在第一方面，本發(fā)明涉及根據(jù)權(quán)利要求1的前序部分的一種用于多點掃描顯微的設(shè)備。在第二方面，本發(fā)明涉及根據(jù)權(quán)利要求24的前序部分的一種用于多點掃描顯微的方法。

背景技術(shù)：

例如，在wo13131808a1中描述了一種用于多點掃描顯微的常用裝置，該設(shè)備具有以下構(gòu)件：多色光源，其用于提供至少一個照射光束；分束設(shè)備，其用于將照射光束分束成多個照射子光束；第一光學(xué)裝置，其提供照射光路，以將單獨的(individual)照射子光束分別引導(dǎo)并聚焦到待檢驗的樣本上或樣本中的光斑中；掃描單元，其用于在樣本上方引導(dǎo)光斑；檢測單元，其用于檢測在用單獨的照射子光束輻照之后的檢測子光束中的樣本輻射的檢測光；第二光學(xué)裝置，其用于提供將檢測子光束引導(dǎo)到檢測器單元的檢測光路；以及控制和評價單元，其用于控制掃描單元并且用于評價檢測單元檢測的檢測光。

在wo13131808a1中還公開了一種用于多點掃描顯微的常用方法。這里，執(zhí)行以下步驟：用多色光源提供至少一個照射光束，將照射光束分束成多個照射子光束，將單獨的照射子光束分別在照射光路中引導(dǎo)到待檢驗的樣本上或樣本中的光斑中并且在樣本上方進行掃描，將在用單獨的照射子光束輻照之后的檢測子光束中的樣本輻射的檢測光引導(dǎo)到檢測器單元并且由檢測器單元進行檢測。

激光掃描顯微已經(jīng)發(fā)展成生命科學(xué)中不可缺少的工具。特別地，散射背景下的三維結(jié)構(gòu)的成像是適于大范圍的生物醫(yī)療應(yīng)用的方法。特別地，該方法的多面性導(dǎo)致了對應(yīng)系統(tǒng)得以廣泛傳播和寬廣的應(yīng)用領(lǐng)域。

然而，該方法仍然有一系列問題。這些問題包括：第一，熒光被漂白并且通常對樣本造成光損傷的顯著傾向；第二，圖像記錄相對較慢；第三，相比于寬場方法，噪聲增加。

這些問題的原因在于圖像形成的類型。通常這樣執(zhí)行，使得點，更具體地，照射點擴散函數(shù)(psf)的體積順序地對樣本進行光柵掃描或掃描。在針孔處將離焦光相對于焦點信號光區(qū)分開。這造成用光學(xué)層析的性質(zhì)來生成圖像。這意味著，只有來自焦平面的光才對信號有貢獻。以此方式，也能對光學(xué)上更致密且略有散射的樣本進行無模糊成像。一方面，用激光束對樣本進行掃描導(dǎo)致焦斑的功率高。這是照射斑，在樣本上或樣本中，照射光被聚焦到照射斑上或照射斑中。另一方面，對樣本進行掃描促進僅緩慢圖像形成，這受到掃描儀的速度或樣本中的染料發(fā)射速率的限制。因為在樣本中相應(yīng)地只掃描小體積，所以樣本中的染料發(fā)射速率本質(zhì)上是低的。

盡管共聚焦顯微在生命科學(xué)中的非常廣泛的傳播，但它特別地具有以下問題：為了以可接受的信噪比(snr)生成信息，必須在短時間內(nèi)生成一定數(shù)目的光子(例如，對于以大約3的snr在1μs的像素時間中檢測10個光子，是10mhz速率信號光子；由于系統(tǒng)中的損失，導(dǎo)致樣本中的速率必須還要高得多)。這與以下關(guān)聯(lián)：第一，樣本的漂白；第二，使在活細胞顯微的視場中不能進行或者至少相當(dāng)程度更難進行許多參數(shù)檢驗的損傷。

縮短像素時間造成圖像形成略快，但另一方面，造成用于足夠高信號生成的焦斑中的甚至更高的功率。因此，不能夠用單斑激光掃描顯微鏡來解決與1)圖像速度、2)良好的信噪比和3)低光子損傷這三個基本要求相關(guān)的內(nèi)在困境。

熒光顯微的其它重要性質(zhì)是其光譜寬帶。不同染料的激發(fā)最大值位于從uv經(jīng)由可見光譜延伸遠至紅外光譜范圍的范圍內(nèi)。在標準商業(yè)系統(tǒng)中，通?？捎玫氖遣ㄩL范圍是400nm-645nm或更高范圍的激發(fā)。用僅一個激光焦點對樣本進行掃描就這點而言也是不利的。多個激發(fā)波長可以被聚焦在同一焦斑中，因此多個熒光團可以被同時激發(fā)。然而，即使在光譜選擇性檢測的情況下，也一直引起所謂的交叉激發(fā)和不期望的光譜部分的檢測，這會導(dǎo)致結(jié)構(gòu)或不期望背景的錯誤指認。

通過旋轉(zhuǎn)盤(sd)系統(tǒng)來提供相對于可實現(xiàn)snr的略好狀況。這里，光被分布到許多(大約1000個)聚焦體積。以大致相同的snr，樣本中的特定區(qū)域的照射時間因此隨每個聚焦體積的強度降低而同時增加。這整體上導(dǎo)致行為相對于由光毒性帶來的光損傷有大幅提高。然而，不能夠靈活使用這些系統(tǒng)。特別地，光斑距離不能變化。另外，檢測限于相機，這使得檢測多于2個光譜通道相當(dāng)大程度上更困難。另外，不能夠用這些非基于掃描儀系統(tǒng)在樣本中進行電子變焦。用這些系統(tǒng)完全不能夠進行諸如熒光相關(guān)光譜的點測量。

在de10215162b4、wo13131808a1、us6028306a中已經(jīng)描述了其它多點系統(tǒng)。這些系統(tǒng)在提供掃描激光點時總是引起問題。例如，在de10215162b4和de102010047353a1中描述了其布置。

所有這些系統(tǒng)的性質(zhì)另外在于，它們只提供無源多束生成。這意味著，例如，顏色分束通常是固定的并且對于所有光束而言是大體相等的。在at-131942-e中，對于不同掃描點使用不同激光，這大幅限制了該系統(tǒng)的靈活性。此外，不能夠獨立地調(diào)諧單獨的光束和顏色的亮度，這在要檢驗用不同染料進行不同程度的標記的結(jié)構(gòu)時造成了問題。

在高質(zhì)量尤其是關(guān)鍵因素的測量中，通常記錄時間多軌道。這里，每個均要求用于激發(fā)的特定波長并且要求用于檢測的特定光譜配置的不同熒光團的圖像被在時間上一個接一個地記錄，盡管傳統(tǒng)系統(tǒng)原理上能夠同時進行記錄。即使用戶在此具有時間上的不足，相對于所實現(xiàn)質(zhì)量的益處也勝過了該不足。

at-131942-e指示了如下系統(tǒng)，該系統(tǒng)避免了因樣本中的各個不同位置處發(fā)生光譜激發(fā)導(dǎo)致光譜串?dāng)_的效果。這里，參照空間光譜多追蹤。然而，顏色通道由此被固定地預(yù)先限定且是不能配置的。因此，因為波長分布被固定地預(yù)先限定，所以相對于諸如例如樣本保存或速度的其它參數(shù)，在樣本包含比原理上能檢測到的染料的數(shù)目少的情況下，該系統(tǒng)不能夠被優(yōu)化。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

可以認為本發(fā)明的目的是指示廣泛避免了以上提到的問題的設(shè)備和方法。

通過具有權(quán)利要求1的特征的設(shè)備并且通過具有權(quán)利要求24的特征的方法來實現(xiàn)該目的。

以下，特別地，將與隨附權(quán)利要求書和附圖關(guān)聯(lián)地，描述根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備的有利實施例和根據(jù)本發(fā)明的方法的優(yōu)選變型。

根據(jù)本發(fā)明對以上所指示的常用裝置的進一步改進之處在于，在照射子光束中的至少兩個的照射光路中，存在用于獨立設(shè)定相應(yīng)照射子光束的光譜組成的可控光束操縱裝置，并且還將控制和評價單元被設(shè)計成控制光束操縱裝置。

根據(jù)本發(fā)明對以上所指示的常用裝置的進一步改進之處在于，對于照射子光束中的至少兩個獨立地設(shè)定照射光的光譜組成。

可以看到，本發(fā)明的基本優(yōu)點在于，根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備可以取決于樣本進行優(yōu)化，或者可以甚至自身進行優(yōu)化，使得可以實現(xiàn)掃描速度顯著增加、光損傷減少、避免光譜交叉激發(fā)或者信噪比增大。此外，在由此形成的不同激發(fā)/檢測路徑中，可以組合不同類型的傳感器(例如，可用其空間測量點擴散函數(shù)(psf)的空間分辨(例如，像素化)檢測器與集成檢測器的組合)。因此，提供用于生物醫(yī)療成像中的不同測量任務(wù)的靈活光學(xué)布置。同時，提供了新的光譜選擇性顯微方法。

優(yōu)選地，第一光學(xué)裝置和第二光學(xué)裝置具有至少一個顯微鏡物鏡、x-y掃描儀單元和/或至少一個主顏色分束器作為公共構(gòu)件。

已經(jīng)通過在多個照射子光束中分別并且獨立設(shè)定照射光的光譜實現(xiàn)了本發(fā)明的基本優(yōu)點。然而，特別優(yōu)選地是，在根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備中，在檢測子光束中的至少兩個的檢測光路中另外存在用于獨立影響經(jīng)由相應(yīng)檢測子光束傳遞到檢測單元的檢測光的光譜組成的可控光譜選擇裝置，并且控制和評價單元也被設(shè)計成控制光譜選擇裝置。根據(jù)本發(fā)明的方法的變型與之對應(yīng)，其中，在至少兩個檢測子光束的情況下，經(jīng)由相應(yīng)檢測子光束傳遞到檢測單元上的檢測光的光譜組成受到獨立影響。在這些變型中，實現(xiàn)了在照射側(cè)還有檢測側(cè)都存在光譜選擇的特殊優(yōu)點。因此，可以對相應(yīng)樣本，特別地對分別使用的熒光染料，高度明確地定制測量。

在原理上，如果可以在至少兩個照射子光束中獨立地設(shè)置光譜組成，則已經(jīng)實現(xiàn)了本發(fā)明的基本思路。然而，以下的根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備的變形是特別優(yōu)選的，其中，在每個照射子光束的照射光路中，存在用于獨立設(shè)定或調(diào)節(jié)相應(yīng)照射子光束的光譜組成光束操縱裝置。其中對于每個照射子光束獨立設(shè)定照射光的光譜組成的根據(jù)本發(fā)明的方法的變型對應(yīng)于這些示例性實施例。根據(jù)本發(fā)明的上述優(yōu)點是，照射和檢測可以在原理上特別好地適于任何種類的樣本，并且在原理上，由此以特殊方式實現(xiàn)了任何期望的熒光染料。特別地，還可以用根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備來測量光譜重疊帶。

出于相同原因，以下的根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備的示例性實施例是示優(yōu)選的，其中，在每個檢測子光束的檢測光路中，存在用于獨立影響經(jīng)由相應(yīng)檢測子光束傳遞到檢測單元的檢測光的光譜組成的可控光譜選擇裝置。在根據(jù)本發(fā)明的方法的變型中，在每個檢測子光束中，經(jīng)由相應(yīng)檢測子光束傳遞到檢測單元的檢測光的光譜組成因此受到獨立影響。用這些示例性實施例來提供相對于大部分變化的測量情形綜合配置的高度功能化裝置以及方法。

在原理上，例如，如果使用復(fù)用技術(shù)，則單個檢測器可以足以對檢測光進行檢測。然而，檢測單元優(yōu)選地具有用于測量樣本上的特定光斑相應(yīng)地發(fā)射的檢測光的多個單獨的檢測器。然后，可以特別有效地記錄測量數(shù)據(jù)。

根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備的其它優(yōu)選示例性實施例的特征在于，檢測光路中的光學(xué)構(gòu)件，特別地，可控光譜選擇裝置，是保持點擴散函數(shù)的構(gòu)件。關(guān)于待檢驗樣本的其它可用信息可以得自點擴散函數(shù)。

在原理上，單獨的檢測器可以是例如光電倍增器或單獨的光電二極管。然而，如果例如要測量點擴散函數(shù)，則在單獨的檢測器分別是空間分辨檢測器且特別地分別是二維光電二極管陣列時是有用的。這里，單光子雪崩二極管陣列(spad陣列)是特別有利的。這些具有非常好的靈敏度，還可以借此對單獨的光子進行計數(shù)。另外，可以形成這些雪崩二極管的像素化結(jié)構(gòu)。然而，除了這些傳感器之外，還可以使用傳統(tǒng)的倍增光電二極管，如果它們設(shè)置有光傳播裝置(zeiss的airyscan模塊)。最后，還可以使用微通道板和/或光纖連接光電倍增器。尤其有利的是使用不同的傳感器類型，例如，用空間分辨檢測器與集成檢測器的組合進行點擴散函數(shù)的空間測量。在原理上，可以使用具有期望的光譜選擇功能的所有構(gòu)件作為光束操縱裝置。該功能可以在原理上基于折射、衍射、選擇性反射和/或吸收。

為了能夠快速變化或調(diào)制激光的強度，優(yōu)選地，在激光掃描顯微中使用聲光元件作為光束操縱裝置。如果僅僅要影響一個激光線的強度，則可以使用聲光調(diào)制器(aom)。如果另一方面存在每一個強度都變化的不同波長的多個激光線的復(fù)用，則必須使用聲光(aof)濾波器。通常，聲光調(diào)制器(aom)允許有比aotf更高的調(diào)制頻率。這些聲光元件是被特殊切割和研磨的晶體(例如，teo2)，在這些元件中，使用激發(fā)用于振動的換能器的高頻信號來形成衍射光柵。

基本上通過該換能器的形式和大小來確定聲光元件的光譜性質(zhì)和光學(xué)性質(zhì)二者。耦合到聲光元件中的激光的部分在晶體中激發(fā)的光柵處發(fā)生衍射?？梢酝ㄟ^變化所供應(yīng)的高頻信號的功率來調(diào)節(jié)通過衍射而偏轉(zhuǎn)的激光的該部分的強度。

雖然在aom的情況下為了影響波長λ的一個激光線而需要供應(yīng)僅具有特征頻率fλ的高頻載波，但在aotf中，為了變化多個激光線的強度，需要復(fù)用多個高頻載波。

這些聲光元件被作為空間單通道還有多通道二者提供。在單通道aom/aotf中，僅僅一個換能器被布置在晶體上。因此，只有一個激光束或多個激光線的一個束可以受到影響。在空間多通道aom/aotf中，多個換能器被一個在另一個旁邊地布置在同一晶體上。由此，可以影響同一波長(aom)的多個平行激光束或同時自身共線性(aotf)但其強度彼此獨立的多個并行激光線束(aotf)。

優(yōu)選地，光束操縱裝置具有多個聲光元件，特別地，aom、aod和/或aotf。聲光構(gòu)件是商購的，特別地，也具有非常小的結(jié)構(gòu)大小，這對于顯微而言是有利的。然而，此外，還可以有利地使用諸如例如多通道光電調(diào)制器(eom)或空間光調(diào)制器(slm、dmd、mems等)的替代分段的光束操縱裝置。

在根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備的特別優(yōu)選的示例性實施例中，光束操縱裝置具有至少一個空間多通道aotf。對應(yīng)地，在用于獨立設(shè)定或調(diào)節(jié)照射子光束中的照射光的光譜組成的根據(jù)本發(fā)明的方法的特別優(yōu)選的變型中，使用至少一個空間多通道aotf/aom作為光束操縱裝置。這些空間多通道aotf/aom特別適于多點掃描顯微，因為照射光束可以用這些構(gòu)件相當(dāng)密集地引導(dǎo)到彼此旁邊。因此，所使用的透鏡還可以相當(dāng)小。

本發(fā)明還涉及用多個通道有利地控制或驅(qū)動聲光元件，例如，aotf/aom。

為了控制aom/aotf，使用特殊hf合成器組件，這些組件取決于應(yīng)用來提供單獨的正弦高頻信號(aom)或不同頻率的多個高頻信號的復(fù)合(aotf)。取決于合成器組件的設(shè)計，高頻信號的功率可以受模擬控制信號影響或被數(shù)字調(diào)制。在控制空間多通道aom/aotf的情況下，在原理上，可以在換能器之間的功率分離器的輔助下，分離或劃分合成器組件提供的控制信號。然而，通過以此方式進行，靈活性受相當(dāng)大限制，因為隨后對于空間多通道aom/aotf的所有換能器而言同步發(fā)生調(diào)制。

如果空間多通道聲光元件的每個換能器受單獨合成器組件控制，則可以進行顯著更靈活的控制。由于空間多通道聲光元件的換能器之間的相互作用，導(dǎo)致將在合成器組件的設(shè)計中滿足一系列條件，以避免不期望的次生效應(yīng)。

因此，本發(fā)明的子任務(wù)是提供導(dǎo)致空間多通道aotf/aom的換能器它們自身之間的影響(交叉耦合)盡可能低的合成器組件的布置和操作模式。

該子任務(wù)通過以下變型來實現(xiàn)：其中，空間多通道aotf/aom的不同通道的控制信號具有相對于彼此的恒定相位位置，特別地，在接通處理之后具有相對于彼此的恒定相位位置。使用多通道aotf的主要優(yōu)點是其相當(dāng)小的構(gòu)造尺寸，使得照射光束可以被引導(dǎo)成彼此靠近。這樣促進相當(dāng)小構(gòu)件，特別地，相當(dāng)小的透鏡的使用。光束的橫向距離優(yōu)選地在光束直徑的5倍和50倍之間，特別優(yōu)選地在光束直徑的8倍和15倍之間。

根據(jù)本發(fā)明認識到，通過調(diào)節(jié)信號發(fā)生器的相位差θn，可以顯著改善空間多通道aotf/aom的通道之間的絕緣。

另外，本發(fā)明認識到，在合成器組件，即，提供空間多通道aotf/aom的換能器的控制信號的構(gòu)件每次重新開啟的情況下，在空間通道之間設(shè)定所限定的相對初始相位位置是有利的。當(dāng)在本申請中描述的類型的并行圖像記錄中，使用空間多通道聲光元件作為多點應(yīng)用的均衡器時，這尤其顯著。在這種模式下，每個子光束掠過樣本的特定部分并且生成子圖像。最終，通過在控制和評價單元中將子像素合在一起，一起合成最終圖像。所有子圖像必須在連接點具有相同亮度，因為否則在樣本的最終圖像中造成了干涉結(jié)構(gòu)。如果不能確?？刂菩盘柕乃薅ǖ南鄬Τ跏枷辔晃恢茫瑒t由于空間多通道聲光元件的換能器之間的相互作用，取決于相位位置，可以在通道中引起強度差異。如果聲光元件透射波長λ的多個激光線的復(fù)合，則必須分別對于每個激發(fā)頻率fλ來設(shè)定所限定的相位差δθ。

通過適當(dāng)選擇直接相鄰的換能器的相位差δθ，它們激發(fā)的衍射光柵之間的相互作用可以減少，因此實現(xiàn)了絕緣的優(yōu)化。截止現(xiàn)在的測量已經(jīng)表明，如果對于相位差δθ而言應(yīng)用下式，則引起最小的相互作用：

δθ＝90°+k×180°(k是整數(shù))。

可能偏離該值并且可能例如通過信號合成組件中和系統(tǒng)布線中的運行時間差異來引起這些偏離。

因此，在根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備的實施例和根據(jù)本發(fā)明的方法的變型中可以進行其它改進，其中，空間相鄰?fù)ǖ赖亩嗤ǖ繿otf的激發(fā)信號具有90°+n×180°的相對相位距離，n由此是整數(shù)。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，令人驚奇地認識到，如果選擇了此相位距離，則多通道aotf的相鄰?fù)ǖ赖男盘柎當(dāng)_特別低。為了照射空間多通道aotf/aom，通過光學(xué)分束設(shè)備將照射光束分束成多個照射子光束。

在原理上，可以用于實現(xiàn)照射光束的期望分束的任何構(gòu)件可以用作分束設(shè)備。特別地，這些構(gòu)件可以是折射或衍射構(gòu)件。其中分束設(shè)備具有至少一個波導(dǎo)芯片的變型是特別優(yōu)選的。波導(dǎo)芯片是商購構(gòu)件。

根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備的特別優(yōu)選的示例性實施例的特征在于，控制和評價單元被設(shè)計成一方面用于特定照射子光束中的光束操縱裝置的彼此調(diào)諧，并且另一方面用于來自樣本上的特定照射子光束生成的光斑的檢測子光束中的光譜選擇裝置的彼此調(diào)諧。相對于該方法，優(yōu)選地，一方面特定照射子光束中的光束操縱裝置被彼此調(diào)諧，并且另一方面來自樣本上的特定照射子光束產(chǎn)生的光斑的檢測子光束中的光譜選擇裝置被彼此調(diào)諧。在這個實施例中，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)點是特別有效的。光譜選擇在照射側(cè)執(zhí)行，并且在檢測側(cè)被調(diào)諧。檢測側(cè)濾波器系統(tǒng)的復(fù)雜度可以因此顯著降低。與之關(guān)聯(lián)，可以保證濾波器布置的高光學(xué)透射率。

該變型可以通過將控制和評價單元設(shè)計成控制光束操縱裝置和光譜選擇裝置來檢測樣本上或樣本中的至少一種，特別精確地是一種確定的熒光染料來特別有用且有利地改進。依據(jù)該方法，可以優(yōu)選地在照射子光束中設(shè)定照射光的光譜組成，并且可以在檢測子光束中控制光譜選擇裝置，以檢測至少一種特定，特別精確地是一種熒光染料。因此，可以用根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備和根據(jù)辦法明年的方法將單獨的熒光染料特別好地分開。另外，裝置可以目標明確地被設(shè)定成檢測特定熒光染料。特別地，還可以檢測光譜重疊帶。

在原理上，可以用于實現(xiàn)選擇進行檢測所期望的檢測光的光譜部分的所有構(gòu)件可以用作可控光譜選擇裝置。例如，選擇裝置可以具有至少一個濾色器和/或至少一個色散裝置，特別地，折射裝置(例如，棱鏡)和/或衍射裝置(例如，與反射鏡元件結(jié)合的衍射光柵)?；旧希诳梢杂欣厥褂帽景l(fā)明的熒光顯微中，將檢測所使用的染料的發(fā)射光。

在一個優(yōu)選變型中，選擇裝置具有多個濾色器。這些可以是例如分度濾色器。對于所有檢測子像素，可控選擇裝置可以例如是相同的。分度濾色器是其中如果進入光的波長小于閾值波長則反射該進入光，如果進入光的波長大于閾值波長則透射該進入光，或反之亦然的構(gòu)件。這些構(gòu)件因此被描述為分度濾色器，因為閾值波長取決于這些構(gòu)件上的入射光接觸點而不同，并且特別地，隨著光的接觸位置而連續(xù)改變。通過更換這些分度濾色器，因此可以有利地連續(xù)調(diào)節(jié)閾值波長。另外，可以使用分立的顏色分束器或可調(diào)節(jié)(可調(diào)諧)的顏色分束器，其波長選擇性行為取決于它們的相對于光軸的角度取向(舉例來說，這里可以提到商購的semrock生產(chǎn)的versachrome濾波器)。然而，在此時還可以使用在不同旋轉(zhuǎn)位置具有不同光譜性質(zhì)的旋轉(zhuǎn)濾波器。

如果只掃描樣本區(qū)域中的一種染料，則控制光束操縱裝置使得對于所有照射子光束而言光譜組成相同可以是優(yōu)選的。因此，可以實現(xiàn)樣本區(qū)域的更快速記錄或具有更好信噪比的記錄。

替選地或另外地，可控選擇裝置可以是相同的和/或在所有檢測子光束中設(shè)定成相同的。

根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備因此可以被配置成，使得可以用原理上相同的多個照射子光束和檢測子光束來執(zhí)行多點掃描顯微。

在根據(jù)本發(fā)明的方法的其它優(yōu)選變型中，控制光束操縱裝置，使得每個照射子光束具有不同的光譜組成。如果在樣本區(qū)域中要同時檢測多種染料，則可以使用該變型。

所描述的變型的混合形式也是可能的，并且可以是有利的。這意味著：例如，在總共四個照射子光束的情況下，這些子光束中的每兩個可以具有相同的照射光譜。因此，與照射子光束關(guān)聯(lián)的檢測子光束和位于這里的光束操縱裝置可以均被設(shè)定成相同的。在原理上，用此布置，在每種情況下，都將存在兩個相同的照射子光束和后續(xù)的檢測子光束。

該布置可以如下取決于樣本而被優(yōu)化或者可以自身進行優(yōu)化，即實現(xiàn)了掃描速度的明顯增大和/或光損傷的減少和/或光譜交叉激發(fā)的避免和/或信噪比的增大。

最后，根據(jù)本發(fā)明的方法的優(yōu)選實施例的特征在于從相應(yīng)地檢測到的檢測子光束進行計算、生成和/或示出而得到的圖像，來解決測量任務(wù)。

因此，對于生物醫(yī)療成像中的不同測量任務(wù)，可以進行靈活的光學(xué)布置。同時，描述了新的光譜選擇性顯微方法。

附圖說明

以下，將參照附圖來描述本發(fā)明的其它優(yōu)點、特征和性質(zhì)，在附圖中：

圖1示出根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備的示意圖；

圖2示出根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備和根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的、光譜選擇裝置的示例性實施例；

圖3示出不同操作狀態(tài)下的圖2的光譜選擇裝置；以及

圖4示出根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備的照射光路中的可以用作可控光束操縱裝置的多通道aotf的示意圖。

具體實施方式

用根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備進行測量的基本原理是基于激光掃描顯微鏡。顯微鏡的光學(xué)布置被設(shè)計成，使得用光學(xué)地產(chǎn)生并行模式的操作。關(guān)鍵的是，多個照射光束可以被耦合到顯微鏡中。

特定數(shù)目的激光線可以被提供到該顯微鏡，以便進行光譜照射。首先，它們是分立的激光線、可調(diào)諧的激光還是白光激光是不相關(guān)的。另外，激光是連續(xù)還是脈沖的并不重要。最后，本發(fā)明的可用性不限于諸如例如常規(guī)熒光激發(fā)的特定激發(fā)機構(gòu)?？梢允褂梅蔷€性處理，特別地，諸如，兩光子熒光或cars顯微中的兩光子處理。特別地，可以使用主顏色分束器將這些光譜分量反射到顯微鏡的光路中。為此，主顏色分束器必須支持要耦合到顯微鏡中的所有波長。這意味著，主顏色分束器必須充當(dāng)要耦合的所有波長的反射鏡。這對于例如二向色元件是可能的。然而，這里還可以組合多個主顏色分束器的效果，并且操縱光譜分束空間中的一個或兩個光束。此外，可以在主顏色分束器處將檢測光分束。然而，除了傳統(tǒng)的二向色分束器之外，激發(fā)和檢測之間的波長分束的其它方法也是可能的。因此，還可以使用聲光分束器(aobs)。

傳統(tǒng)上，在激光掃描顯微中，只用一個激光點對對象進行掃描。然而，還已知其它布置，例如，線掃描系統(tǒng)。在本發(fā)明中，將把激發(fā)光引入樣本中，使得多個照射斑對對象進行光柵掃描。為此，來自激光源的光必須被空間分束。以下，將描述提供用于對樣本進行掃描的多個照射斑的光學(xué)布置?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明來單獨地設(shè)定這些照射斑的強度和顏色二者。

此外，還可以單獨地調(diào)制單獨的光束。特別優(yōu)選地，單獨的照射子光束的光束質(zhì)量非常高，由此，如果要實現(xiàn)高圖像質(zhì)量的話，這構(gòu)成了激光掃描顯微鏡的基本必備條件。

在所有附圖中，總體上，用相同的附圖標記來設(shè)置相同和類似的構(gòu)件。

根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備100的圖1中示意性示出的示例性實施例具有以下的主要構(gòu)件：多色光源10，其用于提供至少一個照射光束18；分束設(shè)備16，其用于將照射光束分束成多個照射子光束11、12、13、14；第一光學(xué)裝置30、35、56、38、55，其用于提供照射光路，以將單獨的照射子光束11、12、13、14、31、32、33、34分別引導(dǎo)和聚焦到待檢驗的樣本40上或樣本40中的光斑41、42、43、44中。

更進一步地，還存在掃描單元38(作為第一光學(xué)裝置30的部分)和檢測單元，掃描單元38用于在樣本40上方引導(dǎo)光斑41、42、43、44，檢測單元具有檢測器d1至d4，檢測器d1至d4用于在用單獨的照射子光束31、32、33、34輻照之后，檢測在檢測子光束51、52、53、54中的被樣本40輻射的檢測光。

此外，裝置100具有：第二光學(xué)裝置50，其用于提供將檢測子光束51、52、53、54引導(dǎo)到檢測器單元的檢測光路；以及最后，控制和評價單元90，其用于控制掃描單元38并且評價檢測單元檢測的檢測光。第一光學(xué)裝置30和第二光學(xué)裝置50可以部分地具有相同光學(xué)構(gòu)件，特別地，顯微鏡物鏡。掃描單元38可以例如是具有檢流計反射鏡的傳統(tǒng)x-y掃描儀?？梢杂煽刂坪驮u價單元90經(jīng)由連接件95來控制光源10。

根據(jù)本發(fā)明，在照射光路中還存在可控光束操縱裝置21、22、23、24，在每種情況下，可以用這些裝置來獨立地設(shè)置相應(yīng)照射子光束11、12、13、14的光譜組成?？煽毓馐倏v裝置21、22、23、24在圖1中示出的示例性實施例中示意性地在一起，以形成精確包含這些光束操縱裝置21、22、23、24的可控光束操縱裝置20。此外，根據(jù)本發(fā)明，在檢測光路中，存在可控光譜選擇裝置61、62、63、64，可以用這些裝置來獨立地影響經(jīng)由相應(yīng)檢測子光束51、52、53、54、71、72、73、74傳遞到檢測單元的檢測光的光譜組成。

特別地，多色光源10可以是具有多個激光源的激光單元，如例示示例l1和l2中一樣。在所示出的示例中，光源10發(fā)射的照射光束18經(jīng)由反射鏡36、67傳遞到分束設(shè)備16，特別地，分束設(shè)備16可以是波導(dǎo)芯片。例如，可以在與分束設(shè)備光學(xué)且機械連接的光纖的輔助下，實現(xiàn)將照射光束18耦合到分束設(shè)備16中。離開光纖的輻射因此耦合到分束設(shè)備中。然而，也可以進行自由光束耦合。分束設(shè)備16用于實現(xiàn)跨例如2ⁿ個子光束的照射光束18的分束。字母“n”指示分束設(shè)備16內(nèi)，例如，進而波導(dǎo)芯片內(nèi)的分束級聯(lián)的數(shù)目。

在每個級聯(lián)中，通過y個分束器，可以將光的路徑大致等分地分束到兩個新路徑上。精確地，跨2ⁿ個子光束或者到2ⁿ個子光束上的分束的原因優(yōu)選地是出于效率原因。然而，在原理上，例如，可以通過減弱不必要的子光束來生成任何數(shù)目的光束。

在通信工程中已知具有該功能的分束器。這里，然而，光學(xué)條件比較簡單，因為需要觀察僅一個波長，例如，1300nm或1550nm。

在本發(fā)明的前期工作的范圍內(nèi)，認識到，特別地，可以在顯微中有利地使用基于層波導(dǎo)的分束器，還可以實現(xiàn)特別地相對于寬帶方面的高要求。例如，認識到，可以在所有波長上調(diào)諧照射光的相應(yīng)強度，使其相較于彼此高50％，甚至高25％或最終甚至高10％。在單獨的照射子光束上越好地發(fā)生該光譜強度調(diào)諧，激光源可以越有效地用于所描述應(yīng)用。然而，對于根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備和根據(jù)本發(fā)明的方法，分束器還可以用于不完美調(diào)諧時，并且還可以用這些分束器來提高圖像質(zhì)量。

例如，可以執(zhí)行平均化掃描。在該操作模式下，可以通過照射子光束中的每一個對樣本中的關(guān)注區(qū)域進行徹底的光柵掃描，隨后從所有單獨的圖像來計算平均圖像。對于此平均化而言，光束的自身之間的的完美調(diào)諧不是絕對必要的。然而，這個初始無源的光束生成仍然被大幅改進，因此最終顯著更廣泛地使用。

這可以通過強度受影響的不同光路而在分束設(shè)備16上實現(xiàn)，例如，進而直接在波導(dǎo)芯片上實現(xiàn)。為此，已知諸如例如mach-zehnder干涉儀的集成光學(xué)電路。這里，使用mach-zehnder干涉儀的光路之間的相移來設(shè)定芯片上的該干涉儀的輸出端處的功率。因此，可以例如在幾毫秒內(nèi)快速實現(xiàn)分束設(shè)備的光學(xué)輸出調(diào)諧。

在圖1中示意性示出的示例性實施例中，可以被稱為第二級的光束操縱單元20在分束設(shè)備16的下游。在該第二級中，存在每個照射子光束11、12、13、14的可控光束操縱裝置21、22、23、24。這些可控光束操縱裝置還可以被描述為光譜選擇性工作元件，并且用這些裝置可以為每個照射子光束11、12、13、14設(shè)定強度和光譜組成兩者。

在特別優(yōu)選的變型中，可以使用aotf(聲光可調(diào)諧濾波器)作為可控光束操縱單元20。首先，可以實現(xiàn)分束設(shè)備16與該aotf的光學(xué)連接。這是例如經(jīng)由合適的自由光束光學(xué)系統(tǒng)發(fā)生的。然而，在原理上，經(jīng)由光纖束進行耦合和直接耦合可控光束操縱裝置，例如，直接耦合aotf，也是可能的。

可控光束操縱裝置21、22、23、24被設(shè)計成，使得照射子光束11、12、13、14中的每一個可以相對于其它照射子光束11、12、13、14單獨地且獨立地受到影響，或者換句話講，被調(diào)制。照射子光束連同關(guān)聯(lián)的可控操縱裝置21、22、23、24也被稱為單個空間通道。當(dāng)使用aotf時，可以在一個空間通道中處理高達八種顏色。例如，可以使用具有由例如大體teo2組成的不同晶體的aotf，或者具有分段的換能器電極的單晶。每個照射子光束的強度可以單獨的受到影響。另外，可以相對于其它照射子光束單一地、單獨地且獨立地設(shè)定相應(yīng)照射子光束中的相應(yīng)波長的光及其光譜強度的選擇。由于這些性質(zhì)，布置和這些可控光束操縱裝置被稱為空間波長選擇器。以下，將參照圖4更詳細地說明這些技術(shù)方面。

通過分別布置在照射子光束11、12、13、14中的可控光束操縱裝置21、22、23、24的作用，產(chǎn)生照射子光束31、32、33、34。照射子光束31來自可控光束操縱裝置21對照射子光束11的作用。對應(yīng)地，對于其它照射子光束32、33、34，同樣如此。隨后，用第一光學(xué)裝置30將照射子光束31、32、33、34引導(dǎo)到樣本40上，在具體例示的示例中，第一光學(xué)裝置30具有被示出為風(fēng)格化透鏡35、主顏色分束器56、掃描裝置38和顯微鏡物鏡55的光學(xué)構(gòu)件。照射子光束31由此被引導(dǎo)并且聚焦在待檢驗的樣本40上或樣本40中的光斑41，也可以被稱為焦點中。其它照射子光束32、33、34對應(yīng)地被分別引導(dǎo)并且聚焦在光斑42、43或44上。在原理上，光學(xué)裝置30是用于多點掃描顯微的已知構(gòu)件。

特別地，掃描單元38優(yōu)選地布置在光路的光瞳中。在圖1中示意性示出的情形中，光斑41、42、43、44在y方向上(相對于圖1中的坐標系45)偏移。例如，可以以光斑41、42、43、44從左到右(在圖中，因此從上向下，因為這些行在x方向上延伸，參見坐標系45)逐行移動并且在一行的結(jié)尾處所有四個光斑向下跳一行(因此，到圖1中的左邊)的方式來實現(xiàn)樣本40的掃描(如果四個照射光束的光譜都不同)。然而，原理上，任何變型是可能的。例如，并非所有光斑41、42、43、44需要被引導(dǎo)到每個樣本位置上。例如，在剛描述的示例中，在一行的結(jié)尾處，所有四個光斑可以向下跳四行。如果四個照射光束的光譜都相同，則該變型是優(yōu)選的。一般，在不同光譜的情況下，所有掃描斑應(yīng)該掃描樣本中的每個位置。然而，順序可以是根據(jù)需要的。其中光斑41、42、43、44被在掃描方向上一個接著一個引導(dǎo)的變型也是可能的。在原理上，任何掃描軌跡是可能的，前提是最終圖像的計算考慮到了這些軌跡?？梢栽谶@眾多的可能變型中看出多點掃描顯微的實質(zhì)優(yōu)點。

當(dāng)單獨的光斑41、42、43、44碰到待檢驗的樣本40時，樣本發(fā)射檢測子光束51、52、53、54中的檢測光，其中，檢測子光束51來自光斑41，對應(yīng)地，檢測子光束52、53、54分別來自光斑42、43或44。因為照射子光束31、32、33、34可以在原理上分別具有不同的光譜組成，從而不同的波長具有不同的強度，所以單獨的檢測子光束51、52、53、54中的檢測光因此在光斑41、42、43、44照射的區(qū)域中也將有所不同，即使假定待檢驗的樣本40的類型相同。

然后，在根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備100中，通過第二光學(xué)裝置50、55、38、56、57將檢測子光束51、52、53、54引導(dǎo)到可控光譜選擇裝置61、62、63、64上。具體地，檢測子光束51、52、53、54，經(jīng)由顯微鏡物鏡55和掃描單元38被引導(dǎo)回到主顏色分束器56。主顏色分束器56被有用地設(shè)計，使得它透射檢測子光束51、52、53、54中的紅色偏移熒光部分。隨后，經(jīng)由被示意性示出為風(fēng)格化透鏡57的其它光學(xué)構(gòu)件，檢測子光束51、52、53、54到達可控光譜選擇裝置61、62、63、64。

檢測子光束41由此碰到可控光譜選擇裝置61，并且因此，檢測子光束52、53、54分別碰到可控光譜選擇裝置62、63、64。可控光譜選擇裝置通常是以某種方式操縱進入的或入射的電磁輻射，特別地光的設(shè)備。諸如吸收、散射、折射和衍射的不同物理效果由此可以變得有效。特別地，經(jīng)由例如光學(xué)棱鏡中的折射的波長依賴性和/或借助例如反射鏡中的反射的波長依賴性，色散效果也可以變得有效?？烧{(diào)節(jié)濾波器，特別地分度濾波器優(yōu)選地用作可控光譜選擇裝置61、62、63、64。

經(jīng)由示例性指示的連接件，特別地通向控制和評價單元90的電線連接件65來實現(xiàn)可控光譜選擇裝置61、62、63、64的控制。另外，控制和評價單元90經(jīng)由連接件25，特別地電線連接件來控制照射光路中的可控光束操縱裝置21、22、23、24。

通過可控光譜選擇裝置61、62、63、64對檢測子光束51、52、53、54的作用，其它檢測子光束71、72、73、74從以上提到的檢測子光束形成。具體地，通過可控光譜選擇裝置61的作用，例如，通過分度濾波器的作用，檢測子光束71從檢測子光束51形成。對應(yīng)地，對于其它檢測子光束52、53、54和72、73、74，同樣如此。檢測單元具有用于檢測不同檢測子光束71、72、73、74中的檢測光的單獨的檢測器d1、d2、d3、d4。

具體地，由檢測器d1檢測檢測子光束71中的檢測光。對應(yīng)地，用單獨的檢測器d2、d3或d4檢測檢測子光束72、73、74中的檢測光。單獨的檢測器d1將檢測到的檢測光作為輸出信號發(fā)送到控制和評價單元90。因此，單獨的檢測器d2、d3和d4向控制和評價單元90供應(yīng)輸出信號82、83和84?？刂坪驮u價單元90評價檢測單元，具體地，進而單獨的檢測器d1、d2、d3、d4檢測到的檢測光。一般使用計算機作為控制和評價單元90。

因此，在根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備和根據(jù)本發(fā)明的方法中，用其中在原理上已經(jīng)可以單獨地設(shè)定每個光斑的光譜組成的布置，因此執(zhí)行對應(yīng)的光譜選擇性檢測。由此，如果所描述的光譜檢測，換句話講，進而可控光譜選擇裝置61、62、63、64由濾波器，例如，分度濾波器構(gòu)成，則可能是特別有利的。例如，在de102006034908a1中描述了這種類型的光譜濾波器?；跒V波器的布置提供了光譜檢測的成本有利且有效的可能。

另外，基于濾波器的布置允許以高光學(xué)質(zhì)量進行點擴散函數(shù)(psf)的掃描測量。這可用于諸如例如通過虛擬針孔(為此，參見：handbookofbiologicalconfocalmicroscopy,j.b.pawley,3^rdrevisededition2010)或點擴散函數(shù)的空間分辨測量來增大檢測效率和光學(xué)分辨率的方法。在原理上，還存在色散布置，從而基于提供類似效果的依賴波長的衍射或折射進行工作。這些還可以被設(shè)計成，使得確保檢測psf被保持。與基于濾波器的示例性實施例類似地，可以實現(xiàn)與空間光譜選擇照射結(jié)合的有利使用。

另一方面，這些濾波器的效率由于它們的復(fù)雜結(jié)構(gòu)而一直受到限制。換句話講，如果這多個濾波器被布置成一個接著另一個，則是低效的。然而，用一個接著另一個布置的兩個分度濾波器而有意義且有光效率地分束到三個不同波長帶上仍然是有意義的且可行度高。同一光束，進而同一檢測子光束上的其它濾波器將使檢測單元的關(guān)聯(lián)輸出愈發(fā)低效。這與要用現(xiàn)今的激光顯微鏡測量的范圍愈發(fā)寬廣的熒光染料形成對照。要以高精度快速且在空間上實現(xiàn)測量。特別地，期望只在單次掃描中同時實現(xiàn)測量。在許多情況下，要能測量超過三個光譜通道。

該優(yōu)點基于用染料標記的不同結(jié)構(gòu)的信號沒有串?dāng)_的事實。然而，待檢驗的樣本的移動會導(dǎo)致例如共同位置測量中的偽影。

當(dāng)測量多個波長時，因此有兩個問題要克服：第一，要實現(xiàn)對所有波長的有效光譜檢測；第二，在檢測中盡可能避免通過樣本中的交叉激發(fā)而發(fā)生的光譜串?dāng)_或光譜分配不當(dāng)。

為此，根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備和根據(jù)本發(fā)明的方法帶來了本質(zhì)改進。根據(jù)本發(fā)明，存在可控光束操縱裝置21、22、23、24，用可控光束操縱裝置21、22、23、24，可以將每個照射子光束的光譜組成(對于本發(fā)明而言，將被理解為相應(yīng)強度)相對于其它照射子光束單獨地且獨立地設(shè)定，可以將每個照射子光束的光譜組成與光譜選擇性檢測結(jié)合，以形成非常有效且對光譜敏感的顯微鏡。

這是通過對于顯微鏡的相應(yīng)測量任務(wù)經(jīng)由波長選擇器最佳設(shè)定檢測和激發(fā)來實現(xiàn)的?？梢詤^(qū)分不同的成像模式，從而以最佳配置來解決以上提到的問題。

對于本說明書，全體構(gòu)件：光源10、分束設(shè)備16以及由控制和評價單元90經(jīng)由連接件25進行控制的可控光束操縱裝置20，也被稱為空間波長選擇器，或者，簡稱為選擇器。

以下，將描述根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備和根據(jù)本發(fā)明的方法的應(yīng)用，其中，使記錄速度最大化和/或待檢驗的樣本將受到的光損傷最小化。為此，選擇器提供了n個光束，其中，n(可以由2ⁿ構(gòu)成，其中，n是整數(shù))是特別有利但不是必要的?？煽毓庾V選擇裝置，特別地，可以是濾波器，因此還可以被描述為檢測濾波器，被設(shè)定在該激發(fā)設(shè)定中，使得它們均具有相同的光譜特征。以下，將結(jié)合圖2對此進行更詳細的說明，其中，出于簡化的原因，在布置中并沒有示出所有光束。

圖2示出圖1中的檢測光路中的切口，其中，示出了可控光譜選擇裝置的特定示例性實施例。在圖2中，檢測子光束51、52、53、54從左邊進入，而受可控光譜選擇裝置影響的檢測子光束71、72、73、74在檢測單元的方向上離開到右側(cè)。對于所有四個檢測子光束51、52、53、54，可控光譜選擇裝置分別由一對分度濾波器形成。在檢測子光束51的情況下，這是一對分度濾波器611和613。因此，帶有附圖標記621和623、631和633以及相應(yīng)地641和643的成對分度濾波器屬于檢測子光束52、53、54。分度濾波器均可在與這些檢測子光束大體平行的方向上被相對于檢測子光束51、52、53、54進行機械調(diào)節(jié)。在圖2中用雙箭頭612、614、622、624、632、634、642、644示出該機械自由度。

分度濾波器611、621、631、641按以下這種方式進行工作：波長小于閾值波長的光被反射，而另一方面，波長大于閾值波長的光被透射?？梢酝ㄟ^分別在雙箭頭所指示的方向上機械調(diào)節(jié)分度濾波器來設(shè)定閾值波長。對于圖2中示出的情形，參照檢測子光束54對此進行更詳細的說明。從圖2中的左邊進入的檢測子光束54具有特定光譜組成，該特定光譜組成基本上取決于照射光路中的關(guān)聯(lián)的且在前的照射子光束11、31的光譜組成和待檢驗的樣本40的性質(zhì)。特別地，檢測子光束54的光譜組成包含關(guān)于關(guān)聯(lián)光斑44碰到的樣本體積中包含的熒光染料的特定信息。檢測子光束54碰到被設(shè)定成特定閾值波長的分度濾波器641。被該分度濾波器641反射回的光541只包含波長比設(shè)定的閾值波長小的輻射部分。被分度濾波器641透射的檢測子光束54的部分542基本上只包含波長比對于分度濾波器641設(shè)定的閾值波長大的輻射部分。

已經(jīng)穿過分度濾波器641的輻射部分542隨后碰到的其它分度濾波器643具有相反的性質(zhì)。波長比對于分度濾波器643設(shè)定的閾值波長大的入射部分被反射，而波長比對于分度濾波器643設(shè)定的閾值波長小的輻射部分被允許通過。向著右邊離開的檢測子光束74因此只包含波長比分度濾波器641的閾值波長大且比分度濾波器643的閾值波長小的輻射部分。被分度濾波器643輻射回的輻射部分543只包含既比分度濾波器641的第一閾值波長大又比分度濾波器643的閾值波長大的波長。

通過組合分度濾波器641和643，得到只允許其波長在分度濾波器641的閾值波長和分度濾波器643的閾值波長之間的輻射部分通過的帶通濾波器。為了可以完全透射該輻射，使分度濾波器643的閾值波長大于分度濾波器641的閾值波長是絕對有必要的。因此，在輸出541、543和74中有三個可檢測波長帶，其中，可以在541中檢測波長比分度濾波器641的閾值頻率短的部分，在543中檢測波長比641和643的閾值波長大的部分，并且在74中檢測波長在兩個閾值波長之間的部分。光因此穿過長通，然后穿過短通。然而，通道的順序還可以包含短通—長通組合。

檢測子光束51、71中的分度濾波器611和613、檢測子光束52、72中的分度濾波器621、623和檢測子光束53、73中的分度濾波器631、633以與檢測子光束54、74中的分度濾波器641和643相同的方式進行工作。然而，對于檢測子光束51、71…53、73，沒有單獨地示出分別被分度濾波器反射回的輻射部分，這是出于簡明的原因。在原理上，一方面分度濾波器611、621、631和641可以分別是不同的分度濾波器，并且另一方面分度濾波器613、623、633和643可以分別是不同的分度濾波器。然而，特別優(yōu)選地，分別使用相同的分度濾波器。

在圖2中示出的情形下，一方面在檢測光路上的第一分度濾波器611、621、631和641的閾值波長分別相同，并且另一方面在檢測光路上的后續(xù)分度濾波器613、623、633和643的閾值波長分別相同。這意味著，通過成對的濾波器611和613、621和623、631和633以及641和643來提供相同的帶通濾波器?？梢允褂迷撆渲靡圆⑿心Ｊ綄颖具M行掃描。每個光斑，也可以被描述為掃描斑測量僅樣本的一部分。例如，豎直地一個位于另一個下方的四個光斑可以在待檢驗的樣本上方從左到右地引導(dǎo)，并且在掃描了第一區(qū)域之后，可以設(shè)定掃描儀，使得四個光斑以相當(dāng)大的跳躍跳到待掃描的下一個區(qū)域。這被稱為毛巾式掃描(handtuch掃描)。

清楚的是，在給定像素停留時間的情況下，掃描特定樣本區(qū)域的時間以與光斑或掃描斑的數(shù)目對應(yīng)的倍數(shù)減少。在所示出的示例中，該時間因此減少至四分之一倍。圖2中示出的配置還可以用于其它模式，以實現(xiàn)提高的信噪比。為此，每個光斑由此通過與剛描述的變型偏離，掠過樣本中待使用的整個像場。因此，如果使用四個照射子光束，則將樣本上的每個點掃描四次。相比于其中只在樣本上方使單個光斑進行光柵掃描或掃描的掃描顯微，假定存在不飽和或漂白效應(yīng)，實現(xiàn)信號因此增大至與所使用光斑的數(shù)目對應(yīng)的倍數(shù)，在所提到的示例中因此增大至四倍。在此之后，對以此方式得到的圖像求平均，并且在信噪比提高至倍的情況下展示平均化圖像。這樣的前提是，染料的光發(fā)射必須還未飽和。如果用非?？焖賿呙璧南到y(tǒng)，例如，用諧振掃描儀對樣本進行光柵掃描，則該成像模式是特別受關(guān)注的，但不是排他性的。

諧振掃描系統(tǒng)中的重要變量是像素停留時間，進而光斑停留或保持在特定樣本區(qū)域或樣本體積上的時間。這通常是標準設(shè)定，例如，512×512個像素和在8khz或更高諧振頻率下，明顯低于100ns下操作的諧振掃描儀。

在(大像場中也可以進行的)諧振系統(tǒng)快速成像的情況下，平均化模式此時可造成像素停留時間被有效延長至n倍，因此還實現(xiàn)了高達倍的信噪比。然而，snr的精確增益因子可以偏離因為它還取決于所使用的染料和激光功率。特別地，在染料飽和的情況下，通過增大激光功率，可以將信號略微增大，但樣本愈發(fā)受損。另外，像素時間非常短的圖像動態(tài)因樣本在該時間內(nèi)仍然只能夠發(fā)射少量光子而受到限制。因為平均化模式使有效像素時間增加，所以圖像中的動態(tài)同時增加。這種模式因此具有與快速掃描，特別地，諧振掃描系統(tǒng)結(jié)合的另外的大優(yōu)點。

將參照圖3來描述結(jié)合圖2說明的分度濾波器的布置的其它示例應(yīng)用。這里示出的分度濾波器的布置在原理上與圖2中的相同。差異在于對單獨的分度濾波器進行的閾值波長的相應(yīng)設(shè)定。通過與其中一方面在光路上的第一分度濾波器611、621、631和641的閾值波長和另一方面在光路上的后續(xù)分度濾波器613、623、633和643的閾值波長相同的圖2中示出的配置(帶來的結(jié)果是，對于所有四個檢測子光束51、52、53、54設(shè)置相同的帶通濾波器)偏離，對于所有分度濾波器，圖3中示出的配置中的閾值波長的設(shè)定是不同的。然而，一般，在任何情況下有用地設(shè)定閾值波長，使得設(shè)置具有最終寬度的帶通濾波器。這意味著，分度濾波器613的閾值波長大于分度濾波器611的閾值波長。對應(yīng)地，對于成對的分度濾波器621和623、631和633以及641和643，同樣如此。然而，一般，被分別設(shè)置的帶通濾波器覆蓋的波長間隔是不同的。

具體地，取決于在光路中在先的關(guān)聯(lián)照射子光束31的光譜組成，換句話講，進而取決于碰到作為對應(yīng)檢測子光束51來源的光斑41的照射光的光譜組成，來實現(xiàn)檢測子光束41的分度濾波器611和613的設(shè)定。對應(yīng)地，對于其它檢測子光束52、53和54，同樣如此。這意味著，如果保持用第一檢測子光束51的示例，則通過相對于彼此進行調(diào)諧來一方面實現(xiàn)可控光束操縱裝置21，特別優(yōu)選地，進而多通道aotf的通道的控制，并且另一方面實現(xiàn)可控光譜選擇裝置，例如，進而分度濾波器611和613的控制。

由此，控制和評價單元可以有利地被設(shè)計成一方面用于特定照射子光束中的光束操縱裝置的相互調(diào)諧控制，并且另一方面用于來自樣本上的特定照射子光束生成的光斑的該檢測子光束中的光譜選擇裝置的相互調(diào)諧控制。特別優(yōu)選地，按目標明確地在樣本上或樣本中激發(fā)特定熒光染料并且檢測其熒光發(fā)射這樣的方式來控制光束操縱裝置21和光譜選擇裝置611、613。

因此，在本發(fā)明中，可以有利地實現(xiàn)測量方法中的照射，進而激發(fā)，和檢測的組合，使得在可控光束操縱裝置的輔助下，對于n個照射子光束中的每一個設(shè)定所限定的光譜特征。取決于此并且與此對應(yīng)，可以設(shè)定控制光譜選擇裝置，特別地，進而由圖2和圖3的分度濾波器全體形成的濾波器單元，使得可以在每個照射和檢測通道中實現(xiàn)對于光譜激發(fā)特征而言最佳的檢測。

可以實現(xiàn)這種模式，也可以被稱為光譜模式下的圖像形成，因為不同的光譜圖像部分被記錄在樣本中的部分不同位置并且合并，即，合到一起以形成光譜圖像。然后，可以在計算機屏幕上例如以錯誤顏色展示來顯示該圖像。為此，錯誤顏色展示被理解為是用分別不同的顏色來示出特定熒光染料所發(fā)射的光，但是其波長不一定對應(yīng)于分別觀察到的染料實際所發(fā)射的輻射。為了合并從單獨的檢測子光束形成的相應(yīng)子圖像，可能必須執(zhí)行合適的坐標移位，因為同一掃描儀設(shè)定中的光斑41、42、43、44位于不同的樣本位置。

在并行模式下，用n個照射子光束，檢測子光束中的每一個提供了包含(如果在掃描時進行逐行掃描并且進一步跳n行，則)分別只用于每個第n條線的圖像數(shù)據(jù)的子圖像。這些單獨的子像素可以被合到一起，形成整體圖像。整體圖像中的強度對比度對應(yīng)于在樣本的單獨的點處測量的強度。以與光譜模式下相同的方式，為了合并從單獨的檢測子光束產(chǎn)生的相應(yīng)子圖像，將必須執(zhí)行合適的坐標移位，因為光斑41、42、43、44位于同一掃描儀設(shè)定中的不同樣本位置。

最簡單地說，提供了平均化模式下的整體圖像產(chǎn)生，其中，對于樣本不同點的單獨的檢測子光束測得的強度被分別相加。顯然，這里還必須確保，正確強度，進而實際屬于同一樣本點的強度被相加。這意味著，在平均化模式下，同樣地，必須執(zhí)行合適的坐標移位，因為用同一掃描儀設(shè)定，光斑41、42、43、44位于不同的樣本位置。如并行模式下一樣，平均化模式下的整體圖像中的強度對比度對應(yīng)于分別在樣本的單獨的點處測量的強度。

在原理上，為了在照射子光束中的每一個中進行激發(fā)，可以同時存在多種顏色。例如，在具有空間雙分離的三通道檢測的情況下，因此可以測量并使用六個光譜通道。如果每個光斑或掃描斑形成不同顏色特征，則可以在四倍空間激發(fā)和三通道檢測的情況下，擴展12光譜通道。一般，可以在用m個檢測通道進行n倍空間光譜激發(fā)的情況下，將n×m個構(gòu)件分離。一般，在根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備和根據(jù)本發(fā)明的方法中，可以根據(jù)需要將n個激發(fā)通道分離成空間和光譜通道。

通過本發(fā)明，因此指示如下光學(xué)布置，用該光學(xué)布置可以進行相對于測量任務(wù)和待測量樣本被優(yōu)化的顯微鏡圖像記錄。另外，可以控制根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備，使得它對應(yīng)于用戶指令進行自身優(yōu)化。這意味著，用戶所定義的測量任務(wù)被翻譯成光學(xué)布置的最佳設(shè)定，換句話講，因此被翻譯成一方面可控光束操縱裝置的最佳設(shè)置和另一方面可控光譜選擇裝置的最佳設(shè)置。使用算法，用于測量特定樣本的優(yōu)化策略隨后可以在硬件構(gòu)件中被發(fā)現(xiàn)和設(shè)定。

與圖4關(guān)聯(lián)地，描述多通道aotf，諸如，可以將其用作根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備中的可控光束操縱裝置20。圖4示意性示出了原理上由均質(zhì)晶體，例如teo2組成的這種多通道aotf20。通過虛線指示該晶體總共被分離成四個空間區(qū)域，即，四個空間通道，通過這些空間區(qū)域，分別形成一個可控光束操縱裝置21、22、23、24，可控光束操縱裝置21、22、23、24在原理上功能地構(gòu)成單獨的aotf。為了控制這些單獨的通道，進而單獨的aotf21、22、23、24，分別以圖4中示意性示出的方式，在這些aotf處分別布置換能器211、221、231和241。換能器是與相應(yīng)aotf21、22、23、24結(jié)合并且用其將實現(xiàn)期望光學(xué)性質(zhì)所必需的聲波引入晶體中的壓電晶體。在圖4中，用圓形212、222、232和242示意性示出用于控制單獨的換能器211、221、231和241的信號。該原理可以被完全轉(zhuǎn)移到任何數(shù)量的n個通道。

也被描述為陣列的換能器的二位布置在原理上也是可能的，這里說明的原理也可以被轉(zhuǎn)移到它們。出于簡明的原因，以簡化方式示出換能器它們自身之間的相互作用。在圖4中示出的示例中，認為aotf22被來自下方的照射子光束12碰到。通過由換能器221在aotf22中生成的聲波的作用，照射子光束12中的光的部分被偏轉(zhuǎn)成照射子光束32，更具體地：它被衍射。另外，存在在沒有衍射的情況下穿過aotf22的輻射部分19。出于以下考慮的重要因素不僅在于經(jīng)由換能器221施加的控制信號222對于aotf22的透射性質(zhì)是重要的，而且在于用于分別控制aotf21、23和24的換能器211、231和241的控制信號212、232和242是重要的。對其它aotf21、23、24的控制因此還影響在aotf22中產(chǎn)生的衍射光柵。在圖4中用箭頭201、202和203示意性示出這些相互作用。

假定出于以下考慮，用相等頻率的正弦信號來控制所有換能器211、221、231和241，其中，f(λ)是激光的波長λ要求的相應(yīng)aotf21、22、23、24的激發(fā)頻率。根據(jù)本發(fā)明，信號發(fā)生器它們自身之間同步，并且可以對于信號發(fā)生器212、222、232和242中的每一個來分別地設(shè)定起始相位θ(n)。正弦載波頻率的幅度另外受調(diào)制函數(shù)mn(t)的影響。取決于應(yīng)用，換能器211、221、231和241的調(diào)制函數(shù)mn(t)可以不同或相同。然后，可以如下地描述換能器處的時間信號：

sn(t)＝mn(t)×sin(2πfλt+θn)。

如果具有不同波長λn的相應(yīng)m個激光線的多個束要受聲光元件20的影響，則通過m個信號sn(t)的疊加/求和，得到第n個通道的結(jié)果控制信號。換能器之間的串?dāng)_導(dǎo)致例如屬于aotf22的通道中的被衍射激光的強度不僅受控制信號222影響，而且受多通道聲光元件20的其它換能器211、231、241處的控制信號影響。

影響程度尤其取決于不同通道之間的電絕緣、光學(xué)通道彼此的距離和換能器的特定幾何形狀。取決于設(shè)計，通道之間的光學(xué)絕緣達到大約30db的值，其中，因通道之間電絕緣的缺陷，造成串?dāng)_的主要部分。尤其是，如果換能器211、221、231和241在空間上彼此靠近，則這樣會存在問題。然而，這恰好是重要應(yīng)用，如例如用于多通道激光掃描顯微鏡時存在的。待操縱或影響的光束彼此間的距離要盡可能短，以保持此可接受范圍內(nèi)的對光學(xué)系統(tǒng)的要求。因此，期望緊密相鄰的換能器。然而，這些換能器必定不能如同期望的那樣絕緣。

如果選擇兩個相鄰?fù)ǖ赖目刂菩盘?212、222、232、242)的起始相位的差異使得它是90°+k×180°，其中，k是整數(shù)，則這些通道的控制信號相對于彼此正交。對于通道的相互影響，可以按這種方式來實現(xiàn)最小值。本發(fā)明因此認識到，在多通道聲光元件，諸如例如多通道aotf或多通道aom的情況下的換能器控制被相位剛性地(phase-rigidly)實現(xiàn)是特別有利的。同時，這意味著，待透射的每個波長λ的所有通道的換能器處的控制信號必須具有精確相同的激發(fā)頻率fλ。如果不是這樣，則由于多通道聲光元件的通道之間的相互作用，導(dǎo)致引起激光的強度波動，其中，強度波動的頻率對應(yīng)于控制信號的差分頻率。

本發(fā)明因此涉及用于多點掃描顯微的新型裝置和新型方法。根據(jù)本發(fā)明的解決方案要求平行照射。該照射必須在每個照射通道中，至少在子數(shù)量通道中能以上述意義進行切換，即，特別地，能相對于該通道中的輻射的強度和波長進行切換。如上所述的波導(dǎo)芯片由此可以是有利的。分束也可以有其它可能性。

在沒有光譜分離/分束的情況下，可以以根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)的最簡單配置實現(xiàn)檢測。在n個空間光譜通道的情況下，可以通過以光譜激發(fā)特征進行空間劃分來精確測量n個光譜通道。另一方面，還可以并行使用n個空間通道，以更快速地記錄圖像或者以給定幀速率來利用圖像中提高的信噪比。這里，幀速率將被理解為是每個時間單元記錄的顯微圖像的數(shù)量。

用根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備和根據(jù)本發(fā)明的方法，提供了用于樣本的最佳圖像記錄的可靈活調(diào)節(jié)的光學(xué)布置，其中，可以相對于空間和光譜測量通道進行優(yōu)化。還可以相對于樣本損傷和記錄時間來設(shè)定并實現(xiàn)最佳值。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，還可以通過相對于空間和光譜測量通道并且還相對于時間分辨率和樣本損傷減少進行自優(yōu)化對樣本進行顯微鏡測量。

在特別有利的實施例中，用光學(xué)波導(dǎo)多色地生成空間光分布?？梢杂梅侄卧?，例如，用多通道aotf來單獨地調(diào)制空間光分布?？梢詫τ诿總€光束，單獨地設(shè)定空間光分布的光譜特征。例如，用所有子光束的相同光譜特征，還可以設(shè)定所限定的但分別不同的亮度。因此，可以在圖像中記錄更多的動態(tài)。根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備和根據(jù)本發(fā)明的方法還可以用于光束它們自身在時間上的影響。特別地，在上述平均化方法中，子光束的亮度可以取決于其它相應(yīng)子光束的信號來調(diào)節(jié)。由此，繼而可以增加圖像動態(tài)并且有可能減少光損傷。

另外，還可以靈活地，特別地對應(yīng)于激發(fā)并且關(guān)于待解決的測量任務(wù)與其一起設(shè)定檢測。最終，可以選擇光束路徑中的構(gòu)件，使得點擴散函數(shù)得以保持。為此，特別地，濾波器陣列優(yōu)選地用于檢測光路中，使用利用該檢測光路進行的點擴散函數(shù)的空間掃描來增大信噪比并且增大分辨率。還已知關(guān)鍵詞是“光子再分配”的這些方法或airyscan方法。