專利名稱：抑制自然殺傷細(xì)胞活性的強(qiáng)啡肽a的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種通過(guò)服用相應(yīng)于強(qiáng)啡肽或強(qiáng)啡肽類似物的氨基酸順序的多肽調(diào)節(jié)個(gè)體免疫系統(tǒng)的方法。這種服用的作用是抑制免疫系統(tǒng)天然殺傷(NK)細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性。
免疫系統(tǒng)的總活性取決于對(duì)免疫應(yīng)答作出貢獻(xiàn)的各個(gè)組分細(xì)胞的活性。
一類免疫細(xì)胞，天然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)，能攻擊和殺傷諸如腫瘤細(xì)胞和感染病毒的正常細(xì)胞之類的細(xì)胞，NK細(xì)胞在身體排斥外來(lái)組織方面起很大的作用，并且與骨髓移植體受體中宿主疾病相比，在與移植相關(guān)的損傷方面，NK細(xì)胞也是重要的一類細(xì)胞。在這種一類疾病中，來(lái)自移植骨髓的NK細(xì)胞被活化并攻擊正常的宿主細(xì)胞。
NK細(xì)胞是大顆粒淋巴細(xì)胞的正常群體，這種大顆粒淋巴細(xì)胞約為淋巴細(xì)胞總數(shù)的5%。NK細(xì)胞可見(jiàn)于血液、淋巴組織包括，并且是由骨髓衍生的淋巴細(xì)胞子集。NK細(xì)胞還以枯否氏細(xì)胞存在于肝中和胃腸道的派伊爾結(jié)中。因?yàn)镹K細(xì)胞是可遷移的，所以還可以見(jiàn)于其他組織中。
對(duì)于特定的病毒抗原決定子來(lái)說(shuō)，NK細(xì)胞殺傷細(xì)胞不是專一的，并且不受MHC分子的限制。要作術(shù)語(yǔ)“冷靶抑制”描述該現(xiàn)象，從而一類NK靶細(xì)胞同時(shí)有效細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)而可以抑制溶解不同類型的NK細(xì)胞。
對(duì)免疫系統(tǒng)的類鴉片作用近來(lái)引起幾位研究人員的注意。開(kāi)始，這種注意是基于下述觀察結(jié)果海洛因?yàn)E用者患有各種致免疫異常，如擴(kuò)散的淋巴結(jié)病(Helperm和Rho，N.Y.StateJ.Med.66:2391-2408，1966)、高血清免疫球蛋白(Cushman&Grrieco，Am.J.Med.54∶320-326，1973;Kreek等人，Ann.Intern.Med.77∶598-602，1972)，淋巴細(xì)胞增多癥(Kreek，J.Am.Med，Assoc.223∶665-668，1973)，在短期培養(yǎng)時(shí)淋巴細(xì)胞對(duì)有絲分裂原應(yīng)答降低(Brown等人，Arch.Intern.Med.134∶1001-1006，1974)和生成異常的T細(xì)胞玫瑰花結(jié)。
最近，Novick等人報(bào)導(dǎo)過(guò)，與健康的個(gè)體和曾維持使用美沙酮并在至少十年內(nèi)未濫用過(guò)藥物的個(gè)體相比，短效鴉片制劑海洛軒非腸胃濫用者中，大大降低了NK細(xì)胞的活性。美沙酮是長(zhǎng)效鴉片制劑興奮劑，它與海洛因(一種強(qiáng)的短效鴉片制劑興奮劑)有交叉耐受性。Novick等人，J.Pharm.Expt.Ther.，250∶606-610，1989。
有關(guān)類鴉片對(duì)NK細(xì)胞活性影響的試驗(yàn)結(jié)果是矛盾的。已報(bào)道長(zhǎng)期穩(wěn)定使用美沙酮的病人中NK活性的改善，盡管類鴉片對(duì)細(xì)胞免疫的某些指標(biāo)可能有直接的影響。Novick等人，J.Pharm.Expt.Ther.，250∶606-610，1989;Kreak等人，NIDAResearchMonographSeries，96∶192-219，1990;Ochshorn等人，Isr.J.MedSci.，26∶421∶425，1990。曾通過(guò)體外研究評(píng)價(jià)過(guò)類鴉片對(duì)NK活性的直接影響。幾組研究人員曾指示，內(nèi)源類鴉片β-內(nèi)啡肽提高體外NK細(xì)胞活性，并且可由納絡(luò)酮，一種專門的類鴉片拮抗物，將這種作用反轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)(Kay等人，LifeSci，35∶53-59，1984;Mandler等人，J.Immunol，136∶934-939，1986;Mathews等人，J.Immunol，130∶1658-1662，1983)。Met-腦啡肽，另一種類鴉片肽，也似乎能提高NK活性(Faith等人，Immunopathol，31∶412-418，1984;Mathews等人，J.Immunol，130∶1658-1662，1983:Wybran，F(xiàn)ed.Proc.44∶92-94，1985)，然而曾報(bào)道過(guò)Leu-腦啡肽(Faith等人，Immunopathol，31∶412-418，1984;Mathews等人，J.Immunol，130∶1658-1662，1983;Wybran，F(xiàn)ed.Proc.44∶92-94，1985)，α-內(nèi)啡肽(Kay等人，LifeSci，35∶53-59，1984;Mandler等人，J.Immunol，136∶934-939，1986)和γ-內(nèi)啡肽(Kay等人，LifeSci，35∶53-59，1984;Mandler等人，J.Immunol，136∶934-939，1986)的相互矛盾的結(jié)果。Met-和Leu-腦啡肽兩者都是與類鴉片受體興奮劑。Laidow等人，J.Biol.Chem.，255∶11908(1980)報(bào)道有關(guān)外源類鴉片對(duì)體外NK活性影響的研究工作更少。在一篇研究報(bào)告(Wybran，F(xiàn)ed.Proc.44∶92-94，1985)中報(bào)道嗎啡能提高NK活性，而在另外兩篇研究報(bào)告中則不能提高NK活性(Kay等人，LifeSci，35∶53-59，1984;Mandler等人，J.Immunol，130∶1658-1662，1983)。
僅僅當(dāng)美沙酮的濃度比任何臨床使用美沙酮的濃度高許多數(shù)量級(jí)，或與生命相適應(yīng)時(shí)，才能離體觀察到正常受治療者和保持服用美沙酮的病人的細(xì)胞NK活性的抑制作用，Kreek，Ann.N.Y.AcadSci，311∶110-134，1988;Ochshorn等人，Isr.J.Med.Sci，26∶421-425，1990。
強(qiáng)啡肽是一組與腦和脊髓中類鴉片受體高親合性結(jié)合的肽。盡管強(qiáng)啡肽在腦中似乎不止痛，但它們可在脊髓中止痛。強(qiáng)啡肽A(1-17)和它們的13個(gè)氨基酸片段強(qiáng)啡肽A(1-13)是它分離的第一類強(qiáng)啡肽(Goldstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA76∶6666-6670，1979)，并且表征很好。
US4462941所指的強(qiáng)啡肽類似物具有至少10個(gè)氨基酸，但少于13個(gè)氨基酸，報(bào)導(dǎo)的這種類似物能使宿主耐受麻醉止痛效果增強(qiáng)。
US4481991涉及強(qiáng)啡肽或強(qiáng)啡肽類似物，以及它們?cè)谥委煾哐獕夯蛐呐K功能障礙方面的應(yīng)用。
US4537878、4757049、4801614涉及采用各種類鴉片興奮劑調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的方法。具體地，US4537878報(bào)道了，在服用蛋氨酸腦啡肽及個(gè)體中NK活性升高和降低。報(bào)道服用腦啡肽和相關(guān)的組合物，通過(guò)刺激T和NK細(xì)胞群體都具有調(diào)節(jié)病毒、細(xì)菌、真菌、腫瘤細(xì)胞和寄生蟲(chóng)，以及通常與老化相關(guān)的所有免疫缺陷的活性。然而，這些專利沒(méi)有指出或沒(méi)有提出蛋氨酸腦啡肽或它的確定等效物增加或降低NK活性的結(jié)構(gòu)關(guān)系。
以WO92/02507公開(kāi)的PCT申請(qǐng)PCT/US91/05518涉及通過(guò)服用不同量的酸或酰胺形式的強(qiáng)啡肽來(lái)刺激或抑制病人免疫系統(tǒng)的方法。報(bào)道采用強(qiáng)啡肽的酸或酰胺化形式刺激免疫系統(tǒng)。然而，據(jù)報(bào)道只有酸形式才通過(guò)刺激和抑制其免疫而具有雙相作用，據(jù)報(bào)道強(qiáng)啡肽酰胺化形式不具有雙相作用，只觀察到免疫刺激作用。
許多免疫功能直接受NK細(xì)胞影響。具體地，NK細(xì)胞對(duì)病毒感染的細(xì)胞是第一道防御。NK細(xì)胞的這種活性變得復(fù)雜，并且可能降低基因治療的效果，基因治療是用病毒載體將遺傳物質(zhì)引入個(gè)體。令人驚奇的是，評(píng)價(jià)基因治療中NK活性作用的研究工作物報(bào)道幾乎沒(méi)有。
盡管涉及不同類型病毒載體的各種系統(tǒng)可能是具有新遺傳順序的靶細(xì)胞的有效工具，但是幾種因素降低了這些載體在提供基因治療時(shí)的效果。例如反轉(zhuǎn)錄病毒載體隨機(jī)結(jié)合到細(xì)胞基因組中，因此可能打斷正在進(jìn)行的蛋白質(zhì)合成，或者以通過(guò)防止已結(jié)合的DNA順序起作用的方式被插入。反轉(zhuǎn)錄病毒也可結(jié)合到其他反轉(zhuǎn)錄病毒中，因此破壞了兩種反轉(zhuǎn)錄病毒的已結(jié)合的DNA。這種特性造成所要求合成的最終產(chǎn)物水平較低。另外，許多細(xì)胞型沒(méi)有充分與轉(zhuǎn)導(dǎo)期間常使用的延長(zhǎng)的體外培養(yǎng)基反應(yīng)。要繼續(xù)保持和完成其所要求的功能，原始培養(yǎng)物少到25%也不是不常見(jiàn)的。因此，一旦將該載體施用到需要基因治療的那些個(gè)體時(shí)，實(shí)際上表達(dá)的載體-DNA的量應(yīng)該能防止任何其他類型也許會(huì)降低或沒(méi)有效果的侵襲。
對(duì)于進(jìn)行基因治療的個(gè)體來(lái)說(shuō)，NK細(xì)胞存在很大的問(wèn)題，典型地，任何水平的病毒感染的作用部分是活化免疫系統(tǒng)，尤其是NK細(xì)胞，試圖使身體去掉感染的病毒。由于NK細(xì)胞對(duì)特定的抗原決定子是不專一的，并且為活化不需要在先接觸，除了破壞由載體-DNA順序轉(zhuǎn)導(dǎo)的任何細(xì)胞外，對(duì)于該免疫系統(tǒng)來(lái)主，有可能錯(cuò)將被病毒感染的“自身”分子或者已發(fā)生腫瘤樣變化的分子當(dāng)作外來(lái)分子。如果感染病毒是一種含所需要的治療遺傳物質(zhì)的重組病毒并且感染的細(xì)胞是對(duì)于一些缺失可采用表達(dá)轉(zhuǎn)染遺傳物質(zhì)修改的那些細(xì)胞，這樣一種免疫應(yīng)答應(yīng)該不是人們所要求的。因此，由載體-NDA順序(其中包括但不限于反轉(zhuǎn)錄病毒、與腺相關(guān)的病毒、牛痘或單純性皰疹Ⅰ)所感染的全部細(xì)胞應(yīng)該是由NK細(xì)胞侵襲的可能靶。
本發(fā)明提供一種抑制哺乳動(dòng)物NK細(xì)胞毒性活性的方法。該方法包括給需要治療的個(gè)體使用強(qiáng)啡肽A，其肽具有下述結(jié)構(gòu)。
Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa15-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa1015其中1位選自于由酪氨酸、m-酪氨酸和多巴組成的組中。2、3、15、16和17位是中性氨基酸，它們選自于由甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和α-氨基異丁酸(AIB)組成的組中。在4位的氨基酸選自于由苯丙氨酸、酪氨酸、α-甲基苯基丙氨酸和其中苯環(huán)由對(duì)位-取代的斥電子基如鹵素或硝基取代的苯丙氨酸組成的組中。5和14位選自于非極性(疏水的)氨基酸組中，它們由異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸組成。
6、7和9位非常優(yōu)選的是精氨酸，但也可以是負(fù)電荷的氨基酸;它們選自由賴氨酸、組氨酸、高精氨酸或鳥(niǎo)氨酸組成的組中，然而9位還右以包括脯氨酸。
在8和12位的氨基酸選自于由酪氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和賴氨酸組成的堿性和中性氨基酸組中。10位是選自于由脯氨酸、硫代脯氨酸、3，4-去氫脯氨酸、4-羥基脯氨酸和哌可酸組成的組中的堿性氨基酸或脯氨酸類似物。最后在11和13位的氨基酸非常優(yōu)選的是賴氨酸，但還可以是選自于由組氨酸、高精氨酸或鳥(niǎo)氨酸組成的組中的負(fù)電荷氨基酸。
適宜于本發(fā)明方法使用的肽的氨基酸可以是d或l形成。
對(duì)降低NK活性適宜的強(qiáng)啡肽的羧基末端具有下式
式中aa是第n氨基酸的側(cè)鏈，n是強(qiáng)啡肽A多肽中的氨基酸總數(shù)。R1和R2可以是相同的或不同的，可以是氫、烷基或任意取代的苯甲基，或者如果R1和R2中的一個(gè)是含氮部分如酰肼，則另一個(gè)是氫。當(dāng)與提供基因治療聯(lián)系起來(lái)用于抑制NK活性時(shí)，強(qiáng)啡肽A肽也可終止于羧基。
共價(jià)連接強(qiáng)啡肽的氨基酸的肽鍵具有下列結(jié)構(gòu) 式中R3是氫或C1-4烷基，而烷基是直鏈或支鏈的。
按照該發(fā)明的方法，強(qiáng)啡肽A肽的用量應(yīng)足以減弱NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。優(yōu)選地，當(dāng)這種細(xì)胞與摩爾濃度為1×10-7至約1×10-2的強(qiáng)啡肽A多肽接觸時(shí)就可達(dá)到這一要求。
可以使用本發(fā)明方法治療哺乳動(dòng)物，尤其是人，從NK細(xì)胞活性降低中人應(yīng)該得到的好處。本發(fā)明方法尤其適用于治療其NK細(xì)胞已被活化的那些個(gè)體。本發(fā)明還特別適用治療按受移植組織的個(gè)體或預(yù)期成為移植組織受體的個(gè)體，移植組織如骨髓組織，肝、腎、心臟和肺。其他需要治療的個(gè)體可以包括患有自身免疫疾病的那些個(gè)體。
此外，本發(fā)明的方法對(duì)于治療需要基因治療的個(gè)體(其中包括用含有治療基因的病毒或類病毒載體感染這樣一種個(gè)體)是有用的。當(dāng)用來(lái)進(jìn)行基因治療時(shí)，為降低NK細(xì)胞活性所使用的強(qiáng)啡肽A肽羧酸末端可以如式(2)所述，或可以是羧基。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種抑制體內(nèi)和當(dāng)指出時(shí)離體NK細(xì)胞活性的方法。
另一個(gè)目的是提供一種降低移植受體中組織排斥的方法。
還有一個(gè)目的是提供一種治療患有各種自身免疫疾病個(gè)體的方法。
另一個(gè)目的是提供一種NK對(duì)受重組基因感染的細(xì)胞的活性的方法。


圖1圖示說(shuō)明由強(qiáng)啡肽A(1-17)抑制NK活性的劑量依賴性。
圖2圖示說(shuō)明由強(qiáng)啡肽A(1-10)酰胺抑制NK-活性的劑量關(guān)系。
圖3圖示說(shuō)明了強(qiáng)啡肽A(2-17)，[a];強(qiáng)啡肽A(1-13)，[b]，強(qiáng)啡肽A(1-10)，[c]不抑制NK活性的情況。
本發(fā)明提供了一種調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)組分活性的方法，意外地，根據(jù)本發(fā)明方法，通過(guò)給個(gè)體服用具有相應(yīng)于強(qiáng)啡肽A或強(qiáng)啡肽A類似物的氨基酸順序的多肽，可以使該個(gè)體NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性受到抑制。
天然存在的強(qiáng)啡肽A是17個(gè)氨基酸肽，它具有下式Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro1510Lys-Leu-Lys-Trp-Asp-Asn-Gln15
在本發(fā)明方法中適宜使用的強(qiáng)啡肽A肽及類似物，在其肽氨基酸末端具有氨基酸酪氨酸或酪氨酸類似物。此外，在適用于本發(fā)明中的肽的1位，這種氨基酸要求基于我們意外的發(fā)現(xiàn)，即強(qiáng)啡肽A(2-17)的濃度在約1μM以上時(shí)提高NK活性，而強(qiáng)啡肽A(1-17)的濃度為約0.1μM以上時(shí)降低NK活性，分別見(jiàn)圖3和1。
式Ⅰ的氨基酸可被各種氨基酸取代。1位的酪氨酸可由m-酪氨酸或二羥基苯丙氨酸(多巴)取代。優(yōu)選地，1位是酪氨酸。
2、3、15和16位的氨基酸優(yōu)選為甘氨酸，但可由其他中性氨基酸取代，其中包括但不限于絲氨酸、蘇氨酸。半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或α-氨基異丁酸(AIB)。
4位優(yōu)選為苯丙氨酸，但可以是α-烷基化苯丙氨酸，例如α-甲基苯丙氨酸，酪氨酸或其中苯環(huán)用諸如鹵素或硝基之類的對(duì)位取代的斥電基團(tuán)取代的苯丙氨酸。
5和14位最優(yōu)選的是亮氨酸，但可以用其他非極性(疏水的)氨基酸取代，其中包括但不限于異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。在5位更優(yōu)選的氨基酸是異亮氨酸、亮氨酸或纈氨酸。
6、7、9、11和13位最優(yōu)選的是精氨酸，但可以是其他負(fù)電荷氨基酸，如賴氨酸、組氨酸，高精氨酸或鳥(niǎo)氨酸，在9位的氨基酸也可以是脯氨酸。
8和12位最優(yōu)選的是異亮氨酸，但也可用堿性或中性氨基酸取代。優(yōu)選地，8位氨基酸是酪氨酸，亮氨酸、異亮氨酸或賴氨酸。
10位最優(yōu)選的是脯氨酸，但可以是另一種堿性氨基酸或脯氨酸類似物，如硫代脯氨酸，3，4-去氫脯氨酸，4-羥基脯氨酸或哌可酸。優(yōu)選地，10位氨基酸是脯氨酸或賴氨酸。
對(duì)于天然存在的那些強(qiáng)啡肽A可以被取代的氨基酸可以是d或l形成。
11到17位的氨基酸可除掉或取代，這取決于羧基末端的結(jié)構(gòu)，羧基末端可終止于羧基或選擇性取代的酰胺基。中止于羧基的強(qiáng)啡肽類似物的必需具有至少約14個(gè)氨基酸的鏈長(zhǎng)。優(yōu)選地，依據(jù)上面提出的原則進(jìn)行氨基酸11到17的取代，從而用中性氨基酸取代中性氨基酸，堿性氨基酸取代堿性氨基酸，酸性氨基酸取代酸性氨基酸。
優(yōu)選地，在本發(fā)明中適用的強(qiáng)啡肽和類似物的羧基末端具有下式 式中的aa是第n個(gè)氨基酸的側(cè)鏈，并且n是強(qiáng)啡肽多肽中氨基酸總數(shù);R1和R2是相同或不相同的，并且選自于氫、C1-4烷基、選擇性取代的苯甲基，或當(dāng)R1和R2中的一個(gè)是含氮部分，如酰肼時(shí)，則另一個(gè)是氫。更優(yōu)選地，R1和R2兩者都是生成酰胺的氫。
據(jù)認(rèn)為(不受理論束縛)，末端羧基的取代為的是保護(hù)氨基末端酪氨酸殘基不被降解。
意外地，強(qiáng)啡肽A肽的?；饔每蓪⒉痪哂蠳K抑制活性的肽轉(zhuǎn)化成抑制NK活性的肽。例如，我們發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)啡肽A(1-10)不具有任何抑制NK活性的作用，甚至濃度高達(dá)1mM也是如此，見(jiàn)圖3。然而強(qiáng)啡肽A(1-10)酰胺的濃度為約100μM以上時(shí)導(dǎo)致NK活性顯著降低，見(jiàn)圖2。當(dāng)然，使用經(jīng)過(guò)修飾以保護(hù)1位氨基酸殘基的其他強(qiáng)啡肽A類似物，在本發(fā)明方法中也是有用的。
當(dāng)用來(lái)提供基因治療時(shí)，式(2)的結(jié)構(gòu) 還可以是 這種， 結(jié)構(gòu)被羥基取代。
將本發(fā)明中可使用的強(qiáng)啡肽A和強(qiáng)啡類似物的氨基酸共價(jià)聯(lián)結(jié)起來(lái)的肽鍵具有如下結(jié)構(gòu)氨基酸 氨基酸 (3)式中R3選自于氫或C1-4烷基，其中烷基是直鏈或支鏈的。優(yōu)選地，R3是氫。
強(qiáng)啡肽類似抑制NK活性的能力也是該肽長(zhǎng)度的函數(shù)。例如，沒(méi)有酰胺化的酸型強(qiáng)啡肽A(1-10)和強(qiáng)啡肽A(1-13)不抑制NK活性，而強(qiáng)啡肽A(1-17)抑制NK活性。因?yàn)橛^察到強(qiáng)啡肽A(1-10)酰胺的NK抑制作用，所以NK抑制作用不需要強(qiáng)啡肽A(1-17)11至17位的氨基酸，并且若保持NK抑制活性不變，則可以取代或除掉11至17位氨基酸。因此，適宜于按照本發(fā)明抑制NK活性的酸型強(qiáng)啡肽A肽和類似物的鏈長(zhǎng)為至少14個(gè)氨基酸。優(yōu)選地，該鏈長(zhǎng)是17個(gè)氨基酸。不受理論的束縛，最短的鏈長(zhǎng)是，為保持羧基末端與氨基末端充分分開(kāi)以便防止因與1位酪氨酸殘基相互作用而損失活性所需要的鏈長(zhǎng)。
當(dāng)強(qiáng)啡肽A肽或類似物是酰胺型的時(shí)，最短的鏈長(zhǎng)是能保持NK抑制活性的鏈長(zhǎng)，優(yōu)選為10-17個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。
包括適用于本發(fā)明的天然存在的強(qiáng)啡肽A的各種強(qiáng)啡肽A類似物可活化鴉片制劑受體?；罨疜appa鴉片制劑受體是特別優(yōu)選的。強(qiáng)啡肽A或類似物與Kappa鴉片制劑受體結(jié)合可采用標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合試驗(yàn)測(cè)定，這對(duì)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)都是已知的。參見(jiàn)Chaukin，C.等人，Science215∶413(1982)和Jen，M.F.等人，Eur.J.Pharmacology91∶95-99，1983。
已知幾種強(qiáng)啡肽A類似物，并在該技術(shù)領(lǐng)域已有描述，例如，US4481191(引入本文作參考)描述了強(qiáng)啡肽A酰胺類似物，指出它們適用于治療心血管疾病。US4462941(也引入本文作參考)描述了強(qiáng)啡肽A酰胺類似物，它們?cè)鰪?qiáng)了麻醉劑的止痛效果。PCT/US91/05518申請(qǐng)(也引入本文作參考)也描述強(qiáng)啡肽A類似物，指出它們對(duì)刺激或抑制免疫系統(tǒng)都是有用的。任上面專利和申請(qǐng)中描述的各種強(qiáng)啡肽A肽和類似物，若它們都滿足上述標(biāo)準(zhǔn)的話，則在本發(fā)明方法中都是適用的。強(qiáng)啡肽A和強(qiáng)啡肽A類似物都可采用本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)肽合成方法進(jìn)行合成，這種合成方法如US4462941所描述，該專利引入本文作參考。
本發(fā)明的方法適宜于治療哺乳動(dòng)物，優(yōu)選為人，對(duì)于哺乳動(dòng)物和人來(lái)說(shuō)，抑制NK細(xì)胞活性應(yīng)該具有有益的效果。這些人的例子是作為各類組織(尤其是骨髓)的移植受體的那些人;如患有自身免疫疾病的個(gè)體一樣免疫活性升高的個(gè)體和接受或需要基因治療的個(gè)體。自身免疫疾病包括自免疫機(jī)能障礙和自身免疫紊亂。這類自身免疫疾病實(shí)例包括但不限于紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、溶血性貧血、青少年糖尿病、阿狄森病、甲狀腺毒癥、自身免疫萎縮性胃炎、原發(fā)性膽汁性肝硬變和多發(fā)性硬化。
在本發(fā)明的另一種具體方案中，將強(qiáng)啡肽A和強(qiáng)啡肽A類似物用于需要基因治療的那些個(gè)體。基因治療可通過(guò)將所需要的多肽的遺傳順序插入復(fù)制載體，然后將其載體/DNA順序插入需要治療個(gè)體的特定細(xì)胞中，在體內(nèi)或體外產(chǎn)生大量各種多肽。適于基因治療的疾病實(shí)例包括但不限于胱膀纖維變性、β-地中海貧血、鐮形細(xì)胞性貧血、肌肉營(yíng)養(yǎng)不良、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、糖尿病和各種類型的癌。適于基因治療的癌實(shí)例包括但不限于乳腺癌、結(jié)腸癌、加德納多發(fā)性息肉瘤、急性骨髓性白血病、多發(fā)性骨髓癌和惡性黑瘤。
為給個(gè)體提供基因治療，將編碼與表達(dá)所需要蛋白質(zhì)的特定DNA順序插入適合的載體復(fù)合物中，然后用它感染需要治療的個(gè)體。將所需要的遺傳順序引入個(gè)體時(shí)可以使用各種方法和載體。優(yōu)選的和最常用的方法是將所需要的遺傳順序引入反轉(zhuǎn)錄病毒的基因組中而形成嵌合體遺傳物質(zhì)。然后可以用在遺傳上改變的反轉(zhuǎn)錄病毒感染體外或體內(nèi)的合適靶細(xì)胞。優(yōu)選地，改變反轉(zhuǎn)錄病毒，將所需要的順序插入靶宿主細(xì)胞的基因組中并復(fù)制，而不復(fù)制感染的病毒。通過(guò)反轉(zhuǎn)錄病毒載體成功的基因轉(zhuǎn)移結(jié)果是用病毒感染的宿主細(xì)胞，它只表達(dá)所需要的基因產(chǎn)物。有關(guān)采用反轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行基因治療的評(píng)論可參見(jiàn)WO92/07943(于1992，5，14公開(kāi)“RetroviralVectorsUsefulforGeneTherapy”)和RichardC.Mulligan的“GeneTransferandGeneTherapy∶Principle，ProspectsandPerspective”，(EtiologyofHumanDiseaseattheDNALevel，Chapter12。JanLinsten和AlfPeterson，eds.RoverPress，1991)，這些都引入本文參考。
基因治療使用的其他方法可以包括但不限于將載體-DNA復(fù)合物改為新的靶區(qū)域的化學(xué)改性。適于提供基因順序的附加病毒載體包括但不限于與腺相關(guān)的病毒、單純性瘡疹1病毒和牛痘。改性的肝炎B或C病毒和它的δ劑RNA類病毒樣結(jié)構(gòu)也可用作針對(duì)肝的載體。
人體的與腺相關(guān)的病毒(AAV)是一類細(xì)小病毒，它自然地整合在人染色體19的特定位置上?？梢愿淖傾AV，將AAV末端重復(fù)與被克隆的所需遺傳順序結(jié)合，然后用作人淋巴細(xì)胞基因治療的載體。復(fù)制未修飾的AAV要求與輔助病毒，如腺病毒或單純性皰疹協(xié)同感染，然而，未修飾的AAV角將穩(wěn)定地整合而沒(méi)有這些輔助病毒。這種穩(wěn)定性使AAV成為極好的載體，尤其是對(duì)于抵抗或改變血紅蛋白病更是如此，這種病是例如(但不限于)鐮形細(xì)胞性疾病和β-地中海貧血。參見(jiàn)CarlosA.Muro-Cacho等人，“GeneTransferinHumanLymphocytesUsingaVectorBasedonAdeno-AssociatedVirus”(JournalofImmunotherapy11∶231-371(1992))。
重組牛痘病毒也可用于基因治療。牛痘是一種有大量雙股DNA的痘型病毒，并且在宿主細(xì)胞胞質(zhì)中很容易復(fù)制。由于牛痘的大DNA結(jié)構(gòu)，所以有能力編碼200多種分離的多肽，其中包括對(duì)其基因組復(fù)制所必需的那些多肽。外源基因可以插入牛痘基因組中，在牛痘復(fù)制循環(huán)過(guò)程中表達(dá)該外源基因。牛痘由于具有這樣大的復(fù)制能力，它有能力同時(shí)編碼和表達(dá)許多基因順序。這就使得研究人員對(duì)于極大的多肽如胰島素或各種白細(xì)胞介素能將整個(gè)DNA順序置于無(wú)能力產(chǎn)生必需蛋白質(zhì)的個(gè)體中，或者置于需要化學(xué)治療的那些個(gè)體中。牛痘載體的治療與使用在下述資料中作過(guò)敘述Macket，M.和Smith，，G.L.的JournalofGeneralVirology67∶2067-82(1986)和WO92/07944(“VacciniaVectors，VacciniaGenesandExpressionProductsThereof”，1992年5月14日公開(kāi))。
單純性皰疹病毒1(HSV1)也是一種基因治療中有用的載體。HowardJ.Federoff等人，“ExpressionofNerveGrowthFactorInVivoFromaDefectiveHerpesSimplexVirus.IVectorPreventdEffectsofAxotomyonSympatheticGanglia”，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences89∶1636-1640(1992)。在基因治療中使用HSV1，主要是因?yàn)槠湎冗M(jìn)感染系統(tǒng)。在HSV1-DNA順序與靶細(xì)胞連接后，病毒膜與能使病毒核蛋白殼直接進(jìn)入胞質(zhì)的細(xì)胞漿膜融合，然后進(jìn)入宿主細(xì)胞核中?；蛑委熤惺褂玫腍SV1經(jīng)修飾，以使除填塞位點(diǎn)(PackagingSite)和轉(zhuǎn)錄單位之外的所有部分都被除去，然后插入所需要的DNA順序。基因治療還可利用化學(xué)改性使所選擇的載體-DNA(通常為反轉(zhuǎn)錄病毒)的傳染性改變或改向，而針對(duì)具有對(duì)所選擇化學(xué)改性劑來(lái)說(shuō)具有唯一性的受體細(xì)胞。此外，可以通過(guò)將抗體與各種載體-DNA基因連結(jié)起來(lái)改變病毒的專一性。常用的抗體是抗MHCⅠ和MHCⅡ。
(MHC＝主要組織相容性復(fù)合物。然后這些抗體病毒-DNA復(fù)合物將感染帶有MHC抗原的細(xì)胞，并復(fù)制已插入的DNA順序。參見(jiàn)HiroshaNeda等人的“ChemicalModificationofanEcotropicMurineLeukemiaVivusResultsinRedirectionofIrsTargetCellSpecificity”(JournalofBiologicalChemistry，22∶14143-14146，1991)。
根據(jù)本發(fā)明的方法治療需要基因治療的個(gè)體時(shí)，通過(guò)采用強(qiáng)啡肽A或啡肽A類似物、以足以降低NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性的量治療該個(gè)體，來(lái)減弱通?？惯@種病毒感染的免疫應(yīng)答。在與嵌合體病毒接觸之前，之中或之后都可以如此施用強(qiáng)啡肽A或強(qiáng)啡肽A類似物。
將強(qiáng)啡肽A多肽和強(qiáng)啡肽A類似物施用于需要治療的個(gè)體，其量足以抑制NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性。優(yōu)選地，施用于個(gè)體的多肽量應(yīng)足夠達(dá)到血液中摩爾濃度為約1×10-7至1×10-2。血液中摩爾濃度為約1×10-6至約1×10-3是比較優(yōu)選的。按照本發(fā)明最優(yōu)選的方法，使用的多肽量應(yīng)足夠達(dá)到血液中摩爾濃度約1×10-5至約1×10-3。因?yàn)樗嵝头至鸦蚪到獾目赡苄院艽螅?dāng)使用酸型多肽抑制NK活性時(shí)，優(yōu)選較高濃度，即1×10-5至約1×10-2M。
可以通過(guò)測(cè)定血液樣品的NK活性來(lái)監(jiān)測(cè)治療效果。NK活性可通過(guò)測(cè)量NK靶細(xì)胞釋放標(biāo)記物進(jìn)行監(jiān)測(cè)。當(dāng)通過(guò)服用強(qiáng)啡肽A或強(qiáng)啡肽A類似物降低NK活性時(shí)，應(yīng)觀察到靶細(xì)胞釋放的標(biāo)記物也相應(yīng)降低。優(yōu)選地，分析從K 562(ATCC CCL 243)人紅白血病細(xì)胞(erytholeukerice)中釋放的51Cr可以評(píng)價(jià)NK活性。
如果轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞是對(duì)強(qiáng)啡肽敏感的，并且因使用轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞所見(jiàn)到的治療效果將由于強(qiáng)啡肽A的存在而受到或遏制，則在把轉(zhuǎn)導(dǎo)引入病人體內(nèi)之前應(yīng)中斷或降低使用強(qiáng)啡肽A或強(qiáng)啡肽A類似物。強(qiáng)啡肽A的摩爾濃度應(yīng)適當(dāng)降低，使該轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞保持活性，并且繼續(xù)其確定的治療目的。對(duì)強(qiáng)啡肽A敏感的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞或許包括T-淋巴細(xì)胞、B-淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明使用的強(qiáng)啡肽A肽和類似物可以以無(wú)菌藥組合物形式施用，該組合物還含有在生理上可接受的載體，其中包括但不限于鹽水、緩沖液、右旋糖和水。
旋用強(qiáng)啡肽A肽和類似物的方法可以是口服、舌下、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)皮或鼻內(nèi)的方法。直接給作用部位局部用藥也是合適的。并且可以采用本技術(shù)領(lǐng)域中已知方法用藥，其中包括但不限于注射，輸注和埋植多孔器具(其中裝有強(qiáng)啡肽A肽或類似物)。與其他肽的施用相似，優(yōu)選采用避免與胃腸道接觸的方法用藥，除非該部位是要作用的部位。若希望用藥避免強(qiáng)啡肽A通過(guò)肝及其隨后降解，那么優(yōu)選地采用舌下或靜脈內(nèi)的方法或采用其他透粘膜方法用藥。
實(shí)施例實(shí)施例Ⅰ強(qiáng)啡肽A肽和類似物調(diào)節(jié)體外天然殺傷細(xì)胞(NK)抑制作用強(qiáng)啡肽A(1-17)、強(qiáng)啡肽A(1-10)、強(qiáng)啡肽A(1-13)、強(qiáng)啡肽A(2-17)和強(qiáng)啡肽A(1-10)酰胺的NK抑制活性，可通過(guò)采用人的紅白血病細(xì)胞(ATCCCCL243)K 562為靶向體外測(cè)量分析51Cr釋放來(lái)進(jìn)行測(cè)定。采用Ficoll泛影酸鹽密度梯度離心法，從新鮮的肝素化血液分離出周圍血液?jiǎn)魏思?xì)胞(PBMC)。該細(xì)胞在RPMI 1640培養(yǎng)基中洗滌，該培養(yǎng)基補(bǔ)充了10%牛胎血清、1%L-谷氨酰胺和1%青霉素-鏈霉素、K 562細(xì)胞用100μCi51Cr在37℃潮濕的5%CO2氣氛下培育90分鐘進(jìn)行標(biāo)記。PBMC細(xì)胞分別用各種濃度的強(qiáng)啡肽和類似物(10-14至10-3M)培育15-30分鐘。在培育90分鐘后，將K 562細(xì)胞洗滌四次，并同PBMC/dyn細(xì)胞一起放到復(fù)制管中，PBMC/dyn效應(yīng)基因K 562靶之比為1∶50，最終體積為1ml，在潮濕的5%CO2氣氛下培育4小時(shí)。用1% Triton X-100溶液溶解洗滌緩沖液和標(biāo)記的K 562細(xì)胞來(lái)測(cè)定最大51Cr釋放。僅用培養(yǎng)基培育標(biāo)記的K 562細(xì)胞來(lái)測(cè)定自然釋放，只用靶細(xì)胞培養(yǎng)已標(biāo)記的K 562細(xì)胞來(lái)測(cè)定基線NK活性。在培育之后，取出0.5ml上清液，并進(jìn)行放射性計(jì)數(shù)。用平均值計(jì)算細(xì)胞毒性如下%細(xì)胞毒性＝ (cpm樣品-cpm自然)/(cpm最大-cmp自然) ×100觀察強(qiáng)啡肽A(1-10)酰胺和強(qiáng)啡肽A(1-17)培育的細(xì)胞的NK抑制作用(圖1和2)。強(qiáng)啡肽A(1-10)沒(méi)有引起NK活性任何大的變化(圖3)，而強(qiáng)啡肽A(1-13)和強(qiáng)啡肽A(2-17)引起NK活性增加(圖3)。
實(shí)施例Ⅱ基因治療轉(zhuǎn)移黑瘤的NK細(xì)胞抑制作用在白細(xì)胞介素-2和抗新霉素標(biāo)記物基因(NeoR)反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)至人腫瘤的淋巴細(xì)胞(TIL)之后，在基因治療轉(zhuǎn)移黑瘤時(shí)完成抑制天然殺傷細(xì)胞活性。TIL細(xì)胞是淋巴細(xì)胞，它滲入固體腫瘤并具有唯一的溶解量，對(duì)于自身腫瘤尤其如此。TIL細(xì)胞和白細(xì)胞介素-2結(jié)合起來(lái)可介導(dǎo)患有晚期黑瘤的病人腫瘤顯著消退，因?yàn)榘准?xì)胞介素-2起作TIL產(chǎn)生的刺激劑的作用。如果白細(xì)胞介素-2有基因插入體外TIL細(xì)胞，TIL細(xì)胞當(dāng)再引入患有自身腫瘤(如轉(zhuǎn)移黑瘤)的病人是時(shí)，由于連續(xù)表達(dá)白細(xì)胞介素-2的結(jié)果而將刺激體內(nèi)產(chǎn)生另外的TIL。TIL細(xì)胞活性的這種增強(qiáng)和細(xì)胞的補(bǔ)充應(yīng)增進(jìn)抗腫瘤細(xì)胞的活性，造成腫瘤減少或根除。使用強(qiáng)啡肽A或強(qiáng)啡肽A類似物降低NK活性以提高用病毒轉(zhuǎn)化的TIL細(xì)胞的比例，該細(xì)胞在NK攻擊中仍繼續(xù)存在。參見(jiàn)Rosenberg，SA等人和“GeneTransferintoHumans-ImmunotherapyofpatientswithAdvancedMelanoma，UsingTumor-InfiltratingLymphocytesModifiedbyRetroviralGeneTransduction”(N.Engl.J.Med.1990，9∶570-578)。
病例記錄從患有轉(zhuǎn)移黑瘤病人的腫瘤塊切除的組織在培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，采用下述敘述的技術(shù)分離TIL細(xì)胞RosenbergSA等人的“Useoftumor-infiltratinglymphocytesandinterLeukin-2intheimmunotherapyofpatientswithmetastaticmelanoma:apreliminaryreport”(N.Engl.J.Med.1988;319:1676-80)和TopalianSL等人的“Expansionofhumantumorinfiltrtinglymphocytesforuseinimmunotherapytrials”(J.Immunol.Methods1987;102:127-41)。
TIL細(xì)胞經(jīng)分離并培養(yǎng)8-19天之后，用Moloney鼠白血病反轉(zhuǎn)錄病毒LNL6轉(zhuǎn)導(dǎo)該細(xì)胞。在這種Moloney鼠白血病病毒衍生物中，除去gag.pol和env基因，并且插入白細(xì)胞介素-2的DNA序列和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶NeoR基因。這種特異性病毒在gag基因處有突變，這種突變可防止產(chǎn)生任何病毒蛋白質(zhì)。
采用由LNL6病毒感染的反轉(zhuǎn)錄病毒“填塞”細(xì)胞系，產(chǎn)生和LNL6病毒粒子PA317/LNL6置于Dulbecco′smodifiedEagle培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，該培養(yǎng)基含高水平葡萄糖和谷氨酰胺(12-604B，WhittakerBioproducts)以及10%熱滅活的胎牛血清(A-1111-L，Hyclone)。采集接近融合的PA317/LNL6培養(yǎng)物上清液、混合、用0.45-μm過(guò)濾器過(guò)濾、對(duì)NIH/3T3細(xì)胞滴定，然后在-70℃冷凍，直到馬上使用。含反轉(zhuǎn)錄病毒的上清液進(jìn)行需氧菌、厭氧菌和支原體試驗(yàn)、還對(duì)淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒進(jìn)行MAP試驗(yàn)，以及對(duì)ecotropicxenotropic和amphatrophic輔助病毒進(jìn)行StL-試驗(yàn)。根據(jù)FDA的要求另外進(jìn)行小鼠和荷蘭豬的一般性安全試驗(yàn)。
TIL細(xì)胞培養(yǎng)物中總細(xì)胞數(shù)一旦達(dá)到了細(xì)胞數(shù)為約1.2-7.6×108細(xì)胞時(shí)，三分之一至二分之一的TIL細(xì)胞與LNL 6上清液接觸。在每個(gè)瓶裝有200ml培養(yǎng)基的800ml組織培養(yǎng)瓶中，在每毫升溶液5μg魚精蛋白存在下，病毒粒子與細(xì)胞的比例范圍應(yīng)該為1.3至2.3。該細(xì)胞在病毒粒子存在下于37℃培育2小時(shí)。洗滌該細(xì)胞，并在每毫升106細(xì)胞的密度下傳代培養(yǎng)。重復(fù)轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟，直到回收率達(dá)到74-100%。
在TIL細(xì)胞輸入到病人之前，根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)采用流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)篩選各種培養(yǎng)物。還測(cè)定它們抗自身腫瘤、異源腫瘤的溶解性質(zhì)，以及抗對(duì)NK敏感的K562和對(duì)NK不敏感的Daudi細(xì)胞系的鉻-51釋放試樣。對(duì)內(nèi)毒素進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的鱟試驗(yàn)，并且進(jìn)行Southern印跡分析與新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶試驗(yàn)，以證實(shí)NeoR基因的存在與表達(dá)，并因此證實(shí)，成功轉(zhuǎn)導(dǎo)伴隨的白細(xì)胞介素-2的順序。
在將已轉(zhuǎn)導(dǎo)的TIL細(xì)胞計(jì)劃引入進(jìn)行基因治療的病人之前約兩星期，該病人應(yīng)該開(kāi)始用強(qiáng)啡肽A肽類似物治療的療程。病人接受的強(qiáng)啡肽A或強(qiáng)啡肽A類似物的量應(yīng)該使血液中的摩爾濃度足以達(dá)到約1×10-4至約1×10-3。每1-3小時(shí)服用所選擇的強(qiáng)啡肽，直到病人輸入重組TIL細(xì)胞前約48小時(shí)，在這個(gè)時(shí)候停止施用強(qiáng)啡肽A肽或類似物。這樣就使TIL細(xì)胞與強(qiáng)啡肽A或其類似物接觸最少，它們可以直接降低TIL細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性。
在48小時(shí)后，或者病人中強(qiáng)啡肽A肽水平達(dá)到摩爾濃度低于約1×10-7時(shí)，可以將轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞輸入病人中。在30至60分鐘期間內(nèi)，輸注1-3次，每次200-250ml，每次輸注轉(zhuǎn)導(dǎo)TIL/白細(xì)胞介素-2最大為2×1011個(gè)細(xì)胞。
在回收間隔為10-22天后，該病人返回第二個(gè)TIL/白細(xì)胞介素-2循環(huán)，病人再接受強(qiáng)啡肽A肽或類似物的治療，直到恢復(fù)TIL/白細(xì)胞介素-2輸注前48小時(shí)。
開(kāi)始治療之后二個(gè)月，得到放射照片、掃描圖和測(cè)定結(jié)果以便評(píng)價(jià)該癌的狀況。病人的癌穩(wěn)定或惡化則要進(jìn)行第二個(gè)療程。
在治療過(guò)程中，由于有限間隔引入強(qiáng)啡肽A肽或類似物，病人可以獲得轉(zhuǎn)導(dǎo)TIL/白細(xì)胞介素-2的充分益處，而對(duì)再引入的TIL細(xì)胞無(wú)NK細(xì)胞毒性。
與我們?cè)谇懊嬉衙枋鲈S多本發(fā)明具體方案的同時(shí)，很顯然可以改變基本結(jié)構(gòu)以便提供利用本發(fā)明方法的其他具體方案。因此，應(yīng)意識(shí)到本發(fā)明的范圍是由本文所附的權(quán)利要求書所限定的，而不是通過(guò)前面列出的實(shí)施例的特定具體方案所限定。
權(quán)利要求
1.一種抑制需要治療個(gè)體的哺育動(dòng)物NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性的方法，其中包括給個(gè)體施用具有下述結(jié)構(gòu)的強(qiáng)啡肽A肽Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa15-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa1015其中1位氨基酸選自由酪氨酸、m-酪氨酸和二羥基苯丙氨酸(多巴)組成的組中；2、3、15和16位是選自于由甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺和α-氨基異丁酸(AIB)組成的組中的中性氨基酸；4位是選自于由苯丙氨酸、酪氨酸、α-甲基苯基丙氨酸和其中苯環(huán)由對(duì)位取代的斥電子基如鹵素或硝基取代的苯丙氨酸組成的組中的氨基酸；5和14位是選自于由亮氨基酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸組成的組中的非極性(疏水的)氨基酸；6、7、9、11和13位是選自于由精氨酸、賴氨酸、組氨酸、高精氨酸或鳥(niǎo)氨酸組成的組中的負(fù)電荷氨基酸，并且其中9位的氨基酸也可以是脯氨酸；8和12位是選自于由酪氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和賴氨酸組成的堿性或中性氨基酸組中的氨基酸；10位是選自于由硫代脯氨酸、3，4-二氫脯氨酸、4-羥基脯氨酸、脯氨酸和哌可酸組成的組中的堿性氨基酸或脯氨酸類似物；其中氨基酸選自d和l型；并且其中強(qiáng)啡肽A肽的羧基末端具有下式 式中aa是第n個(gè)氨基酸的側(cè)鏈，n是強(qiáng)啡肽A多肽中的氨基酸總數(shù)；并且R1和R2是相同的或不同的，它們是氫、C1-4烷基、選擇性取代的苯甲基，或者當(dāng)R1和R2之一是含氮部分如酰肼時(shí)，則另一個(gè)則是氫，還有，其中強(qiáng)啡肽A肽的氨基酸共價(jià)結(jié)合在一起的肽鏈具有下述結(jié)構(gòu) 式中R3是選自于氫或C1-4烷基，并且式中的烷基是直鏈或支鏈的；并且其中強(qiáng)啡肽A肽選擇性地包括11位、最高到并包括17位的氨基酸；以及其中強(qiáng)啡肽A肽以足以調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性的量施用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中R1、R2、R3是氫。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中酰胺化的強(qiáng)啡肽A肽選自于由強(qiáng)啡肽A(1-10)酰胺、最高到并包括強(qiáng)啡肽A(1-17)酰胺組成的組中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中給個(gè)體施用足以達(dá)到血液中摩爾濃度為約1×10-7至約1×10-2量的強(qiáng)啡肽A肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中給個(gè)體施用足以達(dá)到血液中摩爾濃度為約1×10-6至約1×10-3量的強(qiáng)啡肽A肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中給個(gè)體施用足以達(dá)到血液中摩爾濃度為約1×10-5至約1×10-3量的強(qiáng)啡肽A肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中多肽選自于由強(qiáng)啡肽A(1-17)和強(qiáng)啡肽A(1-10)酰胺組成的組中。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中給個(gè)體施用強(qiáng)啡肽A肽以便使患有自身免疫疾病的個(gè)體NK活性降低。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中自身免疫疾病選自于由紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、溶血性貧血、青少年糖尿病、阿狄森病、甲狀腺毒癥、自身免疫萎縮性胃炎、原發(fā)性膽汁性肝硬變和多發(fā)性硬化組成的組中。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中強(qiáng)啡肽A肽1位的氨基酸是酪氨酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中強(qiáng)啡肽A肽以足以使血液中摩爾濃度達(dá)到約1×10-7至約1×10-2的量施用。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中給個(gè)體施用足以使血液中摩爾濃度達(dá)到約1×10-6至約1×10-3量的強(qiáng)啡肽A肽。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中給個(gè)體施用足以使血液中摩爾濃度達(dá)到約1×10-5至約1×10-3量的強(qiáng)啡肽A肽。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述的強(qiáng)啡肽選自于由強(qiáng)啡肽A(1-10)酰胺和強(qiáng)啡肽A(1-17)酰胺組成的組中。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中服用強(qiáng)啡肽以便抑制或降低接受移植組織的個(gè)體NK活性。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中移植組織選自于由肝、腎、心臟、肺和骨髓組成的組中。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中強(qiáng)啡肽A肽1位的氨基酸是酪氨酸。
18.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中給個(gè)體施用足以使血液中摩爾濃度達(dá)到約1×10-7至約1×10-2量的強(qiáng)啡肽A肽。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中給個(gè)體施用足以使血液中摩爾濃度達(dá)到約1×10-6至約1×10-3量的強(qiáng)啡肽A肽。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中給個(gè)體施用足以使血液中摩爾濃度達(dá)到約1×10-5至約1×10-3量的強(qiáng)啡肽A肽。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中強(qiáng)啡肽A肽選自于由強(qiáng)啡肽A(1-10)酰胺和強(qiáng)啡肽A(1-17)組成的組中。
22.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中給個(gè)體施用強(qiáng)啡肽A肽以使降低對(duì)給個(gè)體服用以提供基因治療的細(xì)胞的NK活性。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中強(qiáng)啡肽A肽1位氨基酸是酪氨酸。
24.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中施用的細(xì)胞是用病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的。
25.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中強(qiáng)啡肽A肽以足以使血液中摩爾濃度達(dá)到約1×10-7至約1×10-2量的使用。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中給個(gè)體施用足以使血液中摩爾濃度達(dá)到約1×10-6至約1×10-3量的強(qiáng)啡肽A肽。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中給個(gè)體施用足以使血液中摩爾濃度達(dá)到約1×10-5至約1×10-3量的強(qiáng)啡肽A肽。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中強(qiáng)啡肽A肽選自于由強(qiáng)啡肽A(1-10)酰胺和強(qiáng)啡肽A(1-17)組成的組中。
29.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中給病人施用轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，以便治療選自于由膀胱纖維變性、β-地中海貧血、鐮形細(xì)胞貧血、肌肉營(yíng)養(yǎng)不良和癌組成的組中的疾病。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中癌選自于由乳腺癌、加德納多發(fā)性息肉病、急性骨髓性白血病、多發(fā)性骨髓瘤和惡性黑瘤組成的組中。
31.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中在施用作基因治療的細(xì)胞之前施用強(qiáng)啡肽A肽，以及其中使強(qiáng)啡肽A肽的摩爾濃度降至低于一定濃度，在施用作基因治療的細(xì)胞之前，該濃度降低NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中使強(qiáng)啡肽A肽的摩爾濃度降低到至少約1×10-7水平。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中強(qiáng)啡肽A肽1位氨基酸是酪氨酸。
34.一種提供基因治療的方法，其中包括通過(guò)給個(gè)體施用具有下述結(jié)構(gòu)的強(qiáng)啡肽抑制需要基因治療個(gè)體中哺乳動(dòng)物NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa15-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa1015其中1位氨基酸選自于由酪氨酸、m-酪氨酸和二羥基苯丙氨酸(多巴)組成的組中;2、3、15和16位是選自于由甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺和α-氨基異丁酸(AIB)組成的組中的極性中性氨基酸;4位是選自于由苯丙氨酸、α-甲基苯丙氨酸、其中苯環(huán)由對(duì)位取代的斥電子基團(tuán)如鹵素或硝基取代的苯丙氨酸和酪氨酸組成的組中;5和14位是選自于由亮氨基酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸組成的組中的非極性(疏水的)氨基酸;6、7、9、11和13位是選自于由精氨酸、賴氨酸、組氨酸、高精氨酸或鳥(niǎo)氨酸組成的組中的負(fù)電荷氨基酸，并且其中9位的氨基酸也可以是脯氨酸;8和12位是選自于由酪氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和賴氨酸組成的堿性或中性氨基酸組中的氨基酸;10位是選自于由硫代脯氨酸、3，4-二氫脯氨酸、4-羥基脯氨酸和哌可酸組成的組中的堿性氨基酸或脯氨酸類似物;其中氨基酸選自d和l型;并且強(qiáng)啡肽A肽的羧基末端是羧基，并且其中將強(qiáng)啡肽的氨基酸共價(jià)聯(lián)結(jié)起來(lái)的肽鍵具有下述結(jié)構(gòu) 式中R1選自于氫或C1-4烷基，而烷基是直鏈或支鏈的;以及其中強(qiáng)啡肽A肽選擇地含15位直到并包括17位的氨基酸，其中以足以減弱NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性的量施用強(qiáng)啡肽A肽。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中用于進(jìn)行基因治療的細(xì)胞是由病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的。
36.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中強(qiáng)啡肽A肽以足以使血液中摩爾濃度達(dá)到約1×10-7至約1×10-2的量施用。
37.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中強(qiáng)啡肽A肽以足以使血液中摩爾濃度達(dá)到約1×10-6至約1×10-3的量施用。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中強(qiáng)啡肽A肽以足以使血液中摩爾濃度達(dá)到約1×10-5至約1×10-3的量施用。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中強(qiáng)啡肽A肽1位氨基酸是酪氨酸。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中強(qiáng)啡肽A肽是強(qiáng)啡肽A(1-17)。
41.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中將轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞施用于病人以治療由膀胱纖維變性、β-地中海貧血、鐮形細(xì)胞性貧血、肌肉營(yíng)養(yǎng)不良、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病和癌組成的組中的疾病。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，其中強(qiáng)啡肽A肽是強(qiáng)啡肽A(1-17)。
43.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，其中癌選自于由乳腺癌、結(jié)腸癌、加德納多發(fā)性息肉病、急性肌髓性白血病、多發(fā)性骨髓瘤和惡性黑瘤組成的組中。
44.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中在施用作基因治療的細(xì)胞之前施用強(qiáng)啡肽A肽，以及其中使強(qiáng)啡肽的摩爾濃度降至低于一定摩爾濃度，在施用作基因治療的細(xì)胞之前，該濃度可降低NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性。
45.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，其中使強(qiáng)啡肽的摩爾濃度降低到至少約1×10-7水平。
46.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，其中強(qiáng)啡肽A肽1位氨基酸是酪氨酸。
47.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中給病人施用轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞以治療選自于由膀胱纖維變性、β-地中海貧血、鐮形細(xì)胞性貧血、肌肉營(yíng)養(yǎng)不良、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病和癌組成的組中的疾病。
48.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中癌選自于由乳腺癌、結(jié)腸癌、加德納多發(fā)性息肉病、急性肌髓性白血病、多發(fā)性骨髓瘤和惡性黑瘤組成的組中。
49.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中強(qiáng)啡肽A肽是強(qiáng)啡肽A(1-17)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種抑制哺乳動(dòng)物天然殺傷(NK)細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性的方法。
文檔編號(hào)C07K14/665GK1096962SQ93121649
公開(kāi)日1995年1月4日 申請(qǐng)日期1993年12月2日 優(yōu)先權(quán)日1992年12月2日
發(fā)明者M·J·克里克 申請(qǐng)人:洛克菲勒大學(xué)