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一種基于比色法或電化學(xué)法測定蛋白激酶PKA的活性的方法與流程

文檔序號:12466202閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種基于比色法測定蛋白激酶PKA活性的方法,其特征在于:包括以下步驟:

1)采用含胞嘧啶單鏈DNA作為模板和穩(wěn)定劑,以AgNO3為原料及以NaBH4為還原劑通過還原法,生成由納米銀分散負(fù)載在含胞嘧啶單鏈DNA上構(gòu)成的AgNCs;

2)將含AgNCs的溶液與ZrOCl2溶液進(jìn)行混合反應(yīng),得到混合液;

3)將Mg(NO3)2溶液、多肽溶液、ATP溶液和PKA溶液進(jìn)行混合反應(yīng),得到酶反應(yīng)液;

4)將所述酶反應(yīng)液與所述混合液進(jìn)行混合反應(yīng),即得分子探針溶液;

5)所述分子探針溶液與銀染液混合,避光反應(yīng),通過ImageJ2x軟件測定反應(yīng)產(chǎn)物的相應(yīng)平均灰度值;

6)采用一系列不同濃度的PKA溶液,重復(fù)3)、4)和5)步驟,得到一系列相應(yīng)的平均灰度值,建立PKA濃度與平均灰度值關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線;

7)采用待測Hela細(xì)胞裂解液,重復(fù)3)、4)和5)步驟,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線,確定待測Hela細(xì)胞裂解液中PKA的濃度。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于比色法測定蛋白激酶PKA活性的方法,其特征在于:包括以下步驟:

I)在避光條件下,將16~20μL濃度為0.8~1.2mM AgNO3溶液和28~32μL濃度為80~120μM DNA溶液混合30~60min后,加入16~20μL濃度為0.8~1.2mMNaBH4溶液,進(jìn)行還原反應(yīng),即得AgNCs;

II)將45~55μL濃度為160~200μM的AgNCs溶液與8~12μL濃度為0.8~1.2mMZrOCl2溶液混合,震蕩1~2min后,靜置反應(yīng)15~25min,得到混合液;

III)將8~12μL濃度為80~120mM的Mg(NO3)2、8~12μL濃度為23~27μM的多肽、8~12μL濃度為40~60μM的ATP溶液和8~12μL濃度為0U/mL的PKA混合,在25~40℃條件下,反應(yīng)1~2h,得到酶反應(yīng)液;

IV)在所述混合液中加入所述酶反應(yīng)液30~50μL,震蕩1~2min,靜置反應(yīng)15~25min,即得分子探針溶液;

V)將所述分子探針溶液與80~120μL銀染液混合,避光反應(yīng),通過ImageJ2x軟件測定反應(yīng)產(chǎn)物的相應(yīng)平均灰度值;

VI)采用濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.5U/mL的PKA溶液,重復(fù)III)、IV)和

V)步驟,得到一系列相應(yīng)的平均灰度值,建立PKA濃度與平均灰度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線;

VII)采用待測Hela細(xì)胞裂解液,重復(fù)III)、IV)和V)步驟,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線,確定待測Hela細(xì)胞裂解液中PKA的濃度。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于比色法測定蛋白激酶PKA活性的方法,其特征在于:所述的含胞嘧啶單鏈DNA序列為CCC CCC CCC CCC。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于比色法測定蛋白激酶PKA活性的方法,其特征在于:所述的銀染液包含AgNO3和對苯二酚。

5.一種基于電化學(xué)法測定蛋白激酶PKA活性的方法,其特征在于:包括以下步驟:

a)采用含胞嘧啶單鏈DNA作為模板和穩(wěn)定劑,以AgNO3為原料及以NaBH4為還原劑通過還原法,生成由納米銀分散負(fù)載在含胞嘧啶單鏈DNA上構(gòu)成的AgNCs;

b)將含AgNCs的溶液與ZrOCl2溶液進(jìn)行混合反應(yīng),得到混合液;

c)將Mg(NO3)2溶液、多肽溶液、ATP溶液和PKA溶液進(jìn)行混合反應(yīng),得到酶反應(yīng)液;

d)將所述酶反應(yīng)液與所述混合液進(jìn)行混合反應(yīng),即得分子探針溶液;

e)將分子探針溶液滴加在玻碳電極表面,烘干后,置于銀染液中浸泡,再通過方波伏安法檢測,得到相應(yīng)的電流信號值;

f)采用一系列不同濃度的PKA溶液,重復(fù)c)、d)和e)步驟,得到一系列相應(yīng)的電流信號值,建立PKA濃度與電流信號值關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線;

g)采用待測Hela細(xì)胞裂解液,重復(fù)c)、d)和e)步驟,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線,確定待測Hela細(xì)胞裂解液中PKA的濃度。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于電化學(xué)法測定蛋白激酶PKA活性的方法,其特征在于:包括以下步驟:

i)在避光條件下,將16~20μL濃度為0.8~1.2mM AgNO3溶液和28~32μL濃度為80~120μM DNA溶液混合均勻30~60min后,加入16~20μL濃度為0.8~1.2mM NaBH4溶液,進(jìn)行還原反應(yīng),即得AgNCs;

ii)將23~27μL濃度為160~200μM的AgNCs與3~7μL濃度為0.8~1.2mM ZrOCl2混合,震蕩1~2min,靜置反應(yīng)15~25min,得到混合液;

iii)將3~7μL濃度為80~120mM的Mg(NO3)2溶液、3~7μL濃度為23~27μM的多肽溶液、3~7μL濃度為45~55μM的ATP溶液和3~7μL濃度為0U/mL的PKA溶液混合,在25~40℃條件下,反應(yīng)1~2h,得到酶反應(yīng)液;

iv)將所述混合液與18~22μL所述酶反應(yīng)液,震蕩1~2min,靜置反應(yīng)15~25min,即得分子探針溶液。

v)將7~8μL分子探針溶液滴加在玻碳電極表面,在30~40℃溫度下,烘干后,置于銀染液中浸泡2~4min,以1M KCl作為電解質(zhì),在-0.15~0.25V范圍內(nèi),15HZ的頻率掃方波伏安曲線,得到相應(yīng)的電流信號值;

vi)采用濃度分別為0.01、0.05、0.2、0.4、0.6、0.75、1U/mL的PKA溶液,重復(fù)iii)、iv)和v)步驟,得到一系列相應(yīng)的電流信號值,建立PKA濃度與電流信號值關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線;

vii)采用待測Hela細(xì)胞裂解液,重復(fù)iii)、iv)和v)步驟,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線,確定待測Hela細(xì)胞裂解液中PKA的濃度。

7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的基于電化學(xué)法測定蛋白激酶PKA活性的方法,其特征在于:所述的含胞嘧啶單鏈DNA序列為CCC CCC CCC CCC。

8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的基于電化學(xué)法測定蛋白激酶PKA活性的方法,其特征在于:所述的銀染液包含AgNO3和對苯二酚。

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