本發(fā)明屬于細胞富集領(lǐng)域，特別涉及一種基于微流控及免疫磁分離的血液中稀有細胞的負相富集方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
：ctc(circulatingtmorcells)被定義為自發(fā)或因診療操作而脫離實體瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶進入外周血循環(huán)的腫瘤細胞。自2003年，美國德州大學(xué)anderson腫瘤中心的克里斯托弗尼cristofanilli教授及其團隊在新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志上發(fā)表的文獻中，首次證實治療前的ctc數(shù)量可作為轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者無進展生存率(pfs)和總生存率(os)的獨立預(yù)測因子后，有關(guān)ctc的檢測也已經(jīng)逐步在科研和臨床領(lǐng)域得到了推廣和應(yīng)用。在針對ctc的檢測中依據(jù)原理主要分為正向與負向。正向主要通過特異性捕捉血液中的ctc細胞來進行相關(guān)檢測，負向則主要通過特異性的去除血液中已知的除ctc之外的生物標志物(蛋白，細胞，核酸)，從而從全血樣本中富集ctcs，而ctc在血液中的存在數(shù)量要遠遠少于血液中的其它細胞，去除ctc之外的細胞會減少對ctc的干擾，提高檢測的靈敏度與特異性，故在ctc檢測之前如何去除無關(guān)檢測的雜質(zhì)也是一個重要的研究方向。cd系列抗原為人白細胞分化抗原，其中cd45由一類結(jié)構(gòu)相似，分子量較大的跨膜蛋白組成，廣泛存在于白細胞表面；cd45在所有白細胞中均呈高表達，稱為白細胞共同抗原?，F(xiàn)在常規(guī)的白細胞去除主要通過離心、免疫等方式，使用免疫原理去除也有使用親和層析、磁微粒等多種不同手段，但是所使用的免疫抗體通常只有單獨的抗cd-45抗體，雖然抗cd-45抗體是現(xiàn)有cd系列抗體中與白細胞結(jié)合率最高的抗體，但結(jié)果依然有可提升的空間。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種基于微流控及免疫磁分離的血液中稀有細胞的負相富集方法及試劑盒，該方法對紅細胞進行裂解并優(yōu)化結(jié)合了免疫磁分離、密度梯度離心、微流控等多種技術(shù)對白細胞進行去除，對白細胞的去除率達到了99％以上。本發(fā)明提供了一種基于微流控及免疫磁分離的血液中稀有細胞的負相富集方法，包括：(1)使用前處理液對血液樣本進行離心處理，去除血液中部分雜質(zhì)；(2)使用裂解液對經(jīng)過步驟(1)的樣本進行裂解，去除血液中紅細胞，收集剩余細胞；(3)在剩余細胞中加入連接有相應(yīng)抗體的磁微粒結(jié)合白細胞，室溫下進行免疫反應(yīng)；(4)使用分離介質(zhì)對經(jīng)過步驟(3)的樣本進行分離，去除未結(jié)合的磁微粒；(5)使用免疫磁微粒捕獲儀，利用微流控技術(shù)進行分離，對白細胞進行去除，最后得到富集后的樣本。所述步驟(1)中的前處理液的組成為每升80.00g氯化鈉，2.00g氯化鉀，14.20g磷酸氫二鈉，2.77g磷酸二氫鉀，3.72g乙二胺四乙酸二鈉，50.00g小牛血清白蛋白，5.00mltween-20，20.00g蔗糖，0.5mlproclin-300。所述步驟(2)中的裂解液的組成為每升32.094g氯化銨，10.00g碳酸氫鉀，0.372g乙二胺四乙酸二鈉，0.5mlproclin-300。所述步驟(3)中的抗體為cd2、cd14、cd15、cd45、cd45ra、cd45ro中的三個或三個以上的抗體組。所述步驟(3)中的免疫反應(yīng)時間為20分鐘。所述步驟(4)中的分離介質(zhì)的組成為每升8.000g氯化鈉，0.200g氯化鉀，1.420g磷酸氫二鈉，0.277g磷酸二氫鉀，15.00g聚蔗糖400，100.00g泛影酸鈉，2.00g甲基纖維素。所述步驟(5)中提供了一種微流控技術(shù)：專利號為201210389753.7的中國發(fā)明專利申請文件公開的“一種血液中稀有細胞的分離儀”，以及專利號為zl201310058653.0的中國發(fā)明專利申請文件公開的“一種血液中稀有細胞的分離方法”。兩發(fā)明提供了一種基于正向富集原理的血液中稀有細胞的富集方法，其中翻轉(zhuǎn)微芯片使微芯片處于不同的三個狀態(tài)，第一個狀態(tài)：pbs緩沖液將微芯片內(nèi)的空氣排出；第二個狀態(tài)：讓血液樣本流經(jīng)微芯片，進行檢測，微流體通道位于磁鐵的下方，此時利用磁鐵和微磁場對稀有細胞的磁力和稀有細胞重力的方向相反的原理將稀有細胞從血液樣本中分離出來；第三個狀態(tài)：將微芯片處于垂直狀態(tài)，提高稀有細胞和血紅細胞的分離效率。在檢測結(jié)束后，微芯片處于垂直狀態(tài)，便于將附有腫瘤細胞的載玻片從微芯片中取出，進行后續(xù)分析。三個狀態(tài)完成了對稀有細胞的分離。本發(fā)明則主要應(yīng)用于血液中稀有細胞的負向富集。其中三個狀態(tài)具體為第一個狀態(tài)：pbs緩沖液將微芯片內(nèi)的空氣排出；第二個狀態(tài)：讓經(jīng)過之前步驟處理的血液樣本流經(jīng)微芯片，微流體通道位于磁鐵的下方，此時利用磁鐵和微磁場對白細胞的磁力和白細胞重力的方向相反的原理將白細胞從血液樣本中分離出來，稀有細胞則保留在樣本中流經(jīng)微芯片；第三個狀態(tài)：將微芯片處于垂直狀態(tài)，提高白細胞和血樣中稀有細胞的分離效率。在處理結(jié)束后，微芯片處于垂直狀態(tài)，收集流經(jīng)微芯片的血樣，進行后續(xù)分析。三個狀態(tài)完成了對白細胞從樣本的分離，從而使得血液中稀有細胞得到富集。本發(fā)明還提供了一種基于微流控及免疫磁分離的血液中稀有細胞的負相富集試劑盒，所述試劑盒包括前處理液、裂解液、連接有相應(yīng)抗體的磁微粒和分離介質(zhì)。有益效果本發(fā)明對紅細胞進行裂解并優(yōu)化結(jié)合了免疫磁分離、密度梯度離心、微流控等多種技術(shù)對白細胞進行去除，對白細胞的去除率達到了99％以上；采用本發(fā)明的血液中稀有細胞的富集方法及試劑盒，可以達到富集血液中循環(huán)稀有細胞的目的，具有良好的應(yīng)用前景。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實施例1本實施例提供了一種基于微流控及免疫磁分離的血液中稀有細胞的負相富集試劑盒，所述試劑盒包括前處理液、裂解液、連接有相應(yīng)抗體的磁微粒和分離介質(zhì)。前處理液的組成為每升80.00g氯化鈉，2.00g氯化鉀，14.20g磷酸氫二鈉，2.77g磷酸二氫鉀，3.72g乙二胺四乙酸二鈉，50.00g小牛血清白蛋白，5.00mltween-20，20.00g蔗糖，0.5mlproclin-300。裂解液的組成為每升32.094g氯化銨，10.00g碳酸氫鉀，0.372g乙二胺四乙酸二鈉，0.5mlproclin-300。分離介質(zhì)的組成為每升8.000g氯化鈉，0.200g氯化鉀，1.420g磷酸氫二鈉，0.277g磷酸二氫鉀，15.00g聚蔗糖400，100.00g泛影酸鈉，2.00g甲基纖維素。具體步驟如下：(1)使用前處理液對血液樣本進行離心處理，去除血液中部分雜質(zhì)；充分混勻一次性真空采血管的全血標本，取20μl全血，加至裝有380μl2％冰醋酸水溶液的一次性試管中，充分混勻，取10μl混勻液加入血球計數(shù)板，靜置1-2分鐘，鏡下計數(shù)，連續(xù)計數(shù)3次，取4個大方格總數(shù)的平均數(shù)。4ml全血中的白細胞數(shù)＝4個大方格總數(shù)的平均數(shù)×2×105。輕微顛倒混勻后取4ml全血至50ml離心管中。用前處理液將離心管內(nèi)的體積補充到45ml，輕微顛倒混勻，離心(700g，室溫，5分鐘)，棄上清，留12ml于離心管，輕搖離心管混勻沉淀細胞。(2)使用裂解液對經(jīng)過步驟(1)的樣本進行裂解，去除血液中紅細胞，收集剩余細胞；添加裂解液至45ml，將離心管置于垂直混勻儀，室溫10分鐘(20轉(zhuǎn)/分鐘)。離心(700g，室溫，5分鐘)，棄上清溶液，加200μl前處理液于離心管，輕搖離心管混勻沉淀細胞(試管沿同一方向豎直搖勻，但不要使液體超過5ml)，再加入前處理液至5ml。(離心過程中，可開始第4步處理磁微粒)(3)在剩余細胞中加入連接有相應(yīng)抗體的磁微粒結(jié)合白細胞，室溫下進行免疫反應(yīng)；洗滌磁微粒：吸取適量混勻磁微?；鞈乙?100μl/人份)至2mlep管中，靜置磁力架上1-2分鐘，待溶液澄清后，吸出溶液。取下ep管，添加1ml前處理液用槍吹打混勻，磁力架上分離磁微粒1-2分鐘，棄上清。重復(fù)洗滌3次后，用前處理液重懸磁微粒至原體積。將洗滌好的磁微粒避光保存在試管架上。(磁微粒不能久置于磁力架上，必須隨時用前處理液浸泡磁微粒，清洗過程中盡量避免氣泡的產(chǎn)生。)按每人份100μl的比例將磁微粒溶液緩慢加入到上述預(yù)處理好的血液樣本中，同時搖動離心管以充分混勻磁微粒。將搖床搖速調(diào)節(jié)到100-120rpm，將離心管以45°角傾斜固定于搖床，室溫搖動20分鐘。(4)使用分離介質(zhì)對經(jīng)過步驟(3)的樣本進行分離，去除未結(jié)合的磁微粒；取3ml分離介質(zhì)加入新的50ml離心管中，將上述步驟3中的所有液體輕輕疊加到分離介質(zhì)頂層，離心(300g，室溫，5分鐘)。離心后可見3層溶液，輕柔吸取最上2層溶液，加至新15ml離心管中，添加前處理液至14ml，輕柔顛倒混勻后離心(1000g，室溫，5分鐘)，棄上清至0.3ml左右，加1ml前處理液，輕柔吹打混勻后移至樣本管內(nèi)。(5)使用免疫磁微粒捕獲儀，利用微流控技術(shù)進行分離，對白細胞進行去除，最后得到富集后的樣本。將上述樣本管置于免疫磁微粒捕獲儀中，自動程序進行免疫磁微粒富集，并收集剩余液體。離心：將上述步驟4的離心管離心(2100g，室溫，3分鐘)，棄上清至100μl，混勻細胞。計數(shù)剩余白細胞數(shù)，方法與步驟1中相同。剩余白細胞數(shù)＝4個大方格內(nèi)的白細胞的平均數(shù)×5×103。按照(1-白細胞最終計數(shù))/白細胞初始計數(shù)×100％的公式計算白細胞去除率。使用不同的抗體白細胞去除率結(jié)果見以下表格：表一單個抗體白細胞去除率抗體cd2cd14cd15cd45cd45racd45ro去除率59.36％43.08％62.42％88.22％52.86％50.64％表二雙抗體組合白細胞去除率抗體cd2+cd14cd2+cd15cd2+cd45cd2+cd45racd2+cd45ro去除率67.28％94.71％97.47％78.53％75.89％抗體cd14+cd15cd14+cd45cd14+cd45racd14+cd45rocd15+cd45去除率68.27％89.54％62.14％60.81％97.87抗體cd15+cd45racd15+cd45rocd45+cd45racd45+cd45rocd45ra+cd45ro去除率76.57％75.43％95.63％96.85％87.46％表三三抗體組合白細胞去除率當前第1頁12