本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及檢測血清中SPARC蛋白的物質(zhì)在制備篩查肝細(xì)胞癌試劑盒中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是常見的惡性腫瘤之一，有較高的發(fā)病率和死亡率，每年約650 000人死于HCC，且其發(fā)病率有增高的趨勢。該病多發(fā)于東南亞，其中約有50％以上發(fā)生于中國。肝細(xì)胞癌的發(fā)生情況是一個多因素、多階段的過程，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)慢性感染是重要的高危因素，有乙型肝炎背景的肝硬化(liver cirrhosis,LC)患者是可能發(fā)展為肝癌的高危人群。目前肝細(xì)胞癌5年生存率較差，肝細(xì)胞癌的早期篩查，尤其是肝硬化患者高危人群中篩查早期肝癌患者，及時采取治療措施，可提高繼發(fā)于乙型肝炎病毒感染的肝細(xì)胞癌患者的生存率。

目前HCC臨床診斷與病情監(jiān)測等仍主要依賴于B超等影像學(xué)檢查聯(lián)合血清標(biāo)志物甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)水平的檢測。而AFP作為目前HCC診斷和病情監(jiān)測一個最主要的生物標(biāo)志物，其靈敏度仍不理想。所以，尋找靈敏的肝細(xì)胞癌血清生物標(biāo)記物，尤其可應(yīng)用于AFP陰性的肝癌患者，對于診斷肝細(xì)胞癌非常重要。

SPARC蛋白是一種糖蛋白，通過與胞外基質(zhì)和細(xì)胞因子相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞生長。SPARC蛋白與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，有研究表明SPARC蛋白在HCC組織中過表達(dá)(Le Bail,B.et al.Osteonectin/SPARC is overexpressed in human hepatocellular carcinoma.J Pathol.1999)。然而每種蛋白在外周血和組織中表達(dá)水平的關(guān)系非常復(fù)雜，無法簡單地從組織中的表達(dá)水平推導(dǎo)出其在外周血中的表達(dá)水平，甚至有時候兩者的表達(dá)水平會完全相反。例如有研究報道liver carboxylesterase 1(CES1)蛋白在肝癌患者組織中顯著下調(diào)，而在肝癌患者血清中該蛋白顯著上調(diào)(Na,K.,et al.,Human liver carboxylesterase 1outperforms alpha-fetoprotein as biomarker to discriminate hepatocellular carcinoma from other liver diseases in Korean patients.Int J Cancer,2013)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是提供檢測血清或血漿中SPARC蛋白濃度的物質(zhì)的用途。

本發(fā)明提供的檢測血清或血漿中SPARC蛋白濃度的物質(zhì)在制備篩查或輔助診斷肝細(xì)胞癌產(chǎn)品中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供的檢測血清或血漿中SPARC蛋白濃度的物質(zhì)在制備篩查或輔助診斷甲胎蛋白陰性肝細(xì)胞癌產(chǎn)品中的應(yīng)用。

在本發(fā)明的一個實施例中，所述肝細(xì)胞癌具體為繼發(fā)于HBV感染的有肝硬化背景的肝細(xì)胞癌。

所述SPARC蛋白為人SPARC蛋白。

上述應(yīng)用中，所述檢測血清或血漿中SPARC蛋白濃度的物質(zhì)包括檢測血清或血漿中SPARC蛋白濃度所需的試劑和儀器。

上述應(yīng)用中，所述檢測血清或血漿中SPARC蛋白濃度所需的試劑包括SPARC蛋白抗體。

本發(fā)明第二個目的是提供檢測血清或血漿中SPARC濃度的物質(zhì)和檢測血清或血漿中甲胎蛋白濃度的物質(zhì)的用途。

本發(fā)明提供了檢測血清或血漿中SPARC濃度的物質(zhì)和檢測血清或血漿中甲胎蛋白濃度的物質(zhì)在制備篩查或輔助診斷肝細(xì)胞癌產(chǎn)品中的應(yīng)用。

上述應(yīng)用中，所述檢測血清或血漿中SPARC蛋白濃度的物質(zhì)包括檢測血清或血漿中SPARC蛋白濃度所需的試劑和儀器；

或，所述檢測血清或血漿中甲胎蛋白濃度的物質(zhì)包括檢測血清或血漿中甲胎蛋白濃度所需的試劑和儀器。

在本發(fā)明的一個實施例中，檢測血清或血漿中甲胎蛋白濃度所需的試劑為AFP化學(xué)發(fā)光法試劑盒，儀器為羅氏全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀。

上述應(yīng)用中，所述檢測血清或血漿中SPARC蛋白濃度所需的試劑包括SPARC蛋白抗體。

本發(fā)明第三個目的是提供一種篩查或輔助診斷肝細(xì)胞癌產(chǎn)品。

本發(fā)明提供的產(chǎn)品，其包括上述檢測血清或血漿中SPARC蛋白濃度的物質(zhì)。

在本發(fā)明的一個實施例中，所述用于檢測SPARC蛋白濃度的物質(zhì)為SPARC蛋白抗體，具體為ELISA所用SPARC抗體(R&D Systems公司，貨號：DSP00)。當(dāng)然，也可以為其它類型的抗體或是其它可用于檢測SPARC蛋白濃度的物質(zhì)。

在本發(fā)明中，所述產(chǎn)品的篩查或診斷對象是肝硬化(LC)患者或健康人。

在本發(fā)明的一個實施例中，所述肝硬化(LC)患者具體為HBV感染的肝硬化患者。

所述檢測SPARC蛋白濃度具體可為檢測人血清或血漿中的SPARC蛋白濃度。

本發(fā)明第四個目的是提供一種篩查或輔助診斷肝細(xì)胞癌產(chǎn)品。

本發(fā)明提供的產(chǎn)品，其包括上述檢測血清或血漿中SPARC蛋白濃度的物質(zhì)和上述檢測血清或血漿中甲胎蛋白濃度的物質(zhì)。

上述產(chǎn)品中，所述產(chǎn)品為試劑盒。

為了尋找肝細(xì)胞癌血清生物標(biāo)記物，發(fā)明人對AFP陰性肝癌患者的配對的腫瘤與癌旁組織間隙液進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)SPARC蛋白在肝癌患者腫瘤組織間隙液中顯著上調(diào)。因為組織間隙液是連接細(xì)胞內(nèi)液和循環(huán)體液的接口，該結(jié)果提示SPARC蛋白非常有可能從肝癌組織中通過組織間隙液分泌到血液中去。進(jìn)而檢測了該蛋白在臨床血清樣本中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其血清濃度在肝癌患者中顯著增高，提出SPARC蛋白可作為AFP陰性肝癌患者的血清診斷標(biāo)志物，且可與AFP聯(lián)合診斷肝癌。

實驗證明，血清SPARC蛋白可作為肝細(xì)胞癌(HCC)的腫瘤標(biāo)志物。當(dāng)以無癥狀的正常人作為篩查對象時，受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC)分析結(jié)果表明曲線下面積(Area Under roc Curve,AUC)達(dá)到0.89，靈敏度為82％、特異度為93％；在以LC患者為篩查對象的情況下，AUC＝0.73，靈敏度為62％、特異度為86％。SPARC蛋白用于診斷AFP陰性肝癌患者時，以正常人為篩查對象，AUC＝0.88，靈敏度為78％，特異度為93％；以LC患者為篩查對象，AUC＝0.72，靈敏度為61％，特異度為84％。SPARC蛋白還可與AFP聯(lián)合用于在LC患者中篩查或輔助診斷HCC。

附圖說明

圖1為正常組(N)、肝硬化患者組(LC)和肝癌患者組(HCC)血清中SPARC蛋白水平散點圖。

圖2為正常組(N)、肝硬化患者組(LC)和肝癌患者組(HCC)血清中SPARC蛋白水平的ROC曲線分析結(jié)果。

圖3為正常組(N)、AFP陰性肝硬化患者組(LC)和AFP陰性肝癌患者組(HCC)血清中SAPRC蛋白水平的ROC曲線分析結(jié)果。

圖4為肝硬化患者組(LC)和肝癌患者組(HCC)SPARC與AFP聯(lián)合診斷的ROC曲線分析結(jié)果。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例中所涉及的名詞解釋：

受試者工作特征(receiver(relative)operating characteristic,ROC)曲線反映了靈敏度與特異度間的平衡，ROC曲線下面積是重要的試驗準(zhǔn)確度指標(biāo)。分別計算各個試驗的ROC曲線下的面積(AUC)進(jìn)行比較，面積大者，試驗的診斷價值大。

靈敏度(真陽性率)：實際有病而按試驗標(biāo)準(zhǔn)被正確判斷為有病的百分率，靈敏度越大越好，理想靈敏度為100％。

特異度(真陰性率)：實際無病而按試驗標(biāo)準(zhǔn)被正確判斷為無病的百分率，特異度越大越好，理想特異度100％。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1、血清中SPARC蛋白與HCC病人的關(guān)系

一、實驗材料

血清樣本來自：

正常組：正常人(N)30例；

LC患者組：有HBV慢性感染背景的肝硬化患者(未轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞癌，LC)35例；

HCC患者組：有HBV慢性感染背景的肝細(xì)胞癌患者(HCC)50例(其中23例為APF陰性)。

其中，正常人血清來自健康體檢者；肝硬化患者和肝細(xì)胞癌患者均為臨床確診病人的血清樣本。

二、血清中SPARC蛋白與HCC病人的關(guān)系

對上述一的血清樣本中的SPARC蛋白水平進(jìn)行ELISA檢測，所用試劑盒為R&D Systems公司SPARC ELISA檢測試劑盒(貨號：DSP00)，具體方法如下：

1、用稀釋液(試劑盒中配備dilution buffer)1：40稀釋血清樣本，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋梯度50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.13ng/ml、1.56ng/ml、0ng/ml，血清樣本和標(biāo)準(zhǔn)品各100ul加入到包有一抗的96孔板(試劑盒配備)中，室溫孵育3小時。

2、用洗液(試劑盒中配備wash buffer)洗6次，每孔350微升，每次1分鐘。

3、每孔加入200微升SPARC二抗(試劑盒中自帶)，4度孵育1小時。

4、用洗液洗6次，每孔350微升，每次1分鐘。

5、每孔加入200微升顯示底物(試劑盒中配備substrate solution)，室溫避光孵育30分鐘。

6、每孔加50微升終止液(試劑盒中配備stop solution)。

7、450nm波長讀數(shù)。

8、通過SPARC標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度和其對應(yīng)的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過各孔血清樣本所測得的OD值，利用Excel軟件對SPARC的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行擬合，計算各血清樣本中SPARC蛋白的含量。

9、用SPSS 16.0軟件分別對健康的正常人(N)和肝細(xì)胞癌患者(HCC)、肝硬化患者(LC)和肝細(xì)胞癌患者(HCC)血清中SPARC蛋白水平進(jìn)行ROC曲線分析，并對肝硬化患者(LC)和肝細(xì)胞癌患者(HCC)進(jìn)行AFP與SPARC聯(lián)合診斷ROC曲線分析。

SPARC蛋白表達(dá)水平在正常組、LC患者組、HCC患者組的血清樣本中的ELISA檢測結(jié)果：正常組SPARC蛋白的濃度平均值±標(biāo)準(zhǔn)差為72.77±51.79ng/ml，LC患者組為165.54±88.47ng/ml，HCC患者組為319.00±192.66ng/ml。對各組樣本中SPARC蛋白含量進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析(Mann-Whitney test)，發(fā)現(xiàn)血清SPARC蛋白在正常組和HCC患者組(p<0.0001)以及LC患者組和HCC患者組(p＝0.0002)均有顯著性差異(圖1)。

以正常組為對照組，HCC患者組為疾病組，對血清中SPARC蛋白水平進(jìn)行ROC曲線分析，曲線下面積AUC＝0.89(如圖2中A所示)，靈敏度為82％、特異度為93％；以LC患者組為對照組，HCC患者組為疾病組，AUC＝0.73(如圖2中B所示)，靈敏度為62％、特異度為86％。

由上述結(jié)果可知，血清中SPARC蛋白可用作正常人與HCC患者、以及LC與HCC患者進(jìn)行判別診斷的潛在標(biāo)志物。

進(jìn)行正常人和HCC患者的判別診斷時，若待測人血清中SPARC蛋白濃度大于等于130.72ng/ml，則該待測人為或候選為HCC患者。

進(jìn)行LC患者和HCC患者的判別診斷時，若待測人血清中SPARC蛋白濃度大于等于261.80ng/ml，則該待測人為或候選為HCC患者。

上述兩個判別診斷的濃度閾值為ROC曲線的最大約登指數(shù)對應(yīng)的閾值，以正常人和HCC患者的判別診斷為例，約登指數(shù)及對應(yīng)閾值詳見表1(最大約登指數(shù)及對應(yīng)閾值粗體標(biāo)注)。

表1以正常組為對照組的閾值、靈敏度、特異度及約登指數(shù)

三、血清中SPARC蛋白在檢測AFP陰性的HCC患者中的應(yīng)用

將上述一中的正常人、有HBV慢性感染背景的17例AFP陰性的肝硬化(LC)和23例AFP陰性的肝細(xì)胞癌(HCC)患者血清樣本按照上述二的方法檢測。

結(jié)果正常組SPARC蛋白的血清濃度平均值±標(biāo)準(zhǔn)差為72.77±51.79ng/ml，17例AFP陰性的LC患者組為152.25±94.30ng/ml，23例AFP陰性的HCC患者組為308.62±196.04ng/ml。

以AFP陰性(AFP<20ng/ml)的HCC患者組為疾病組，正常組為對照組，對血清中SPARC蛋白水平進(jìn)行ROC曲線分析，曲線下面積AUC＝0.88(圖3A)，靈敏度為78％，特異度為93％。以AFP陰性的HCC患者組為疾病組，AFP陰性肝硬化患者組為對照組，對血清中SPARC蛋白水平進(jìn)行ROC曲線分析，曲線下面積AUC＝0.72(圖3B)，靈敏度為61％，特異度為84％。說明SPARC蛋白可用于判別診斷AFP陰性的肝癌患者。

進(jìn)行正常人和AFP陰性的HCC患者的判別診斷時，若待測人血清中SPARC蛋白濃度大于等于136.18ng/ml，則該待測人為或候選為HCC患者。

進(jìn)行AFP陰性的LC患者與AFP陰性的HCC患者的判別診斷時，若待測人血清中SPARC蛋白濃度大于等于247.36ng/ml，則該待測人為或候選為HCC患者。

上述兩個判別診斷的濃度閾值為ROC曲線的最大約登指數(shù)對應(yīng)的閾值。

四、SPARC蛋白和AFP蛋白在檢測HCC患者中的應(yīng)用

AFP血清蛋白濃度檢測方法：使用羅氏全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，利用AFP化學(xué)發(fā)光法試劑盒檢測，詳細(xì)步驟參照儀器說明書。

正常組AFP蛋白的血清濃度均小于20ng/ml，LC患者組為2260.6±12582.0ng/ml，HCC患者組為13626.6±47251.9ng/ml。SPARC蛋白濃度在正常組、LC患者組、HCC患者組的血清樣本中的ELISA檢測結(jié)果：正常組SPARC蛋白的濃度平均值±標(biāo)準(zhǔn)差為72.77±51.79ng/ml，LC患者組為165.54±88.47ng/ml，HCC患者組為319.00±192.66ng/ml。

對各組樣本中SPARC蛋白和AFP蛋白濃度進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析(Mann-Whitney test)，發(fā)現(xiàn)血清SPARC蛋白和AFP蛋白濃度在正常組和HCC患者組(p<0.0001)以及LC患者組和HCC患者組(p＝0.0002)均有顯著性差異。

共同判斷SPARC蛋白和AFP蛋白的標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)二元Logistic回歸計算結(jié)果，區(qū)分HCC與正常組具體計算公式為：P＝1/(1+e-^{(-2.415+0.018*SPARC+0.002*AFP)})，當(dāng)p大于等于0.643時，判斷為HCC；區(qū)分HCC與LC的計算公式為：P＝1/(1+e-^{(-1.498+0.008*SPARC+0.000016*AFP)})，當(dāng)p大于等于0.633時，判斷為HCC。

用SPSS 16.0軟件分別對正常人(N)和肝細(xì)胞癌患者(HCC)、肝硬化(LC)和肝細(xì)胞癌患者(HCC)進(jìn)行AFP與SPARC聯(lián)合使用診斷HCC的ROC曲線分析。

以正常組為對照組，HCC患者組為疾病組，血清SPARC蛋白與AFP蛋白聯(lián)合使用判別診斷HCC患者的曲線下面積AUC＝0.93(如圖4中A所示)，靈敏度為86％、特異度為97％；以LC患者組為對照組，HCC患者組為疾病組，兩者聯(lián)合使用判別診斷HCC患者的AUC＝0.78(如圖4中B所示)，靈敏度為67％、特異度為84％。

由上述結(jié)果可知，血清中SPARC蛋白和AFP蛋白可用作正常人與HCC患者、以及LC與HCC患者進(jìn)行判別診斷的潛在標(biāo)志物。

上述結(jié)果匯總于表2和表3，展示了SPARC蛋白、AFP蛋白及其聯(lián)合應(yīng)用用于肝細(xì)胞癌患者與正常人或LC患者鑒別診斷的效果。

表2 SPARC蛋白和AFP蛋白判別診斷正常人和肝細(xì)胞癌患者效果比較(SPARC或SPARC與AFP聯(lián)合使用效果優(yōu)于AFP)

表3 SPARC蛋白和AFP蛋白判別診斷肝硬化和肝細(xì)胞癌患者效果比較(SPARC或SPARC與AFP聯(lián)合使用效果優(yōu)于AFP)

由上述結(jié)果可知，血清中SPARC蛋白可用作正常人與HCC患者、以及LC與HCC患者進(jìn)行判別診斷的潛在標(biāo)志物。

序列表

<110>北京蛋白質(zhì)組研究中心

<120>檢測血清中SPARC蛋白的物質(zhì)在制備篩查肝細(xì)胞癌試劑盒中的應(yīng)用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 303

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 1

Met Arg Ala Trp Ile Phe Phe Leu Leu Cys Leu Ala Gly Arg Ala Leu

1 5 10 15

Ala Ala Pro Gln Gln Glu Ala Leu Pro Asp Glu Thr Glu Val Val Glu

20 25 30

Glu Thr Val Ala Glu Val Thr Glu Val Ser Val Gly Ala Asn Pro Val

35 40 45

Gln Val Glu Val Gly Glu Phe Asp Asp Gly Ala Glu Glu Thr Glu Glu

50 55 60

Glu Val Val Ala Glu Asn Pro Cys Gln Asn His His Cys Lys His Gly

65 70 75 80

Lys Val Cys Glu Leu Asp Glu Asn Asn Thr Pro Met Cys Val Cys Gln

85 90 95

Asp Pro Thr Ser Cys Pro Ala Pro Ile Gly Glu Phe Glu Lys Val Cys

100 105 110

Ser Asn Asp Asn Lys Thr Phe Asp Ser Ser Cys His Phe Phe Ala Thr

115 120 125

Lys Cys Thr Leu Glu Gly Thr Lys Lys Gly His Lys Leu His Leu Asp

130 135 140

Tyr Ile Gly Pro Cys Lys Tyr Ile Pro Pro Cys Leu Asp Ser Glu Leu

145 150 155 160

Thr Glu Phe Pro Leu Arg Met Arg Asp Trp Leu Lys Asn Val Leu Val

165 170 175

Thr Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Asp Asn Asn Leu Leu Thr Glu Lys Gln

180 185 190

Lys Leu Arg Val Lys Lys Ile His Glu Asn Glu Lys Arg Leu Glu Ala

195 200 205

Gly Asp His Pro Val Glu Leu Leu Ala Arg Asp Phe Glu Lys Asn Tyr

210 215 220

Asn Met Tyr Ile Phe Pro Val His Trp Gln Phe Gly Gln Leu Asp Gln

225 230 235 240

His Pro Ile Asp Gly Tyr Leu Ser His Thr Glu Leu Ala Pro Leu Arg

245 250 255

Ala Pro Leu Ile Pro Met Glu His Cys Thr Thr Arg Phe Phe Glu Thr

260 265 270

Cys Asp Leu Asp Asn Asp Lys Tyr Ile Ala Leu Asp Glu Trp Ala Gly

275 280 285

Cys Phe Gly Ile Lys Gln Lys Asp Ile Asp Lys Asp Leu Val Ile

290 295 300