本發(fā)明屬于醫(yī)藥檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種金銀花質(zhì)量評價方法。
背景技術(shù)：
金銀花，別名雙花、二花、土銀花、忍冬花等，是忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thunb.)的干燥花蕾或初開的花，廣泛分布在我國各省，應(yīng)用歷史悠久，是我國常用的大宗中藥材之一，首次記載于梁代陶弘景的《名醫(yī)別錄》，味甘、性寒，歸肺、心、胃經(jīng)，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功能，主要用于治療癰腫疔、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒、溫病發(fā)熱等癥。
影響金銀花質(zhì)量的因素有很多，主要有產(chǎn)地、種植環(huán)境、采收期、加工干燥、施肥等，而對于金銀花成品質(zhì)量的評價，傳統(tǒng)認為綠原酸和木犀草苷是金銀花的有效成分，對于金銀花的質(zhì)量評價研究則多圍繞這兩種成分進行，2015版《中國藥典》金銀花藥材的質(zhì)量評價和含量分析主要就是圍繞綠原酸和木犀草苷進行。而目前已有對于金銀花質(zhì)量評價的研究報道，也多參照藥典進行，評價標準成分較單一。但是綠原酸和木犀草苷并不能代表金銀花中的所有成分。近年來研究發(fā)現(xiàn)，作為金銀花的主要成分之一的環(huán)烯醚萜苷類具有抗病毒、抗菌、抗氧化、保肝利膽、抗腫瘤、抗炎、增強免疫等多種活性，因此開展金銀花藥材中環(huán)烯醚萜苷類成分的高效提取和分析方法研究，將其納入質(zhì)量評價體系，對進一步研究其作用機制、建立質(zhì)量標準，提高藥材及相關(guān)成藥質(zhì)量控制水平，指導(dǎo)臨床應(yīng)用具有重要意義。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種金銀花質(zhì)量評價方法，該方法不僅對綠原酸和木犀草苷含量進行測定，同時還檢測金銀花中6種主要環(huán)烯醚萜苷類成分，從而提高金銀花質(zhì)量評價方法的可靠性和有效性。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
一種金銀花質(zhì)量評價方法，該方法對金銀花中綠原酸、木犀草苷和6種環(huán)烯醚萜苷類成分進行測定，其中，所述6種環(huán)烯醚萜苷類成分是馬錢酸、莫諾苷、馬錢苷、當藥苷、斷氧化馬錢子苷和開聯(lián)番木鱉苷二甲基乙縮醛，對6種環(huán)烯醚萜苷類成分測定步驟如下：
(1)將金銀花粉碎，過篩，稱取一定量金銀花粉待用；
(2)向步驟(1)中的金銀花中加入提取溶劑，搖勻后進行超聲提取得上清液；
(3)向步驟(2)中的上清液中加入凈化劑，渦流振蕩；
(4)經(jīng)步驟(3)處理后的上清液用微孔濾膜過濾得提取液；
(5)分別精密稱取馬錢酸、莫諾苷、馬錢苷、當藥苷、斷氧化馬錢子苷、開聯(lián)番木鱉苷二甲基乙縮醛對照品，加甲醇溶解，制成混合標準溶液；使用時，按一定比例逐級稀釋，待用。
(6)將步驟(4)得到的提取液進行高效液相色譜分析，色譜條件如下：色譜柱：Kromasil C18(4.6×250mm，5μm)；流速：0.5-1.0mL/min；檢測波長：200-250nm；柱溫：25-30℃；流動相：流動相為0.4％甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脫；
(7)以外標法進行金銀花中六種環(huán)烯醚萜苷類成分的定量分析，即以已知濃度的環(huán)烯醚萜苷類的色譜峰面積比對其相應(yīng)濃度進行回歸分析，得到標準曲線，對提取液進行測定，測得檢出提取液中六種環(huán)烯醚萜苷類成分的色譜峰面積，代入標準曲線，求得樣品中馬錢酸、莫諾苷、馬錢苷、當藥苷、斷氧化馬錢子苷和開聯(lián)番木鱉苷二甲基乙縮醛的含量。
優(yōu)選的，所述步驟(1)中過篩目數(shù)為20-40目，進一步優(yōu)選的，所述過篩目數(shù)為40目；
優(yōu)選的，所述步驟(2)中提取溶劑為50％乙醇；所述金銀花粉與提取溶劑的質(zhì)量體積比1g:100-150ml，進一步優(yōu)選的，所述金銀花粉與提取溶劑的質(zhì)量體積比為1g:100ml；
優(yōu)選的，所述步驟(2)中超聲提取時間為15-25min，進一步優(yōu)選的，超聲提取時間為15min；
優(yōu)選的，所述步驟(3)中加入的凈化劑為硅藻土；所述凈化劑與上清液的質(zhì)量體積比為45-55g:1ml；進一步優(yōu)選的，所述凈化劑與上清液的質(zhì)量體積比為50g:1ml；
優(yōu)選的，所述步驟(3)中渦流振蕩時間為0.5-2min；進一步優(yōu)選的，所述渦流振蕩時間為1min；
優(yōu)選的，所述步驟(4)中微孔濾膜規(guī)格為0.22mm；
優(yōu)選的，所述步驟(6)中流速為0.8mL/min；檢測波長為240nm；柱溫：25℃；
優(yōu)選的，所述步驟(6)中梯度洗脫程序如下：0～15min，10％～14％乙腈；15～35min，14％～25％乙腈；35～45min，25％～50％乙腈；45～50min，50％～100％乙腈；50～65min，100％乙腈；
優(yōu)選的，所述綠原酸和木犀草苷的測定依照2015版《中國藥典》中測定方法進行。
本發(fā)明首次將金銀花中的環(huán)烯醚萜苷類成分納入金銀花質(zhì)量評價體系，為保障質(zhì)量評價方法的可靠性和有效性，同時選取6種金銀花中的代表性環(huán)烯醚萜苷類成分進行測定，并首次建立了分散固相萃取-高效液相色譜(DSPE-HPLC)法檢測6種不同結(jié)構(gòu)環(huán)烯醚萜苷類成分(馬錢酸、莫諾苷、馬錢苷、當藥苷、斷氧化馬錢子苷、開聯(lián)番木鱉苷二甲基乙縮醛)，使用該方法線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999，檢出限為0.026-0.057μg/mL，各目標成分回收率在90.5-102.1％之間，相對標準偏差(RSD)在0.85-1.74％范圍內(nèi)，本發(fā)明具有有機溶劑用量少、凈化和濃縮效果好、目標物回收率高、靈敏度高易操作等特點。
本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和條件的限制，對樣品前處理方法和儀器檢測條件進行了優(yōu)化，與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明具有如下有益效果：
(1)本發(fā)明將六種不同結(jié)構(gòu)環(huán)烯醚萜苷類成分即馬錢酸、莫諾苷、馬錢苷、當藥苷、斷氧化馬錢子苷、開聯(lián)番木鱉苷二甲基乙縮醛經(jīng)過分散固相處理的前處理方式，同時使用高效液相色譜儀進行測定，大大節(jié)約了儀器設(shè)備與成本，可以滿足不同條件實驗室的工作需求。
(2)本發(fā)明樣品前處理流程簡單，大大縮短了每個測試樣品的檢測時間，降低了分析成本，有效避免死吸附現(xiàn)象發(fā)生，本發(fā)明采用分散固相萃取(DSPE)作為前處理技術(shù)，減少了有機溶劑的使用量，縮短了前處理時間，使實驗操作更加簡便、快捷。
(3)本發(fā)明具有檢測靈敏度高、準確及重現(xiàn)性好等優(yōu)點。
綜上所述，本發(fā)明通過對金銀花中三類有效成分的精確測定，顯著提高了對金銀花質(zhì)量評價的可靠性和有效性，從而進一步提高了金銀花藥材及相關(guān)成藥質(zhì)量控制水平，對于指導(dǎo)臨床應(yīng)用具有重要意義。
具體實施方式
結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，應(yīng)該說明的是，下述說明僅是為了解釋本發(fā)明，并不對其內(nèi)容進行限定。
實施例1
一種金銀花質(zhì)量評價方法，包括對金銀花中綠原酸、木犀草苷和6種環(huán)烯醚萜苷類成分進行測定，其中，6種環(huán)烯醚萜苷類成分是馬錢酸、莫諾苷、馬錢苷、當藥苷、斷氧化馬錢子苷和開聯(lián)番木鱉苷二甲基乙縮醛；綠原酸、木犀草苷測定方法依照2015版《中國藥典》進行。如下詳細列出檢測6種環(huán)烯醚萜苷類成分的儀器材料、方法步驟。
1儀器與材料
Agilent 1260型高效液相色譜儀，美國Agilent公司；KQ2400KDE型高功率數(shù)控超聲波儀，昆山市超聲儀器有限公司；R201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申生科技有限公司；BSA1245-CW型精密天平，德國Sartorius公司；Milli-Q(18.2MΩ)超純水處理系統(tǒng)，美國Millipore公司。
甲醇(色譜純)購于美國Tedia公司；乙腈(色譜純)購于德國Merck公司；甲酸(色譜純)購于德國Riedel公司；其余試劑均為分析純，實驗用水為Milli-Q超純水(18.2MΩ)。硅藻土(分析純)購置于天津大茂化學(xué)試劑廠；聚酰胺(30～60目，柱色譜)均購置于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。
本實驗所采用的金銀花Lonicera japonica Thunb.藥材購于山東省濟南市漱玉平民大藥房，并經(jīng)山東省分析測試中心王曉研究員鑒定。6種環(huán)烯醚萜苷化合物對照品馬錢酸、莫諾苷、馬錢苷、當藥苷、斷氧化馬錢子苷、開聯(lián)番木鱉苷二甲基乙縮醛)均由實驗室分離制備，結(jié)構(gòu)經(jīng)過波譜數(shù)據(jù)鑒定，峰面積歸一化法質(zhì)量分數(shù)均大于98％。
2.樣品提取液制備
金銀花藥材粉碎，過40目篩，準確稱取0.3g置于具塞三角瓶中，加30mL50％乙醇，超聲提取15min，取2mL上清液，加硅藻土100mg，渦流振蕩1min，0.22μm微孔濾膜過濾得樣品提取液。
3.對照品溶液的制備
分別精密稱取馬錢酸、莫諾苷、馬錢苷、當藥苷、斷氧化馬錢子苷、開聯(lián)番木鱉苷二甲基乙縮醛對照品2.0mg，置于10mL棕色容量瓶中，加50％甲醇溶解，定容，搖勻，制成濃度為200μg/mL混合標準溶液。使用時，按比例逐級稀釋，待用。
4.高效液相色譜條件
HPLC分析，進樣體積3μL。具體色譜條件為：Kromasil C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，流動相：0.4％甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脫程序：0～15min，10％～14％乙腈；15～35min，14％～25％乙腈；35～45min，25％～50％乙腈；45～50min，50％～100％乙腈；50～65min，100％乙腈。檢測波長240nm，流速0.8mL/min，進樣量3μL，柱溫25℃。
5.測定結(jié)果計算
以外標法進行金銀花中六種環(huán)烯醚萜苷類成分的定量分析，即以已知濃度的環(huán)烯醚萜苷類的色譜峰面積比對其相應(yīng)濃度進行回歸分析，得到標準曲線，對提取液進行測定，測得檢出提取液中六種環(huán)烯醚萜苷類成分的色譜峰面積，代入標準曲線，求得樣品中馬錢酸、莫諾苷、馬錢苷、當藥苷、斷氧化馬錢子苷和開聯(lián)番木鱉苷二甲基乙縮醛的含量。實驗結(jié)果如表1所示。
表1樣品中環(huán)烯醚萜苷的測定結(jié)果
依照2015《中國藥典》所述方法對金銀花1號樣品中的綠原酸、木犀草苷進行測定：綠原酸含量為26.8mg/g，木樨草甘含量為0.608mg/g。
6.方法學(xué)考察
在本研究優(yōu)化的測定條件下，以金銀花提取物中各環(huán)烯醚萜苷類成分的保留時間和峰面積為考察指標，對該方法的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加標回收率分別進行了考察。精密度試驗表明，各環(huán)烯醚萜苷類成分保留時間的RSD值均低于0.95％，峰面積的RSD值均低于1.51％，結(jié)果表明儀器精密度良好。6次重復(fù)性試驗表明，各環(huán)烯醚萜苷類成分保留時間的RSD值均低于1.23％，峰面積的RSD值均低于4.21％，結(jié)果表明方法的重復(fù)性良好。24h內(nèi)穩(wěn)定性試驗表明，各環(huán)烯醚萜苷類成分保留時間的RSD值在0.08％～0.65％，峰面積的RSD值在0.85％～1.74％，表明供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。精密稱取已知各目標化合物量的金銀花樣品0.30g，分別準確加入對照品適量，按照供試品溶液制備方法處理6份，按上述色譜條件進樣分析，測定各目標化合物峰面積，計算平均加樣回收率，結(jié)果表明，各目標成分加標回收率在90.5％～102.1％，RSD值在0.67％～2.27％。以上數(shù)據(jù)說明，該方法具有較好的精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，可以用于金銀花中環(huán)烯醚萜苷類成分的準確測定。
實施例2
如實施例1所述，選擇另一金銀花樣品2，實驗結(jié)果見表2。
表2樣品中環(huán)烯醚萜苷的測定結(jié)果
依照2015《中國藥典》所述方法對金銀花2號樣品中的綠原酸、木犀草苷進行測定：綠原酸含量為31.5mg/g，木樨草甘含量為0.815mg/g。
實施例3
如實施例1所述，選擇另一金銀花樣品3，實驗結(jié)果見表3。
表3樣品中環(huán)烯醚萜苷的測定結(jié)果
依照2015《中國藥典》所述方法對金銀花2號樣品中的綠原酸、木犀草苷進行測定：綠原酸含量為28.6mg/g，木樨草甘含量為0.735mg/g。
上述雖然結(jié)合實施例對本發(fā)明的具體實施方式進行了描述，但并非對本發(fā)明保護范圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護范圍以內(nèi)。