本發(fā)明涉及一種藥物的篩選方法，具體涉及一種篩選效率高，基于磁珠分離的抗黑色素生成的藥物篩選方法。

背景技術：

皮膚的黑白主要取決于黑色素細胞合成黑色素的能力。在人的表皮基底層細胞間，分布著黑色素細胞，它含有的酪氨酸酶可以將酪氨酸氧化成多糖，中間再經過一系列的代謝過程，最后便可生成黑色素。黑色素生成越多，皮膚就越黝黑；反之，則皮膚就越白皙。

酪氨酸酶具有獨特的雙重催化功能，是生物體內黑色素合成的關鍵酶，與人的衰老有密切關系。其異常過量表達可導致人體的色素沉著性疾病。酪氨酸酶抑制劑可以治療目前常見的色素沉著性皮膚病如雀斑、黃褐斑、老年斑。市場上流行的美白化妝品中的熊果苷、維生素C衍生物、曲酸及其衍生物、綠茶提取物、甘草提取物等中藥提取物等均為酪氨酸酶抑制劑，主要是通過抑制酪氨酸酶的活性而達到抑制黑色素合成，進而發(fā)揮美白的作用。

很多藥物篩選系統(tǒng)是基于熒光的在線或離線高通量篩選，盡管靈敏度高、選擇性好，但是建立熒光篩選系統(tǒng)需要的時間較長，因為必須選擇合適的熒光報告分子，這項工作成本高、耗時長，其次是熒光信號只代表了化合物的親和性，沒有化合物的化學信息，而化合物庫中所含的雜質和降解產物經常呈現(xiàn)假陽性。近年來，使用質譜檢測同時獲得化學和生物學信息的方法非常普遍，可以降低假陽性和假陰性。使用超濾膜把蛋白結合物與未結合的化合物分離開，再進行質譜檢測。這種方法會使很多未結合的化合物滯留在樣品中，膜材料與蛋白和化合物的非特異性結合也會影響實驗的準確性。另外有一種方法是把蛋白固定在柱子上作為固定相，使用洗脫溶劑把化合物按照與蛋白的結合強弱依次洗脫下來，但是所需要的洗脫溶劑與質譜的兼容性不好。還有一種方法是把蛋白固定在某種合適的載體上，與配體作用后，把不結合的部分洗脫掉，然后把結合配體洗脫出來。靶標蛋白可以共價形式固定在磁性顆粒表面，也可以通過His肽段以非共價的形式固定在非磁性硅材料上，后者適用的靶標范圍更廣。

表面結合官能團的順磁性顆粒原來是被用來純化蛋白的，如鍵合C8和C18可以分離肽段；鍵合單核苷酸可以研究DNA與藥物的相互作用；鍵合抗體可以選擇性分離所需的分析物或者干細胞。類似的，鍵合靶標蛋白可以用來篩選親和性配體。Wainer等首次把熱休克蛋白90α和人雌激素受體鍵合到了磁性材料上。Zhang等把酶固定在磁性顆粒上，對酶的抑制劑進行篩選。磁性材料的處理方法有手動和自動的液體處置系統(tǒng)、序列注射方法、微流控芯片設備。Lingeman等把人雌激素受體LBD結構域固定在磁珠上，建立了一個自動化的篩選系統(tǒng)。當然使用磁珠進行藥物篩選存在著一定的局限性，首先是由于蛋白與磁珠共價結合后會可能改變蛋白與化合物的結合性能，其次，這種方法自動化過程相當費時，需要對流速、管徑、壓力、蛋白-磁珠比等多個因素進行優(yōu)化。目前，選擇酪氨酸酶作為藥物靶標，通過應用磁珠鍵合技術，建立基于磁性分離的酪氨酸酶抑制劑篩選的方法尚無人報道。

技術實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：本發(fā)明的目的在于提供一種工藝設計合理，采用磁性分離和化學信息采集(液質聯(lián)用)技術，分析靶標蛋白結合物，用于抗黑色素生成藥物的篩選和評價，本發(fā)明提供的方法，篩選效率高，篩選準確度高，對于抗黑色素生成藥物的篩選具有重要應用價值。

技術方案，為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采取的技術方案為：

一種基于磁珠分離的抗黑色素生成的藥物篩選方法，其特征在于，包括以下步驟：取活化磁珠加入酪氨酸酶溶液，震蕩混合均勻，室溫孵育，應用化學鍵合技術在磁珠上鍵合酪氨酸酶得到酪氨酸酶鍵合磁珠，然后將未鍵合的酪氨酸酶分離，將酪氨酸酶鍵合磁珠和待篩選的藥物混合、孵育；孵育結束后先用PBS緩沖液清洗，再用變性清洗液進行變性洗脫，然后對變性洗脫物進行液質分析，獲取靶標結合物的相關信息，篩選出具有抗黑色素生成作用的成分。

作為優(yōu)選方案，以上所述的基于磁珠分離的抗黑色素生成的藥物篩選方法，其特征在于，變性清洗液為乙腈水溶液或甲醇水溶液。

作為優(yōu)選方案，以上所述的基于磁珠分離的抗黑色素生成的藥物篩選方法，其特征在于，孵育結束后先用PBS緩沖液清洗4次，變性清洗液為體積濃度10％的乙腈水溶液。

作為優(yōu)選方案，以上所述的基于磁珠分離的抗黑色素生成的藥物篩選方法，其特征在于，將酪氨酸酶鍵合磁珠和待篩選的藥物在溫度為34.84℃，離子強度為193.67mM，pH為6.98條件下孵育30min。

一種基于磁珠分離的抗黑色素生成的藥物篩選方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)取一定體積磁珠，使用等體積的25mM MES緩沖溶液清洗2～3次，每次次10～15min，清洗后，加入等體積的50mg/ml EDC溶液和50mg/ml NHS溶液，混合均勻，在室溫下緩慢震蕩孵育，孵育后，放在磁鐵上4～6min，移除上清液，再使用25mM的MES緩沖溶清洗，得到活化磁珠，備用；

(2)取步驟(1)得到的活化磁珠，加入酪氨酸酶溶液，震蕩混合均勻，室溫下孵育，孵育后，放在磁珠上4～6min，移除鍵合剩下的上清液，得到酪氨酸酶鍵合磁珠；

(3)取芍藥苷，加入步驟(3)制備得到的酪氨酸酶鍵合磁珠，加入PBS緩沖液，放在振蕩器上混勻，在34.84℃，離子強度為193.67mM，pH為6.98條件下孵育30min，然后放在磁鐵上，使鍵合磁珠與溶液分開，先用PBS緩沖液清洗4次，再用10％乙腈的水溶液變性洗脫，變性洗脫液進行液質分析。

作為優(yōu)選方案，以上所述的一種基于磁珠分離的抗黑色素生成的藥物篩選方法，其特征在于，液質分析的液質參數(shù)為ESI負離子模式。

以上所述的一種基于磁珠分離的抗黑色素生成的藥物篩選方法，液相條件為:XBridge C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流動相A相為0.1％甲酸水–B相為乙腈，梯度洗脫：0min，10％B；10min，15％B；25min，30％B；60min，100％B，流速1.0mL·min^-1，柱溫30℃，進樣體積5μL。質譜條件:負離子模式，毛細管溫度325℃，離子源電壓－4.5kV噴霧氣壓379.21kPa，去簇電壓－60V，加熱氣壓379.21kPa，離子源溫度550℃，一級質譜掃描范圍m/z100-1500，二級質譜激活類型CID。

有益效果：本發(fā)明提供的基于磁珠分離的抗黑色素生成的藥物篩選方法具有以下優(yōu)點：

本發(fā)明提供的基于磁珠分離的抗黑色素生成的藥物篩選方法工藝設計合理，通過大量實驗篩選出最佳的孵育溫度、孵育時間、孵育時溶液的pH和離子強度和變性清洗液。

本發(fā)明主要應用于篩選和評價天然產物以及化學合成藥物中抗黑色素生成物質。與傳統(tǒng)篩選方法相比，可顯著提高篩選效率、縮短篩選時間，并且能夠發(fā)現(xiàn)化合物之間的協(xié)同效應。同時，本篩選方法具有快速、準確、重現(xiàn)性好等特征。

附圖說明

圖1為磁珠表面鍵合蛋白的定量結果圖。

圖2為孵育時間的優(yōu)化結果圖。

圖3為不同pH、離子強度和反應溫度下孵育的3D響應面分析結果圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步闡明本發(fā)明，應理解這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領域技術人員對本發(fā)明的各種等價形式的修改均落于本申請所附權利要求所限定的范圍。

以下實施例所用試劑：

酪氨酸酶(蘑菇，EC:1.14.18.1，sigma)、芍藥苷(成都瑞芬思生物技術有限公司)、磁珠(天津倍思樂色譜技術開發(fā)中心)、1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC，sigma)、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES，sigma)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS，sigma)。

實施例所用儀器：AB Sciex 5600Q-TOF高分辨質譜儀(AB Sciex公司)

實施例1酪氨酸酶鍵合磁珠的制備

取一定體積磁珠，使用等體積的25mM MES(pH 6)溶液清洗兩次，兩次10min，在清洗后的磁珠上加入等體積的新鮮配制的EDC溶液和NHS溶液(50mg/ml)，混合均勻，在室溫下緩慢震蕩孵育30min。孵育后，把管子放在磁鐵上4min，移除上清液，最后使用25mM MES(pH 6)溶液清洗兩次，備用。

分別取25、50、75、100、125、150μL活化磁珠各1份，加入100μL酪氨酸酶(1mg/ml)溶液，震蕩混合均勻，在室溫孵育過夜。孵育后，把管子放在磁珠上4min，移除鍵合剩下的上清液，使用Bradford法測定其中蛋白含量。鍵合磁珠加入100μL 0.5％BSA溶液震蕩15min后移去清洗液，使用Bradford法測定其中蛋白含量。

并使用X光譜衍射、透射電鏡、振動磁性測定儀、紅外、粒徑分布對酪氨酸酶鍵合磁珠和空白磁珠進行性狀表征。

X衍射的磁珠的主峰，如2.9706，2.5322，2.1008，1.7122，1.6146和1.4837，與標準Fe₃O₄XRD譜匹配。鍵合磁珠的最大飽和磁化程度(54.3emu·g^-1)比空白磁珠的最大飽和磁化程度(79.4emu·g^-1)小一些，因為在鍵合磁珠表面有酪氨酸酶包覆。

磁珠表面鍵合蛋白的定量結果：通過磁珠的數(shù)量不同，來確定酪氨酸酶結合療效與酪氨酸酶恒定量的最優(yōu)比例。如圖1所示，恒定酪氨酸酶的量為100μg，125μl磁珠鍵合率最高，達到99％。

磁珠的紅外光譜圖，酪氨酸酶的紅外光譜圖和酪氨酸酶鍵合磁珠的紅外光譜圖分析表明：酪氨酸酶與磁珠鍵合后在1653cm-¹出現(xiàn)的新的酰胺帶，說明通過酰胺鍵連接產生共軛。

以上結果說明本發(fā)明得到的酪氨酸酶鍵合磁珠符合要求。

實施例2基于磁珠分離的抗黑色素生成的藥物篩選方法的各因素研究

(1)以芍藥苷為模型藥物，對變性洗脫溶劑進行優(yōu)化

取取以上實施例1制備得到的20μL酪氨酸酶鍵合磁珠，加入芍藥苷對照品溶液20μL(0.1mg/ml)和160μLPBS緩沖液(pH7.4)混合，孵育30min，孵育完成后，用200μL PBS緩沖液清洗4次，洗脫液進液相分析，最后，分別以體積濃度10％、30％、50％、70％和90％乙腈-水溶液(v/v)及體積濃度10％、30％、50％、70％和90％甲醇-水溶液(v/v)進行變性洗脫，取變性洗脫液進行液相分析。

(2)以芍藥苷為模型藥物，對孵育時間進行優(yōu)化

取以上實施例1制備得到的20μL酪氨酸酶鍵合磁珠，加入芍藥苷對照品溶液20μL(0.1mg/ml)和160μL PBS緩沖液(pH7.4)混合，在10、20、30、45、60、70、80min后孵育，孵育完成后，用200μL PBS緩沖液清洗4次，再用50％乙腈-水溶液(v/v)進行變性清洗，取變性洗脫液進行液相分析。

(3)以芍藥苷為模型藥物，使用Box-Behnken實驗設計對孵育溫度、離子強度、pH同時進行優(yōu)化。

取實施例1制備得到的20μL酪氨酸酶鍵合磁珠，加入20μL芍藥苷對照品溶液(0.1mg/ml)和160μL PBS緩沖液混合，在不同溫度下孵育30min，孵育完成后，用200μL PBS緩沖液清洗4次，再用10％乙腈-水溶液(v/v)進行變性清洗，取變性洗脫液進行液相分析。具體參見表1。.

表1.Box-Behnken實驗設計表

(4)各因素篩選結果

(4.1)變性洗脫溶劑優(yōu)化結果

清洗的目的在于排除沒有鍵合或非特異性的化合物產生的干擾，本發(fā)明通過大量實驗對不同的清洗次數(shù)進行考察，結果表明，先用PBS緩沖液清洗4次可以足夠消除未鍵合的化合物。變性洗脫液可以將鍵合在磁珠上的酪氨酸酶清洗下來，結果表明，10％(v/v)乙腈—水洗脫溶劑洗脫效率優(yōu)于其它洗脫溶劑。

(4.2)孵育時間的優(yōu)化結果

孵育時間考察結果如圖2所示，30min的孵育時間后，酪氨酸酶的結合位點已經達到飽和，因此優(yōu)選孵育時間為30分鐘。

(4.3)孵育pH、離子強度和反應溫度的3D響應面分析結果

芍藥苷和酪氨酸酶鍵合磁珠的相互作用主要是靜電相互作用，離子強度和pH是影響靜電相互作用的主要因素。如圖3中的A所示，酪氨酸酶的等電點約為4.7，當溶液pH大于酪氨酸酶的等電點，酪氨酸酶鍵合磁珠表面帶負電荷，有利于與帶正電荷的芍藥苷(pKa11.52±0.70)相互作用。如圖3中的B所示，孵育溫度超過40℃會減少芍藥苷的峰面積。如圖3中的C所示，PBS的離子強度在255mM附近，芍藥苷峰面積較大。通過3D響應面分析，得到磁珠與酪氨酸酶的鍵合的最優(yōu)條件為：溫度為34.84℃，離子強度為193.67mM，pH為6.98。

實施例3三白湯成分中抗黑色素生成藥物的篩選

(1)取一定體積磁珠，使用等體積的25mM MES緩沖溶液清洗2次，每次次10min，清洗后，加入等體積的50mg/ml EDC溶液和50mg/ml NHS溶液，混合均勻，在室溫下緩慢震蕩孵育，孵育后，放在磁鐵上4min，移除上清液，再使用25mM的MES緩沖溶清洗，得到活化磁珠，備用；

(2)取步驟(1)得到的活化磁珠125μl，加入酪氨酸酶100μg，震蕩混合均勻，室溫下孵育，孵育后，放在磁珠上4min，移除鍵合剩下的上清液，得到酪氨酸酶鍵合磁珠；

(3)稱取5g白芍、5g白術、5g白茯苓和3g蜜炙甘草，加入150mL水，回流2h，過濾，濾液蒸干水分得粉末，取粉末配成20mg/mL，在13400rpm下離心10min，吸取上清液，備用。

取上清液20μL，加入步驟(2)制備得到的酪氨酸酶鍵合磁珠20μL，再加入160μL PBS緩沖液至200μL，放在振蕩器上混勻，孵育30min。然后放在磁鐵上，使磁珠與溶液分開，吸取溶液為wash1，在磁珠上再加入200μL PBS溶液，重復上述操作，吸取溶液為wash2，第三次清洗的吸取溶液為wash3，第四次清洗的吸取溶液為wash4。最后一次清洗使用含10％乙腈-水溶液，吸取的溶液為wash5，洗脫液進液質聯(lián)用分析。(液相條件:Kromasil C₁₈柱(4.6mm×150mm，5μm)，流動相A(0.1％甲酸-水)-B(乙腈)，梯度洗脫(0min，5％B；5min，15％B；10min，20％B；20min，25％B；30min，100％B；35min，100％B)，流速0.6mL·min^－1，柱溫30℃，進樣體積5μL。質譜條件:負離子模式，毛細管溫度325℃，離子源電壓－4.5kV噴霧氣壓379.21kPa，去簇電壓－60V，加熱氣壓379.21kPa，離子源溫度550℃，一級質譜掃描范圍m/z 100-1500，二級質譜激活類型CID)。

(5)本發(fā)明建立基于磁性分離的酪氨酸酶抑制活性篩選系統(tǒng)，并用傳統(tǒng)的活性篩選方法對篩選結果進行驗證，本發(fā)明建立的篩選系統(tǒng)的結果確實可信。與傳統(tǒng)的基于96孔板的酪氨酸酶抑制劑篩選方法相比，該篩選系統(tǒng)的優(yōu)點是能夠快速的發(fā)現(xiàn)活性化合物，并能通過在線液-質聯(lián)用技術同時獲得活性化合物的化學信息，確定了15種酪氨酸酶抑制劑，其中有9種酪氨酸酶抑制劑為首次報道，包括苯甲酰芍藥苷、芍藥交酯、苯甲酰氧芍藥甙、沒食子酰芍藥苷、氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芒柄花甙、牡丹皮苷C、丹皮酚新甙，如表2所示。

表2單體成分對酪氨酸酶活性的抑制作用

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。