本發(fā)明屬于疫苗效果檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬瘟基因工程亞單位疫苗的效力檢驗方法。
背景技術(shù)：
豬瘟(CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的一種豬的高度接觸性傳染病，死亡率極高，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。豬瘟已被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為家畜A類傳染病，我國也將其列為一類動物疫病。臨床以稽留高燒、皮膚和黏膜出現(xiàn)大量出血點為特征。多年的實踐經(jīng)驗證明，疫苗接種是預防和控制動物疫病的主要手段。20世紀60年代，我國研制出經(jīng)人工誘變獲得的豬瘟兔化弱毒株(又稱C株)疫苗在CSFV防控中起到了決定性作用，有效的控制了豬瘟在我國乃至世界范圍內(nèi)大規(guī)模的流行。豬瘟C株弱毒疫苗是目前國內(nèi)外廣泛使用的疫苗，其安全性和免疫效力已被社會認可，但其受母源抗體干擾，導致免疫失敗的現(xiàn)象時有報道，接種此弱毒疫苗產(chǎn)生的抗體無法與野毒感染產(chǎn)生的抗體相區(qū)分，給免疫的制訂和國家豬瘟防控凈化也帶來了巨大的挑戰(zhàn)，制約著我國生豬及豬肉制品在非免疫國家和地區(qū)的貿(mào)易發(fā)展。
在豬瘟活疫苗的研究基礎上，利用基因工程操作技術(shù)研制了新一代豬瘟基因工程亞單位疫苗。我們將CSFV E2基因抗原優(yōu)勢區(qū)(共596個氨基酸)整合到HEK-293細胞染色體基因組，獲得的了穩(wěn)定表達外源基因E2的HEK-293細胞株，該表達E2蛋白制備的亞單位疫苗提供的保護性和脾淋苗無差異，并且具有滅活疫苗的特征，能夠和疫苗毒與野毒感染相區(qū)分，同時能區(qū)分HEK-293-E2和脾淋苗(包括野毒)的鑒別診斷方法已經(jīng)建立。此疫苗一旦投入使用，不但可以通過抗體鑒別技術(shù)區(qū)分疫苗免疫動物和野毒感染動物，極大地促進CSFV的凈化或根除，可提高豬的存活率，增加豬的存欄量和出欄量，對豬肉市場上相關(guān)畜產(chǎn)品的供應和穩(wěn)定物價具有重要的意義。
疫苗效力是評價疫苗質(zhì)量的關(guān)鍵指標，但是過去一直沒有有效的對豬瘟基因工程亞單位疫苗進行效力檢測的方法。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種豬瘟基因工程亞單位疫苗效力檢驗的方法，從而彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足。
本發(fā)明的方法，是用待檢測的豬瘟基因工程亞單位疫苗免疫家兔，免疫21日齡后ELISA檢測豬瘟病毒抗體水平或采用豬瘟脾淋苗靜脈注射進行攻毒，當免疫兔至少4/5的豬瘟病毒抗體阻斷率S/P≥60％或攻毒后至少4/5兔體無定型熱反應，即可判為合格。
其一種具體操作方法，包括如下的步驟：
1)分組及免疫接種：
選取體重為1.5～3kg健康易感家兔，從中挑選體溫波動不大的隨機分組，采用豬瘟脾淋毒作為陽性對照組和未免疫接種作為陰性對照組，而在實驗組中接種待檢測的豬瘟基因工程亞單位疫苗；
所述的豬瘟基因工程亞單位疫苗為HEK-293-E2疫苗；
2)豬瘟病毒ELISA抗體檢測
免疫后第21天，采集各組兔的血液，分離血清，檢測該疫苗免后21天豬瘟病毒抗體水平；
3)檢測結(jié)果判定：
當免疫兔至少4/5的豬瘟病毒抗體阻斷率S/P≥60％時，判定疫苗合格；
另一種操作方法，其步驟如下：
1)分組及免疫接種：
選取體重為1.5～3kg健康易感家兔，從中挑選體溫波動不大的隨機分組，采用豬瘟脾淋毒作為陽性對照組和未免疫接種作為陰性對照組，而在實驗組中接種待檢測的豬瘟基因工程亞單位疫苗；
所述的豬瘟基因工程亞單位疫苗為HEK-293-E2疫苗；
2)免疫后第21d攻毒實驗
用無菌生理鹽水將20頭份豬瘟脾淋毒稀釋成1頭份/ml，注射給每組家兔，攻毒劑量為lml/只，攻毒前2天和攻毒當天上下午各測體溫1次，24小時后，每隔6h測體溫1次，連續(xù)測5d至體溫恢復正常；
3)檢測結(jié)果判定：
至少4/5數(shù)量的注射組兔體無定型熱反應，即可判定疫苗效力為合格。
本發(fā)明的疫苗兔體效力檢驗方法不僅能夠檢驗豬瘟基因工程亞單位疫苗的保護效力，還更加穩(wěn)定、簡便、有效、節(jié)省時間和成本評價豬瘟基因工程亞單位疫苗的效力，彌補了現(xiàn)有技術(shù)的不足，對后期的大規(guī)模生產(chǎn)培養(yǎng)工藝優(yōu)化具有積極的評價指導作用，更有利于指導豬瘟基因工程亞單位疫苗產(chǎn)品的臨床應用，具有廣闊的市場應用前景。
具體實施方式
申請人利用豬瘟脾淋苗能夠感染兔子引起兔體反應熱這一特性，建立了一種用兔體檢驗豬瘟基因公測很難過亞單位疫苗效力的方法，保證了豬瘟基因工程亞單位疫苗效力評價的簡便性和穩(wěn)定性，同時大大節(jié)省了檢驗成本。該方法用小動物兔子代替了大動物豬，大大節(jié)省了生產(chǎn)檢驗成本；而且該檢驗方法使用的兔子均為SPF兔，其生產(chǎn)性能和質(zhì)量標準較豬更加穩(wěn)定，可以進行疫苗生產(chǎn)質(zhì)量評價應用。
實施例1：兔體效力檢驗模型方法設計及步驟
1材料
1.1疫苗豬瘟基因工程亞單位疫苗(HEK-293-E2)，批號201403，由青島易邦生物工程有限公司生產(chǎn)；豬瘟脾淋苗，批號201401批，20頭份/ml，有效期至2015年6月，由青島易邦生物工程有限公司生產(chǎn)。
1.2試驗動物1.5～3.0kg SPF家兔購自青島康大兔業(yè)生物科技有限公司。
1.4試劑盒豬瘟ELISA抗體檢測試劑盒，購自IDEXX公司。
1.5體溫計購自上海鹿得醫(yī)療器械貿(mào)易有限公司。
2試驗設計
2.1分組及免疫接種方法選取體重為1.5～3kg健康易感家兔30只，購回后第3d，每隔6h測溫1次，連續(xù)測3次，從30只兔子中挑選體溫波動不大的25只，隨機分成5組，每組5只，采用豬瘟脾淋毒作為陽性對照組和未免疫接種作為陰性對照組，按照下表1的方法進行免疫接種；自接種后第1d連續(xù)測3d。
表1疫苗免疫接種方法
2.2豬瘟病毒ELISA抗體檢測
免疫后第21天，采集各組兔的血液，分離血清，按照豬瘟ELISA抗體檢測試劑盒說明書，檢測該疫苗免后21天豬瘟病毒抗體水平。
2.3攻毒試驗
免疫后第21d攻毒，用無菌生理鹽水將20頭份豬瘟脾淋毒稀釋成1頭份/ml，通過耳靜脈注射給每組家兔，攻毒劑量為lml/只，攻毒前2天和攻毒當天上下午各測體溫1次，24小時后，每隔6h測體溫1次，連續(xù)測5d至體溫恢復正常。
3結(jié)果
3.1兔體效力檢驗方法結(jié)果
3.1.1兔體免疫前、后體溫測定結(jié)果
按照2.1.1的方法進行實際測溫，將實際測溫情況繪制表格，從表3所測結(jié)果中可以看出，免疫前各組家兔體溫波動不大；用HEK-293-E2(0.05、0.1、0.2ml/只)免疫組家兔體溫在正常范圍內(nèi)，用豬瘟脾淋苗家兔出現(xiàn)兔體反應熱(≥40.5℃)與常規(guī)豬瘟脾淋苗檢測結(jié)果一致。詳見表3。
3.1.2HEK-293-E2免疫家兔后ELISA豬瘟抗體檢測結(jié)果
免疫第7、14、21天，采集的各組免疫兔血清ELISA檢測豬瘟病毒抗體，將實際抗體檢測情況繪制表格。從表格4可以看出，HEK-293-E2免后21日，0.05ml/只免疫組抗體陽性率為3/5；0.1ml/只、0.2ml/只和豬瘟脾淋苗免疫組抗體陽性率均為5/5；未免疫對照組抗體陽性率為0/5。詳見表4。
3.1.3攻毒前、后體溫測定結(jié)果
免疫第21天后，各組兔子用豬瘟脾淋苗進行攻毒，將實際測溫情況繪制表格，從所測結(jié)果表5可以看出，攻毒前各組免疫兔體溫在正常波動范圍內(nèi)(＜40.5℃)，攻毒后0.2ml免疫組(0/5)、0.1ml免疫組(0/5)和豬瘟脾淋苗組(0/5)均未出現(xiàn)定型熱反應，0.05ml免疫組(2/5)出現(xiàn)定型熱反應，未免疫對照組(5/5)出現(xiàn)定型熱反應。詳見表5。
表4免疫兔血清豬瘟病毒抗體ELISA檢測結(jié)果
注“+”表示抗體陽性；“±”表示抗體可疑；“-”表示抗體陰性。
實施例2豬體效力檢驗方法設計及步驟
1材料
1.1疫苗豬瘟基因工程亞單位疫苗(HEK-293-E2)，批號201403，由青島易邦生物工程有限公司生產(chǎn)；豬瘟脾淋苗，批號201401批，20頭份/ml，有效期至2015年6月，由青島易邦生物工程有限公司生產(chǎn)。
1.2試驗動物2～5周齡健康易感仔豬，購于青島平度勝利種豬場。
1.3攻毒毒株豬瘟石門系血毒，原始毒種購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，由青島易邦生物工程有限公司擴繁、鑒定、提供。
1.4試劑盒豬瘟ELISA抗體檢測試劑盒，購自IDEXX公司。
1.5體溫計購自上海鹿得醫(yī)療器械貿(mào)易有限公司。
2試驗方法
2.1分組及免疫接種方法選取2～5周齡健康斷奶仔豬30頭，購回后第3d上下午，各測溫1次，連續(xù)測3d，從30頭豬中挑選體溫波動不大的25頭，隨機分成5組，每組5頭，采用豬瘟脾淋毒作為陽性對照組和未免疫接種作為陰性對照組，按照下表2的方法進行免疫接種；同時上下午各測體溫1次，連續(xù)測16d。
表2疫苗免疫接種方法
2.2豬瘟病毒ELISA抗體檢測
分別于免前、首免第14、21天及二免后第7、14天，采集各組豬的血液，分離血清，按照豬瘟ELISA抗體檢測試劑盒說明書，檢測該疫苗免后豬瘟病毒抗體水平。
2.3攻毒試驗
二免后14d攻毒，用豬瘟石門系強毒按照105LD50最小致死劑量/ml/頭，通過頸部肌肉注射每組豬，攻毒劑量為lml/頭，攻毒前2天和攻毒當天上下午各測體溫1次，24小時后，每隔6h測體溫1次，連續(xù)測16d。
3豬體效力檢驗方法結(jié)果
3.1豬體免疫前、后體溫測定結(jié)果
按照2.2.1的方法進行實際測溫，將實際測溫情況繪制表格，從表6所測結(jié)果中可以看出，免疫前各組豬體溫波動不大；用HEK-293-E2(0.05、0.1、0.2ml/只)和豬瘟脾淋苗免疫組豬體溫均在正常范圍內(nèi)(＜40.5℃)，與常規(guī)豬瘟脾淋苗檢測結(jié)果一致。
3.2HEK-293-E2免疫豬后ELISA豬瘟抗體檢測結(jié)果
分別于免前、首免第14、21天及二免后7、14天，采集的各組免疫豬血清ELISA檢測豬瘟病毒抗體，將實際抗體檢測情況繪制表格，從表格7可以看出，
3.3豬體攻毒前、后體溫測定結(jié)果
二免后第14天后，各組豬用豬瘟石門系血毒進行攻毒，按照105LD50最小致死劑量/ml/頭，將攻毒前后實際測溫情況繪制表格，從所測結(jié)果表5可以看出，攻毒前2天各組免疫豬體溫在正常波動范圍內(nèi)(＜40.5℃)，攻毒后0.25ml免疫組(4/5)、0.5ml免疫組(5/5)和豬瘟脾淋苗組(0/5)均未出現(xiàn)熱反應，0.125ml免疫組(1/5)出現(xiàn)熱反應，未免疫對照組(5/5)出現(xiàn)熱反應。詳見表8。
表6免疫前后實際測溫結(jié)果
表7免疫豬血清豬瘟病毒抗體ELISA檢測結(jié)果
注“+”表示抗體陽性；“±”表示抗體可疑；“-”表示抗體陰性。
實施例3結(jié)果分析
1HEK-293-E2兔檢驗抗體水平與攻毒保護結(jié)果相關(guān)性分析
從HEK-293-E2免后21天的抗體水平與攻毒后定型熱反應測定結(jié)果可以看出,未免疫陰性對照組和HEK-293-E2免疫(抗體阻斷率S/P值≤34.7％)在攻毒后均出現(xiàn)定型熱反應，豬瘟脾淋苗陽性對照組(抗體阻斷率S/P≥60.7％)在攻毒后均未出現(xiàn)定型熱反應。HEK-293-E2免疫兔能產(chǎn)生豬瘟病毒E2蛋白特異性抗體，且與免疫劑量呈正相關(guān)；抗體阻斷率(S/P值)≥59.6％的豬在攻毒后均未出現(xiàn)定型熱反應，表明能夠抵抗豬瘟脾淋毒的攻擊，攻毒保護與抗體水平呈明顯正相關(guān)。詳見表4、表5。
2HEK-293-E2豬檢驗抗體水平與攻毒保護結(jié)果相關(guān)性分析
從HEK-293-E2免后21天的抗體水平與攻毒后出現(xiàn)高熱反應測定結(jié)果可以看出,未免疫陰性對照組和HEK-293-E2免疫(抗體阻斷率S/P值＜34.7％)在攻毒后均出現(xiàn)高熱反應；豬瘟脾淋苗陽性對照組(抗體阻斷率S/P≥60.7％)在攻毒后均未出現(xiàn)高熱反應。HEK-293-E2免疫豬產(chǎn)生豬瘟病毒E2蛋白特異性抗體，且與免疫劑量呈正相關(guān)；抗體阻斷率(S/P值)≥68.0％在攻毒后均未出現(xiàn)高熱反應，表明能夠抵抗豬瘟石門系強毒的攻擊，攻毒保護與抗體水平呈明顯正相關(guān)。詳見表7、表8。
3兔檢驗和豬檢驗結(jié)果的相關(guān)性分析
根據(jù)4.1兔檢驗分析的結(jié)果，免疫兔豬瘟抗體水平(S/P值≥59.6％)攻毒后保護，兔的最小免疫保護劑量為0.1ml/只；根據(jù)4.2豬檢驗分析的結(jié)果，免疫豬豬瘟抗體水平(S/P值≥68.0％)攻毒后保護，豬的最小免疫保護劑量為0.125ml/頭。
本研究建立的豬瘟基因工程亞單位疫苗兔體效力檢驗模型方法和標準：采用0.2ml作為疫苗免疫最小保護劑量(兔和豬均能達到保護)，免疫1.5～3.0kg家兔，免后21日齡ELISA檢測豬瘟病毒抗體水平或采用豬瘟脾淋苗靜脈注射進行攻毒，當免疫兔至少4/5的豬瘟病毒抗體阻斷率S/P≥60％或攻毒后至少4/5兔體無定型熱反應，即可判為合格。
根據(jù)中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程(2000版)和中華人民共和國獸藥典(2010年版)規(guī)定現(xiàn)行的豬瘟疫苗效力檢驗主要依靠家兔或豬進行動物試驗。因用豬進行檢驗成本太高、不易操作、耗時長，并且涉及豬瘟石門系強毒攻毒的生物安全風險問題，故在生產(chǎn)實際中多采用兔體定型熱反應，兔檢驗法中兔易獲取、生產(chǎn)性能穩(wěn)定、無豬瘟病毒等外源病毒干擾，采用豬瘟弱毒疫苗攻毒生物安全風險低。同時，根據(jù)國家有關(guān)政策規(guī)定，能夠用實驗動物替代本動物的研究盡量不使用本動物的原則，本試驗通過比較HEK-293-E2家兔效力檢驗體溫反應熱與ELISA抗體檢測結(jié)果的相關(guān)性，給出了兩種方法任選其一用于家兔效力檢驗的可行性，提高了檢測結(jié)果的可靠性和可重復性。
該疫苗兔體效力檢驗模型方法和標準替代靶動物豬的檢驗方法，不僅能夠檢驗HEK-293-E2的保護效力，還更加穩(wěn)定、簡便、有效、節(jié)省時間和成本評價豬瘟基因工程亞單位疫苗的效力，彌補了現(xiàn)有技術(shù)的不足，對后期的大規(guī)模生產(chǎn)培養(yǎng)工藝優(yōu)化具有積極的評價指導作用，更有利于指導HEK-293-E2產(chǎn)品的臨床應用，具有廣闊的市場應用前景。