本發(fā)明涉及化合物的提取富集及檢測(cè)領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及一種檢測(cè)鐵皮石斛中石斛酚的方法。

背景技術(shù)：

石斛為蘭科石斛屬植物，是一種常用名貴中藥。我國(guó)約有石斛屬植物76種，目前供作藥用的原植物為45種。石斛的主要藥用成分包括多糖、生物堿和茋類。

其中，石斛酚作為石斛中特有的茋類化合物其含量約為0.001％，對(duì)胃癌細(xì)胞，肝癌細(xì)胞均有抑制活性，是石斛藥用成分研究的熱點(diǎn)。石斛酚(gigantol)4,4’-二羥基-2’,3-二甲氧基聯(lián)芐，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：

目前對(duì)于石斛酚的研究多集中于藥理藥效，而對(duì)其含量的檢測(cè)在石斛酚的深入研究以及石斛的種植鑒定過(guò)程中都是非常重要的，因此開發(fā)一種能有效分離檢測(cè)石斛酚的分析方法是非常必要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種檢測(cè)鐵皮石斛中石斛酚的方法。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種檢測(cè)鐵皮石斛中石斛酚的方法，包括以下步驟：

(1)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

分別稱取石斛酚標(biāo)準(zhǔn)品，溶于色譜級(jí)甲醇中，渦旋30s～60s，制成200μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；

(2)供試品溶液的配制

稱取鐵皮石斛樣品，然后用甲醇水溶液作為提取溶劑對(duì)鐵皮石斛樣品進(jìn)行提取，得到鐵皮石斛提取液，之后將鐵皮石斛提取液中的溶劑除干，再?gòu)?fù)溶于色譜級(jí)甲醇中，然后放置12～24小時(shí)，最后進(jìn)行過(guò)濾處理，所得的濾液即為供試品溶液；

(3)供試品溶液的測(cè)定

采用HPLC-DAD檢測(cè)方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)用的色譜條件為：色譜柱參數(shù)C18Column 250×4.6mm 5um，柱溫20℃～60℃，進(jìn)樣量1μL～50μL，流速1.0mL/min，流動(dòng)相為乙腈和甲酸水溶液，梯度洗脫條件為在0min～40min，有機(jī)相在流動(dòng)相里的比例從5％～20％升至80％～90％。

進(jìn)一步地，步驟(2)中，所述甲醇水溶液的體積濃度為60％～80％。在實(shí)施本發(fā)明的過(guò)程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，采用這種提取溶劑的提取效果較好，從而保證對(duì)石斛酚的檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

進(jìn)一步地，步驟(2)中，提取的具體過(guò)程為：按照0.5g/1ml～2ml的比例將鐵皮石斛樣品浸于甲醇水溶液中，然后在40℃～60℃的溫度下超聲處理15min～60min，再在4000rpm～6000rpm的轉(zhuǎn)速下離心處理15min～20min，取上清液，重復(fù)以上過(guò)程2～4次，合并上清液，即為所述鐵皮石斛提取液。在實(shí)施本發(fā)明的過(guò)程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，采用以上提取工藝，能夠令鐵皮石斛中的石斛酚充分析出，從而保證對(duì)石斛酚的檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

進(jìn)一步地，步驟(2)中，將鐵皮石斛提取液中的溶劑除干的方式為用氮?dú)獯蹈伞?/p>

進(jìn)一步地，步驟(2)中，復(fù)溶時(shí)每0.5g鐵皮石斛樣品使用200μL～500μL色譜級(jí)甲醇。

進(jìn)一步地，步驟(2)中，過(guò)濾處理采用微孔濾膜過(guò)濾，濾膜的孔徑為0.22μm～0.45μm。

進(jìn)一步地，步驟(3)中，流動(dòng)相的甲酸水溶液的體積濃度為0.01％～0.1％。

進(jìn)一步地，二極管陣列檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)為190nm～400nm。

進(jìn)一步地，石斛酚在24.107min～24.352min，230nm～300nm處有最大吸收峰。

本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：

1.本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，操作方便、高效，應(yīng)用成本低，而且檢測(cè)靈敏度、精確度和準(zhǔn)確度較高，回收率也非常高。

2.本發(fā)明采用甲醇水溶液作為提取劑，既能高效提取石斛酚，又能避免過(guò)多大極性雜質(zhì)的干擾。

3.本發(fā)明確定了石斛酚24.107min～24.352min，230nm～300nm處有最大吸收峰。

4.本發(fā)明的提取過(guò)程采用超聲能夠破碎細(xì)胞，使提取更充分，重復(fù)提取可以使石斛酚充分溶解于甲醇中，由于石斛酚含量較低，濃縮復(fù)溶可以提高溶液中石斛酚的濃度，便于檢測(cè)。

附圖說(shuō)明

圖1為石斛酚標(biāo)準(zhǔn)品的紫外吸收光譜。

圖2為石斛酚標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖。

圖3為實(shí)施例1得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實(shí)施方式

為使本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，在下面的詳細(xì)描述中，只通過(guò)說(shuō)明的方式描述了本發(fā)明的某些示范性實(shí)施例。毋庸置疑，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以用各種不同的方式對(duì)所描述的實(shí)施例進(jìn)行修正。

以下實(shí)施例所使用的石斛酚標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

實(shí)施例1

一種檢測(cè)鐵皮石斛中石斛酚的方法，包括以下步驟：

(1)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

分別稱取石斛酚標(biāo)準(zhǔn)品，溶于色譜級(jí)甲醇中，渦旋45s，制成200μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；

(2)供試品溶液的配制

稱取0.5g鐵皮石斛樣品，然后用體積濃度為80％的甲醇水溶液作為提取溶劑對(duì)鐵皮石斛樣品進(jìn)行提取，提取的具體過(guò)程為：按照0.5g/2ml的比例將鐵皮石斛樣品浸于甲醇水溶液中，然后在50℃的溫度下超聲處理30min，再在6000rpm的轉(zhuǎn)速下離心處理20min，取上清液，重復(fù)以上過(guò)程2次，第一次超聲離心處理時(shí)，對(duì)浸于甲醇水溶液中的鐵皮石斛樣品進(jìn)行研磨處理，合并上清液，即為鐵皮石斛提取液，之后用氮?dú)鈱㈣F皮石斛提取液吹干，再?gòu)?fù)溶于300μL色譜級(jí)甲醇中，然后放置18小時(shí)，最后進(jìn)行過(guò)濾處理，過(guò)濾處理采用微孔濾膜過(guò)濾，濾膜的孔徑為0.22μm，所得的濾液即為供試品溶液；

(3)供試品溶液的測(cè)定

采用HPLC-DAD檢測(cè)方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)用的色譜條件為：色譜柱參數(shù)C18Column 250×4.6mm 5um，柱溫25℃，進(jìn)樣量20μL，流速1.0mL/min，流動(dòng)相為乙腈和體積濃度為0.1％的甲酸水溶液，梯度洗脫條件為在0min～40min，有機(jī)相在流動(dòng)相里的比例從5％升至80％；

二極管陣列檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)為279nm；

(4)結(jié)果解析

在檢測(cè)之前，首先對(duì)石斛酚標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行紫外可見光譜分析，得到石斛酚的紫外可見光譜圖，參見圖1，200μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液的液相色譜圖參見圖2，經(jīng)過(guò)分析得知，石斛酚在24.352min，279nm處有最大吸收峰。

通過(guò)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的測(cè)定，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，參見圖3，得到石斛酚含量計(jì)算公式如下：y＝3.7649x+0.0481，y為濃度(μg/mL)、x為峰面積；

實(shí)施例2

一種檢測(cè)鐵皮石斛中石斛酚的方法，包括以下步驟：

(1)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

分別稱取石斛酚標(biāo)準(zhǔn)品，溶于色譜級(jí)甲醇中，渦旋30s，制成200μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；

(2)供試品溶液的配制

稱取0.5g鐵皮石斛樣品，然后用體積濃度為60％的甲醇水溶液作為提取溶劑對(duì)鐵皮石斛樣品進(jìn)行提取，提取的具體過(guò)程為：按照0.5g/1ml的比例將鐵皮石斛樣品浸于甲醇水溶液中，然后在40℃的溫度下超聲處理60min，再在4000rpm的轉(zhuǎn)速下離心處理15min，取上清液，重復(fù)以上過(guò)程3次，第一次超聲離心處理時(shí)，對(duì)浸于甲醇水溶液中的鐵皮石斛樣品進(jìn)行研磨處理，合并上清液，即為鐵皮石斛提取液，之后用氮?dú)鈱㈣F皮石斛提取液吹干，再?gòu)?fù)溶于200μL色譜級(jí)甲醇中，然后放置24小時(shí)，最后進(jìn)行過(guò)濾處理，過(guò)濾處理采用微孔濾膜過(guò)濾，濾膜的孔徑為0.45μm，所得的濾液即為供試品溶液；

(3)供試品溶液的測(cè)定

采用HPLC-DAD檢測(cè)方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)用的色譜條件為：色譜柱參數(shù)C18Column 250×4.6mm 5um，柱溫20℃，進(jìn)樣量1μL，流速1.0mL/min，流動(dòng)相為乙腈和體積濃度為0.01％的甲酸水溶液，梯度洗脫條件為在0min～40min，有機(jī)相在流動(dòng)相里的比例從10％升至85％；

二極管陣列檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)為190nm；

(4)結(jié)果解析

經(jīng)過(guò)測(cè)定后，對(duì)譜圖進(jìn)行分析，結(jié)果與實(shí)施例1相似，石斛酚在24.107min～24.352min，230nm～300nm處有最大吸收峰，得到石斛酚含量計(jì)算公式如下：y＝3.7653x+0.0481，y為濃度(μg/mL)、x為峰面積。

實(shí)施例3

一種檢測(cè)鐵皮石斛中石斛酚的方法，包括以下步驟：

(1)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

分別稱取石斛酚標(biāo)準(zhǔn)品，溶于色譜級(jí)甲醇中，渦旋60s，制成200μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；

(2)供試品溶液的配制

稱取0.5g鐵皮石斛樣品，然后用體積濃度為70％的甲醇水溶液作為提取溶劑對(duì)鐵皮石斛樣品進(jìn)行提取，提取的具體過(guò)程為：按照0.5g/1.5ml的比例將鐵皮石斛樣品浸于甲醇水溶液中，然后在60℃的溫度下超聲處理15min，再在5000rpm的轉(zhuǎn)速下離心處理18min，取上清液，重復(fù)以上過(guò)程4次，第一次超聲離心處理時(shí)，對(duì)浸于甲醇水溶液中的鐵皮石斛樣品進(jìn)行研磨處理，合并上清液，即為鐵皮石斛提取液，之后用氮?dú)鈱㈣F皮石斛提取液吹干，再?gòu)?fù)溶于500μL色譜級(jí)甲醇中，然后放置12小時(shí)，最后進(jìn)行過(guò)濾處理，過(guò)濾處理采用微孔濾膜過(guò)濾，濾膜的孔徑為0.35μm，所得的濾液即為供試品溶液；

(3)供試品溶液的測(cè)定

采用HPLC-DAD檢測(cè)方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)用的色譜條件為：色譜柱參數(shù)C18Column 250×4.6mm 5um，柱溫60℃，進(jìn)樣量50μL，流速1.0mL/min，流動(dòng)相為乙腈和體積濃度為0.06％的甲酸水溶液，梯度洗脫條件為在0min～40min，有機(jī)相在流動(dòng)相里的比例從20％升至90％；

二極管陣列檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)為400nm；

(4)結(jié)果解析

經(jīng)過(guò)測(cè)定后，對(duì)譜圖進(jìn)行分析，結(jié)果與實(shí)施例1相似，石斛酚在24.107min～24.352min，230nm～300nm處有最大吸收峰，得到石斛酚含量計(jì)算公式如下：y＝3.7649x+0.0481，y為濃度(μg/mL)、x為峰面積。

實(shí)施例4

精密度試驗(yàn)

取6份石斛酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，按實(shí)施例1的方法檢測(cè)石斛酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的中石斛酚含量，檢測(cè)結(jié)果見下表1。

表1

試驗(yàn)結(jié)論：6份石斛酚標(biāo)準(zhǔn)溶液含量的RSD為1.2％，表明本發(fā)明有較好的精密度，符合GB/T 27404-2008質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》的要求【GB/T 27404-2008要求RSD(％)≤1.3％】。

實(shí)施例5

回收率試驗(yàn)

精密稱取6組樣品，每組樣品中有兩份等質(zhì)量的鐵皮石斛樣品，分別向6組樣品的中的其中一份鐵皮石斛樣品中加入石斛酚對(duì)照品，按實(shí)施例1的方法分別檢測(cè)6組石斛酚含量，計(jì)算每組的回收率，測(cè)得對(duì)照品投入量＝加標(biāo)樣品測(cè)得量－非加標(biāo)樣品測(cè)得量；回收率(％)＝測(cè)得對(duì)照品投入量/對(duì)照品實(shí)際投入量，檢測(cè)結(jié)果見下表2。

表2

試驗(yàn)結(jié)論：石斛酚加標(biāo)平均回收率為：96.408％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.32％，符合GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》的要求【GB/T 27404-2008要求回收率為95％～105％】

另外，對(duì)實(shí)施例2和3也分別進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果為實(shí)施例2的精密度為1.37，回收率為96.261％，實(shí)施例3的精密度為1.35，回收率為95.873％。

應(yīng)當(dāng)理解本文所述的例子和實(shí)施方式僅為了說(shuō)明，并不用于限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)它做出各種修改或變化，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。