備方法包括如下步驟：
[0056] S1:采用濃度為1.110ng/L的Percoll密度梯度離心法分離豬血液內(nèi)的 [0057]外周血淋巴細(xì)胞，收集外周血淋巴細(xì)胞層，用PBS洗滌2次，備用；
[0058] S2:向步驟S1分離的外周血淋巴細(xì)胞中按終濃度加入1000U/mL的IFN-γ和200ng/ mL的完全培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，按終濃度補(bǔ)加50ng/mL的⑶3和1000u/mL的IL-2;每2天添加完全培養(yǎng)基和IL-2,并保持完全培養(yǎng)基的終濃度為200-30ng/mL，IL-2的終濃 度為1000u/mL，培養(yǎng)5天，制得CIK細(xì)胞;所述完全培養(yǎng)基為1640培養(yǎng)液與胎牛血清組成的混 合液，每毫升混合液中含有5 %的胎牛血清。
[0059] 實施例2
[0060] 一種豬CIK細(xì)胞的制備方法，該制備方法包括如下步驟：
[00611 S1:采用濃度為1.110ng/L的Percoll密度梯度離心法分離豬血液內(nèi)的外周血淋巴 細(xì)胞，收集外周血淋巴細(xì)胞層，用PBS洗滌2次，備用；
[0062] S2:向步驟S1分離的外周血淋巴細(xì)胞中按終濃度加入1000U/mL的IFN-γ和300ng/ mL的完全培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，按終濃度補(bǔ)加50ng/mL的⑶3和1000u/mL的IL-2;每3天添加完全培養(yǎng)基和IL-2，并保持完全培養(yǎng)基的終濃度為300ng/mL，IL-2的終濃度為 1000u/mL，培養(yǎng)10天，制得CIK細(xì)胞，完全培養(yǎng)基為KBM581無血清培養(yǎng)液。
[0063] 實施例3
[0064] -種豬CIK細(xì)胞的制備方法，該制備方法與實施例1不同的是，該方法還包括向完 全培養(yǎng)基中加入培養(yǎng)溶質(zhì)，所述培養(yǎng)溶質(zhì)包括提取混合物，該提取混合物是由如下重量份 數(shù)的成分組成：
[0065]蒲公英提取物10半枝蓮提取物5 [0066]芡實提取物1.2 金銀花提取物15。
[0067] 實施例4
[0068] -種豬CIK細(xì)胞的制備方法，該制備方法與實施例3不同的是，提取混合物是由如 下重量份數(shù)的成分組成：
[0069]蒲公英提取物15半枝蓮提取物7.5 [0070]芡實提取物3.5 金銀花提取物20。
[0071] 實施例5
[0072] -種豬CIK細(xì)胞的制備方法，該制備方法與實施例3不同的是，提取混合物是由如 下重量份數(shù)的成分組成：
[0073]蒲公英提取物12.5半枝蓮提取物6 [0074]芡實提取物2 金銀花提取物17.5;
[0075]該提取混合物的制備方法為：
[0076] a.稱取蒲公英、半枝蓮、芡實和金銀花，粉碎，加濃度為75 %的乙醇水溶液，回流提 取三次，第一次加入乙醇水溶液的量為蒲公英、半枝蓮、芡實和金銀花總量的7倍，回流2小 時，第二次加入乙醇水溶液的量為蒲公英、半枝蓮、芡實和金銀花總量的5倍，回流2小時，第 三次加入乙醇水溶液的量為蒲公英、半枝蓮、芡實和金銀花總量的3倍，回流1小時，合并回 流液，過濾，濾液濃縮至稠膏；
[0077] b.向步驟a所得稠膏中加入2倍乙醇，過濾，濾液上大孔吸附樹脂柱，以水洗脫，除 去餾分，再用濃度為30 %的乙醇水溶液洗脫10個柱體積，收集餾分，濃縮，噴霧干燥，制得提 取混合物。
[0078] 實施例6
[0079] -種豬CIK細(xì)胞的制備方法，該制備方法與實施例3不同的是，培養(yǎng)溶質(zhì)還包括重 量份數(shù)為0.5份的甲殼素、0.1份的聚甲基丙烯酸甲酯、0.4份的氧化鐵、5份的多聚谷氨酸和 1份的阿拉伯膠。
[0080] 實施例7
[0081] -種豬CIK細(xì)胞的制備方法，該制備方法與實施例3不同的是，培養(yǎng)溶質(zhì)還包括重 量份數(shù)為1.5份的甲殼素、0.3份的聚甲基丙烯酸甲酯、0.7份的氧化鐵、10份的多聚谷氨酸 和3份的阿拉伯膠。
[0082] 實施例8
[0083] 一種豬CIK細(xì)胞的制備方法，該制備方法與實施例3不同的是，培養(yǎng)溶質(zhì)還包括重 量份數(shù)為2份的磷酯酰絲氨酸、1份的沙苑子提取物、5份的威靈仙提取物和1份的膽固醇棕 櫚酸酯。
[0084] 實施例9
[0085] -種豬CIK細(xì)胞的制備方法，該制備方法與實施例6不同的是，培養(yǎng)溶質(zhì)還包括重 量份數(shù)為5份的磷酯酰絲氨酸、2份的沙苑子提取物、10份的威靈仙提取物和3份的膽固醇棕 櫚酸酯。
[0086] 實施例10
[0087] -種豬CIK細(xì)胞的制備方法，該制備方法與實施例7不同的是，培養(yǎng)溶質(zhì)還包括重 量份數(shù)為3.5份的磷酯酰絲氨酸、1.5份的沙苑子提取物、7.5份的威靈仙提取物和2份的膽 固醇棕櫚酸酯。
[0088] 實施例11
[0089] -種用于提高豬CIK細(xì)胞增殖力的組合物，該組合物是由如下重量份數(shù)的成分組 成：
[0090] 磷酯酰絲氨酸2 沙苑子提取物1 [0091]威靈仙提取物5 膽固醇棕櫚酸酯1。
[0092] 實施例12
[0093] -種用于提高豬CIK細(xì)胞增殖力的組合物，該組合物是由如下重量份數(shù)的成分組 成：
[0094]磷酯酰絲氨酸5 沙苑子提取物2 [0095]威靈仙提取物10膽固醇棕櫚酸酯3。
[0096] 實施例13
[0097] -種用于提高豬CIK細(xì)胞增殖力的組合物，該組合物是由如下重量份數(shù)的成分組 成：
[0098] 磷酯酰絲氨酸3.5 沙苑子提取物1.5
[0099]威靈仙提取物7.5 膽固醇棕櫚酸酯2
[0100]該組合物的制備方法為：
[0101 ] 1)稱取沙苑子粉碎，加水煎煮2次，第一次加入水的量為沙苑子重量的7倍，煎煮3 小時，第二次加入水的量為沙苑子重量的5倍，煎煮2小時，合并煎煮液，過濾，向濾液中加入 乙醇，使乙醇的濃度達(dá)到53 %，靜置，過濾，收集濾液，濃縮，噴霧干燥，制得沙苑子提取物；
[0102] 2)稱取威靈仙粉碎，加濃度為50%的乙醇水溶液，回流提取兩次，第一次加入乙醇 水溶液的量為威靈仙重量的7倍，回流2小時，第二次加入乙醇水溶液的量為為威靈仙重量 的5倍，回流2小時，合并回流液，過濾，濾液濃縮至稠膏；
[0103] 3)向步驟2)所得稠膏中加入2倍水，過濾，濾液上大孔吸附樹脂柱，以水洗脫，除去 餾分，再用濃度為75-95 %的乙醇水溶液洗脫10個柱體積，收集餾分，濃縮，噴霧干燥，制得 威靈仙子提取物；
[0104] 4)將沙苑子提取物、威靈仙提取物與磷酯酰絲氨酸和膽固醇棕櫚酸酯混合均勻， 制得組合物。
[0105] 對照例1
[0106] -種豬CIK細(xì)胞的制備方法，該制備方法與實施例1不同的是，該方法還包括向完 全培養(yǎng)基中加入培養(yǎng)溶質(zhì)，所述培養(yǎng)溶質(zhì)包括提取混合物，該提取混合物是由如下重量份 數(shù)的成分組成：
[0107] 蒲公英提取物10半枝蓮提取物5芡實提取物1.2。
[0108] 對照例2
[0109] -種豬CIK細(xì)胞的制備方法，該制備方法與實施例1不同的是，該方法還包括向完 全培養(yǎng)基中加入培養(yǎng)溶質(zhì)，所述培養(yǎng)溶質(zhì)包括提取混合物，該提取混合物是由如下重量份 數(shù)的成分組成：
[0110] 黃芪提取物10 半枝蓮提取物5
[0111] 芡實提取物1.2 麥冬提取物15。
[0112] 對照例3
[0113] -種豬CIK細(xì)胞的制備方法，該制備方法與實施例3不同的是，培養(yǎng)溶質(zhì)還包括重 量份數(shù)為0.5份的甲殼素、0.1份的聚甲基丙烯酸甲酯、0.4份的氧化鐵、5份的多聚谷氨酸和 1份的卡波姆。
[0114] 對照例4
[0115] -種豬CIK細(xì)胞的制備方法，該制備方法與實施例3不同的是，培養(yǎng)溶質(zhì)還包括重 量份數(shù)為0.1份的聚甲基丙烯酸甲酯、0.4份的氧化鐵、5份的多聚谷氨酸和1份的阿拉伯膠。
[0116] 對照例5
[0117] -種豬CIK細(xì)胞的制備方法，該制備方法與實施例3不同的是，培養(yǎng)溶質(zhì)還包括重 量份數(shù)為2份的磷酯酰絲氨酸、5份的威靈仙提取物和1份的膽固醇棕櫚酸酯。
[0118] 對照例6
[0119] -種豬CIK細(xì)胞的制備方法，該制備方法與實施例3不同的是，培養(yǎng)溶質(zhì)還包括重 量份數(shù)為1份的沙苑子提取物和5份的威靈仙提取物和1份的棕櫚酸鈉。
[0120]試驗例1細(xì)胞增殖活性檢測
[0121] 將最初分離出的外周血淋巴細(xì)胞留取一部分，用croA-SE以1:1000的比例對細(xì)胞 進(jìn)行染色。加入熒光指示劑后37°C孵育30min即可完成染色。之后用PBS將細(xì)胞懸浮清洗兩 次，離心條件同之前步驟，最后分別按照實施例1和實施例2的方法進(jìn)行制備。制備的細(xì)胞分 別在Id、3d、5d、7d、9d取適量細(xì)胞樣品，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖狀況，每天觀察細(xì)胞 形態(tài)，并對細(xì)胞的生長狀況進(jìn)行記錄，繪制生長曲線如圖1所示。
[0122] 從圖1中可以看出實施例1和實施例2得到的細(xì)胞在前期制備過程中（l-6d)在形態(tài) 上差異不顯著，但在制備的后期（7d以后）實施例2制備的細(xì)胞的凋亡速度和細(xì)胞碎片數(shù)量 明顯較實施例1多。
[0123] 按照實施例1和實施例2的方法制備CIK細(xì)胞，并且分別在制備的第ld、3d、5d進(jìn)行 細(xì)胞取樣，并通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖情況，如圖2所示。
[0124] 從圖2中可以看出，實施例1和實施例2得到的結(jié)果基本一致，在制備第5d時均可見 明顯的3個熒光峰，表明制備后細(xì)胞發(fā)生了 3次分裂，與最初分離的細(xì)胞數(shù)相比擴(kuò)增了 16倍。
[0125] 試驗例2細(xì)胞表型分析
[0126] 2.1流式細(xì)胞儀檢測0)27〇)87〇)3_細(xì)胞比例
[0127] 從頸靜脈采集巴馬小型豬血液，加入到含有枸櫞酸鈉抗凝劑的離心管中。采用 Percol 1 (1.110ng/L)密度梯度離心法分離外周血淋巴細(xì)胞，收集淋巴細(xì)胞層，用PBS洗滌2 次，加入適量細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，利用流式抗體⑶2、⑶3、⑶8對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，利用流式細(xì)胞 儀檢測各種表面標(biāo)志的表達(dá)情況，結(jié)果如圖3所示。
[0128] 從圖3中可以看出，新鮮分離的外周血淋巴細(xì)胞中，淋巴細(xì)胞約占總細(xì)胞含量的 26.4%，淋巴細(xì)胞中⑶2+細(xì)胞的比例約為41.54%、⑶3+細(xì)胞的比例約為26.89%、⑶8+細(xì)胞 的比例約為34.83%，CD2+/⑶87⑶3-細(xì)胞的比例約為7.82%。⑶27⑶87⑶3-細(xì)胞被認(rèn)為是 豬NK細(xì)胞的典型表型，因此，本研究中測得的巴馬豬NK細(xì)胞約占總淋巴細(xì)胞的7.82%。
[0129] 在豬外周血淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中，按照實施例1的方法進(jìn)行制備，制備過程的 第1(1、3(1、5(1、7(1、9(1對細(xì)胞取樣，按照比例1 :100加入流式抗體^2、^3、^8對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo) 記，每次標(biāo)記過程中都進(jìn)行四組染色標(biāo)記，分別為三種標(biāo)簽的單獨(dú)標(biāo)記及三種標(biāo)簽的共同 標(biāo)記，標(biāo)記方法如下：首先吸取適量細(xì)胞培養(yǎng)液，600g離心15min，棄上清后用適量PBS懸浮 清洗細(xì)胞，再次600g離心15min，之后用5 %BSA懸浮細(xì)胞，室溫封閉lh，按上述條件離心，加 入適量PBS懸浮細(xì)胞，并根據(jù)需求加入不同抗體對細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記，37°C孵育lh后，離心， 并用PBS清洗兩次，最后再用適量PBS重懸細(xì)胞，過300目細(xì)胞篩后將樣品轉(zhuǎn)移至流式管中， 通過流式細(xì)胞儀檢測表型為⑶2+/CD8+/⑶:Γ的比例變化情況，檢測結(jié)果見圖4。
[0130]從圖4中可以看出，新鮮分離的淋巴細(xì)胞中具有NK細(xì)胞表型的細(xì)胞占7.81 %，實施 例1制備的第3d開始，CIK細(xì)胞比例明顯上升，到第5d達(dá)到頂峰，其占總細(xì)胞43.63%，較最初 分離時相比細(xì)胞比例提升了5.59倍，繼續(xù)之后細(xì)胞比例趨于平穩(wěn)，在第7d之后NK細(xì)胞比例 略有下降。
[0131] 結(jié)論：
[0132] 本研究首先測定了新鮮分離的豬外周血淋巴細(xì)胞中NK細(xì)胞(CD2+/CD8+/CD3-)的 比例，通過流式細(xì)胞儀檢測的結(jié)果顯示，當(dāng)巴馬豬外周血淋巴細(xì)胞剛被分離出時，NK細(xì)胞約 占總淋巴細(xì)胞的7.82 %。
[0133] 接下來，本研究比較了實施例1和實施例2制備效果，結(jié)果顯示"1640培養(yǎng)液+5% FBS"和"KBM581無血清培養(yǎng)液"兩種培養(yǎng)體系在培養(yǎng)7d內(nèi)，在增殖活性和細(xì)胞表型上差異不 顯著，但是在7d之后，"1640培養(yǎng)液+ 5 %FBS"的培養(yǎng)體系培養(yǎng)的細(xì)胞狀況要明顯好于 "KBM581無血清培養(yǎng)液"體系的細(xì)胞，通過鏡下觀察細(xì)胞數(shù)量以及細(xì)胞形態(tài)均一程度便可較 明顯的體現(xiàn)出來。
[0134] 最后，通過對所分離培養(yǎng)的NK細(xì)胞每天進(jìn)行的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用我們建立的細(xì) 胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的方法可以使豬外周血淋巴細(xì)胞中具有NK細(xì)胞表型的細(xì)胞數(shù)量在第5d時達(dá)到 巔峰，占總淋巴細(xì)胞的43.63%，較最初分離時NK細(xì)胞比例提升了5.59倍，而淋巴細(xì)胞總體 數(shù)量也增長近16倍，因此，可利用此方法為體外細(xì)胞免疫試驗提供足夠量的NK細(xì)胞表型的 細(xì)胞。NK細(xì)胞是固有免疫應(yīng)答中一類十分重要的淋巴細(xì)胞，可通過選擇性識別、殺傷低表達(dá) MHCI類分子的腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，有效地清除腫瘤進(jìn)而在機(jī)體抗腫瘤 免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。靜止NK細(xì)胞具有一定的殺傷活性，若NK細(xì)胞的有效活 化，可顯著增強(qiáng)其對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。本研究嘗試了一種體外顯著提高豬NK細(xì)胞的誘 導(dǎo)培養(yǎng)方法，可以為抗腫瘤免疫及其機(jī)制研究提供足夠量的效應(yīng)細(xì)胞，也可以為病原微生 物引起的體外細(xì)胞免疫和免疫逃逸研究提供良好的研究思路。
[0135] 試驗例3擴(kuò)增倍數(shù)試驗
[0136] 按照實施例1、實施例8和對照例5-6方法制備CIK細(xì)胞，并且分別在制備的第5d進(jìn) 行細(xì)胞取樣，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)(臺盼藍(lán)染色法），計算CIK細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)，結(jié)果見表1。
[0137] 表1實驗組和對照組的擴(kuò)增倍數(shù)
[0139] 從表中可以看出，本發(fā)明實施例8的制備方法可顯著提高CIK細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)，由 此得出，在本發(fā)明在完全培養(yǎng)基中加入由磷酯酰絲氨酸、沙苑子提取物、威靈仙提取物和膽 固醇棕櫚酸酯組成的混合物可顯著提高干細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)，但當(dāng)以上成分發(fā)生變化，或者 省略某一成分后，擴(kuò)增倍數(shù)顯著降低。
[0140] 試驗例4細(xì)胞活力檢測
[0141] 以實施例1、6、制備的CIK細(xì)胞為實驗1-2組，以對照例3-4制備的CIK細(xì)胞為對照1-2組。各實驗組和對照組的CIK細(xì)胞分別在12h、24h、48h和96h小時進(jìn)入試驗程序，調(diào)整CIK細(xì) 胞的密度均為lX10 6cells/mL。按細(xì)胞懸液:0.4%臺盼藍(lán)= 3:lv:v充分混勻，取20yL細(xì)胞 懸液加入細(xì)胞計數(shù)板中，用臺盼藍(lán)拒染法檢測細(xì)胞活力，結(jié)果如表2所示。
[0142] 表2實驗組和對照組細(xì)胞活力結(jié)果
[0144] 注："一"表示沒有活性。
[0145] 由表2可知，實驗2組制備的CIK細(xì)胞要實驗1組和對照1-2組的CIK細(xì)胞活力高，可 保證CIK細(xì)胞放置96h后，細(xì)胞活力人保持在65%以上；由此得出，本發(fā)明提供的制備方法 中，在完全培養(yǎng)基中加入甲殼素、聚甲基丙烯酸甲酯、氧化鐵、多聚谷氨酸和阿拉伯膠可將 CIK細(xì)胞的活性保持在96h內(nèi)。當(dāng)其中一個成分發(fā)生變化或減少，CIK細(xì)胞的活力顯著降低。
[0146] 試驗例5細(xì)胞毒活性的測定
[0147] 取對數(shù)生長期的低分化胃腺癌細(xì)胞株(BGC-823)細(xì)胞作為靶細(xì)胞，并重懸靶細(xì)胞 濃度為1 X 1 〇5/mL、5 X 104/mL、2.5 X 104/mL，每孔1 OOyL鋪于96孔平底板中，置于37 °C、C〇2體 積濃度為5%的環(huán)境中培養(yǎng)，靶細(xì)胞培養(yǎng)24h后將實驗1-2組和對照1-2組的CIK細(xì)胞重懸為1 X 106/mL加入96孔板中，使每孔內(nèi)效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比例分別為10:1、20:1和40:1，各濃 度設(shè)4個復(fù)孔，并設(shè)未與腫瘤靶細(xì)胞反應(yīng)的各組CIK細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞空白對照，未與CIK反應(yīng) 的各濃度BGC-823為靶細(xì)胞的空白對照。培養(yǎng)48h后，每孔加入濃度為5mg/mL的噻唑藍(lán)(MTT) 20yL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，翻板棄去上清，每孔加入二甲基亞砜(DMS0)溶液100yL，于570nm處測定 吸光度A值，計算殺傷率。
[0148] 其中，實驗1組采用實施例1的方法進(jìn)行培養(yǎng)，實驗2組采用實施例3的方法進(jìn)行培 養(yǎng)，對照1組采用對照例1的方法進(jìn)行培養(yǎng)，對照2組采用對照例2的方法進(jìn)行培養(yǎng)，各組CIK 細(xì)胞的細(xì)胞毒活性(殺傷率)如表3所示。
[0149] 表3實驗組和對照組細(xì)胞殺傷率結(jié)果
[0151] 從表3中可以看出，CIK細(xì)胞不同效靶比(E:T)，實施例3的方法制備的第CIK細(xì)胞對 BGC-823的特異性殺傷率均顯著高于的實驗1組和對照1-2組，表明本發(fā)明在完全培養(yǎng)基中 加入由蒲公英、半枝蓮、芡實和金銀花組成的提取混合物可顯著提高CIK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的 細(xì)胞毒活性。
[0152] 以上所述實施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并 不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
【主權(quán)項】
1. 一種豬CIK細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括如下步驟： S1:采用濃度為1.110ng/L的Percoll密度梯度離心法分離豬血液內(nèi)的外周血淋巴細(xì) 胞，收集外周血淋巴細(xì)胞層，用PBS洗滌2次，備用； S2:向步驟S1分離的外周血淋巴細(xì)胞中按終濃度加入1000U/mL的IFN-γ和200-300ng/ mL的完全培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，按終濃度補(bǔ)加50ng/mL的⑶3和1000u/mL的IL-2;每2-3天添加完全培養(yǎng)基和IL-2，并保持完全培養(yǎng)基的終濃度為200-300ng/mL，IL-2的終 濃度為l〇〇〇u/mL，培養(yǎng)3-10天，制得CIK細(xì)胞。2. 如權(quán)利要求1所述的豬CIK細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述完全培養(yǎng)基為1640培 養(yǎng)液與胎牛血清組成的混合液、或KBM581無血清培養(yǎng)液。3. 如權(quán)利要求2所述的豬CIK細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述完全培養(yǎng)基為1640培 養(yǎng)液與胎牛血清組成的混合液，其中每毫升混合液中含有5 %的胎牛血清。4. 如權(quán)利要求2所述的豬CIK細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述制備方法還包括向完 全培養(yǎng)基中加入培養(yǎng)溶質(zhì)。5. 如權(quán)利要求4所述豬CIK細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述培養(yǎng)溶質(zhì)包括提取混合 物，所述提取混合物是由如下重量份數(shù)的成分組成： 蒲公英提取物10-15 半枝蓮提取物5-7.5 芡實提取物1.2-3.5 金銀花提取物15-20。6. 如權(quán)利要求5所述的豬CIK細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述提取混合物的制備方 法如下： a. 稱取蒲公英、半枝蓮、芡實和金銀花，粉碎，加濃度為75 %的乙醇水溶液，回流提取三 次，第一次加入乙醇水溶液的量為蒲公英、半枝蓮、芡實和金銀花總量的7倍，回流2小時，第 二次加入乙醇水溶液的量為蒲公英、半枝蓮、芡實和金銀花總量的5倍，回流2小時，第三次 加入乙醇水溶液的量為蒲公英、半枝蓮、芡實和金銀花總量的3倍，回流1小時，合并回流液， 過濾，濾液濃縮至稠膏； b. 向步驟a所得稠膏中加入2倍乙醇，過濾，濾液上大孔吸附樹脂柱，以水洗脫，除去餾 分，再用濃度為30-60 %的乙醇水溶液洗脫10個柱體積，收集餾分，濃縮，噴霧干燥，制得提 取混合物。7. 如權(quán)利要求4所述的豬CIK細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述培養(yǎng)溶質(zhì)還包括重量 份數(shù)為0.5-1.5份的甲殼素、0.1-0.3份的聚甲基丙烯酸甲酯、0.4-0.7份的氧化鐵、5-10份 的多聚谷氨酸和1-3份的阿拉伯膠。8. 如權(quán)利要求4所述的豬CIK細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述培養(yǎng)溶質(zhì)還包括重量 份數(shù)為2-5份的磷酯酰絲氨酸、1-2份的沙苑子提取物、5-10份的威靈仙提取物和1-3份的膽 固醇棕櫚酸酯。9. 一種用于提高豬CIK細(xì)胞增殖力的組合物，其特征在于，所述組合物是由如下重量份 數(shù)的成分組成： 磷酯酰絲氨酸2-5 沙苑子提取物1-2 威靈仙提取物5-10 膽固醇棕櫚酸酯1-3。10. -種權(quán)利要求9所述的組合物的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括如下步 驟： 1) 稱取沙苑子粉碎，加水煎煮2次，第一次加入水的量為沙苑子重量的7倍，煎煮3小時， 第二次加入水的量為沙苑子重量的5倍，煎煮2小時，合并煎煮液，過濾，向濾液中加入乙醇， 使乙醇的濃度達(dá)到53%，靜置，過濾，收集濾液，濃縮，噴霧干燥，制得沙苑子提取物； 2) 稱取威靈仙粉碎，加濃度為50%的乙醇水溶液，回流提取兩次，第一次加入乙醇水溶 液的量為威靈仙重量的7倍，回流2小時，第二次加入乙醇水溶液的量為為威靈仙重量的5 倍，回流2小時，合并回流液，過濾，濾液濃縮至稠膏； 3) 向步驟2)所得稠膏中加入2倍水，過濾，濾液上大孔吸附樹脂柱，以水洗脫，除去餾 分，再用濃度為75-95 %的乙醇水溶液洗脫10個柱體積，收集餾分，濃縮，噴霧干燥，制得威 靈仙子提取物； 4) 將沙苑子提取物、威靈仙提取物與磷酯酰絲氨酸和膽固醇棕櫚酸酯混合均勻，制得 組合物。
【文檔編號】C12N5/0783GK105969730SQ201610590244
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年7月25日
【發(fā)明人】陸濤峰, 陳洪巖, 韓凌霞, 高彩霞
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所