本發(fā)明涉及醫(yī)療衛(wèi)生
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種乙肝病毒核心抗原含量檢測方法。
背景技術(shù)：
：乙型肝炎是由乙肝病毒(HBV)感染所引起的一種慢性傳染病，初期癥狀隱蔽，病程較長其具有較強的傳染性，對患者健康影響嚴重，甚至可能危及生命。我國是乙肝高發(fā)國家，乙肝表面抗原攜帶率約占總?cè)丝诘?～8％，因此針對乙肝的預(yù)防、治療、檢測等技術(shù)至關(guān)重要。目前臨床上對乙肝病毒的檢測主要通過表面抗原(HBsAg)、表面抗體(抗-HBs)、e抗原(HBeAg)、e抗體(抗-HBe)以及核心抗體(抗-HBc)五項指標(即乙肝兩對半)進行評價。上述五種物質(zhì)的存在與乙肝病毒的感染進程有著較為穩(wěn)定的對應(yīng)關(guān)系，且由于存在于血清中、易于檢測，因此廣泛應(yīng)用于臨床檢驗。然而需要明確的是，上述五項物質(zhì)僅是體內(nèi)存在乙型肝炎病毒的間接標志，而未納入上述五項指標的乙肝病毒核心抗原(HBcAg)，作為乙肝病毒存在的直接標志能夠更準確的反應(yīng)HBV的存在及其復(fù)制程度，較其他免疫學(xué)指標靈敏性、特異性更好。乙肝病毒核心抗原由183個或185個氨基酸組成，高度磷酸化，是乙肝病毒核心顆粒的唯一結(jié)構(gòu)蛋白。由于它存在于Dane顆粒核心結(jié)構(gòu)表面，被表面抗原覆蓋，故不易在血液中檢出。核心抗原具有強免疫原性，可誘導(dǎo)很強的體液免疫和細胞免疫，刺激機體產(chǎn)生抗-HBc。現(xiàn)有技術(shù)中常用ELISA和IRMA雙抗體夾心法檢測HBcAg，其檢測步驟較繁瑣，且需要加入開殼劑，使HBcAg釋放與溶液中再進行測定，此過程存在較大的系統(tǒng)性誤差，因此準確性有待提升。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明旨在針對現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種乙肝病毒核心抗原含量檢測方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中乙肝病毒核心抗原難以從血清中直接檢出的技術(shù)問題。本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)的乙肝病毒核心抗原檢測步驟繁瑣。本發(fā)明要解決的再一技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)的乙肝病毒核心抗原檢測成本較高。為實現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種乙肝病毒核心抗原含量檢測方法，該方法屬于HPLC法，該方法利用C8色譜柱進行分離，并利用ELSD檢測器進行檢測；其色譜條件如下：流動相由pH8.5、濃度0.12mol/L的乙酸銨溶液與乙腈組成，其中乙腈占流動相總量的50～70％(v/v)；流速為0.5～0.9mL/min；柱溫為25～35℃。優(yōu)選的，乙腈占流動相總量的60％(v/v)。優(yōu)選的，所述流速為0.7mL/min。優(yōu)選的，所述柱溫為32℃。優(yōu)選的，具有以下操作條件：ELSD檢測器的飄移管溫度55℃，氣體流速22psi，進樣量17μL。優(yōu)選的，所述C8色譜柱的長度為150mm；在此基礎(chǔ)上進一步優(yōu)選的：所述C8色譜柱內(nèi)徑為4.3mm、填料平均粒徑為4μm。優(yōu)選的，檢測后利用內(nèi)標法對乙肝病毒核心抗原進行定量。本發(fā)明利用高效液相色譜法對乙肝病毒核心抗原執(zhí)行檢測，并對檢測器、色譜條件進行了優(yōu)化，使得檢測精度顯著提升，在無需添加開殼劑的條件下直接取血清即可檢出痕量的HBcAg。由于ELSD檢測器在執(zhí)行檢測的過程中流動相和溶劑會完全蒸發(fā)，因此得到的色譜圖沒有溶劑峰，且梯度洗脫沒有折光視差效應(yīng)、不會出現(xiàn)基線漂移，極大的簡化了后續(xù)的定量分析。而C8柱的保留時間較短、分離效果較好，因此顯著縮短了檢測時間。此外，由于該檢測條件溫和，因此不會導(dǎo)致蛋白、核酸等成分的變性失活，有效保證了檢測準確性。本發(fā)明以創(chuàng)新性的技術(shù)改進實現(xiàn)了優(yōu)越的技術(shù)效果，同時靈敏度較高、操作簡便，檢測后利用內(nèi)標法即可實現(xiàn)準確定量。附圖說明圖1是本發(fā)明實施例1乙肝病毒核心抗原標準品的HPLC檢測色譜；圖2是本發(fā)明實施例1乙肝病毒核心抗原含量與色譜圖峰面積對應(yīng)關(guān)系圖。具體實施方式以下將對本發(fā)明的具體實施方式進行詳細描述。為了避免過多不必要的細節(jié)，在以下實施例中對屬于公知的結(jié)構(gòu)或功能將不進行詳細描述。除有定義外，以下實施例中所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的相同含義。實施例1(1)色譜條件選用島津C8柱(4.5*130mm，4μm)，流動相是0.12mol/L乙酸銨溶液(pH8.5)與乙腈(40∶60，V/V)混合物，流速是0.7ml/min，柱溫為32℃，蒸發(fā)光散射檢測器的飄移管溫度55℃，氣體流速22psi。自動進樣器進樣量為17μL。(2)標準曲線的繪制取HBcAg標準品50mg，用色譜級乙腈溶解、定容至50mL，依次稀釋成HBcAg含量為5，10，20，50，100，200，500μg/ml的標準溶液，分別加入到步驟(1)處于運行狀態(tài)的高效液相色譜儀的色譜柱中20μl，分別計算相同保留時間下的峰面積，以濃度對數(shù)log10(C)為橫坐標，以峰面積對數(shù)log10(A)為縱坐標，繪制標準曲線表達式(如附圖2所示)，結(jié)果顯示二者線性關(guān)系良好。(3)待測樣品中HBcAg含量的檢測取待測血清，用色譜級乙腈溶解，混勻，再用0.22μm濾膜過濾，而后加入到步驟(1)處于運行狀態(tài)的高效液相色譜儀的色譜柱中20μl，計算相同保留時間下的峰面積，帶入步驟(2)所得的標準曲線表達式，計算出待測樣品中HBcAg濃度，再通過樣品的取樣量計算出HBcAg含量。其計算方法如下：HBcAg含量＝(待測樣品溶液的濃度÷待測HBcAg取樣量÷稀釋因子)×100％HBcAg(％)＝樣品中HBcAg含量÷HBcAg制劑標示量×100％(4)檢測準確性實驗對同一血清樣品，連續(xù)6次進樣，峰面積分別如表1所示：表1同樣血清樣品多次檢測結(jié)果次數(shù)123456峰面積85629.58554385345.985112.48571685897峰面積RSD值為0.31％，結(jié)果表明，本發(fā)明方法對HBcAg含量檢測的準確性高，結(jié)果較穩(wěn)定。實施例2(1)色譜條件選用安捷倫C8柱(所述C8色譜柱的長度為150mm，內(nèi)徑4.3mm，填料平均粒徑4μm)，流動相是0.12mol/L乙酸銨溶液(pH8.5)與乙腈(50∶50，V/V)的混合物，流速是0.5ml/min，柱溫為25℃，蒸發(fā)光散射檢測器的飄移管溫度55℃，氣體流速22psi。自動進樣器進樣量為17μL。(2)標準曲線的繪制取HBcAg標準品50mg，用色譜級乙腈溶解、定容至50mL，依次稀釋成HBcAg含量為5，10，20，50，100，200，500μg/ml的標準溶液，分別加入到步驟(1)處于運行狀態(tài)的高效液相色譜儀的色譜柱中20μl，分別計算相同保留時間下的峰面積，以濃度對數(shù)log10(C)為橫坐標，以峰面積對數(shù)log10(A)為縱坐標，繪制標準曲線表達式。(3)待測樣品中HBcAg含量的檢測取待測血清，用色譜級乙腈溶解，混勻，再用0.22μm濾膜過濾，而后加入到步驟(1)處于運行狀態(tài)的高效液相色譜儀的色譜柱中20μl，計算相同保留時間下的峰面積，帶入步驟(2)所得的標準曲線表達式，計算出待測樣品中HBcAg濃度，再通過樣品的取樣量計算出HBcAg含量。其計算方法如下：HBcAg含量＝(待測樣品溶液的濃度÷待測HBcAg取樣量÷稀釋因子)×100％檢測后利用內(nèi)標法對乙肝病毒核心抗原進行定量。實施例3一種乙肝病毒核心抗原含量檢測方法，該方法屬于HPLC法，該方法利用C8色譜柱進行分離，并利用ELSD檢測器進行檢測；其色譜條件如下：流動相由pH8.5、濃度0.12mol/L的乙酸銨溶液與乙腈組成，其中乙腈占流動相總量的70％(v/v)；流速為0.9mL/min；柱溫為35℃。在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，滿足以下條件：ELSD檢測器的飄移管溫度55℃，氣體流速22psi，進樣量17μL。所述C8色譜柱的長度為150mm。檢測后利用內(nèi)標法對乙肝病毒核心抗原進行定量。實施例4一種乙肝病毒核心抗原含量檢測方法，該方法屬于HPLC法，該方法利用C8色譜柱進行分離，并利用ELSD檢測器進行檢測；其色譜條件如下：流動相由pH8.5、濃度0.12mol/L的乙酸銨溶液與乙腈組成，其中乙腈占流動相總量的55％(v/v)；流速為0.8mL/min；柱溫為27℃。在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，滿足以下條件：所述C8色譜柱的長度為150mm，內(nèi)徑4.3mm，填料平均粒徑4μm。實施例5一種乙肝病毒核心抗原含量檢測方法，該方法屬于HPLC法，該方法利用C8色譜柱進行分離，并利用ELSD檢測器進行檢測；其色譜條件如下：流動相由pH8.5、濃度0.12mol/L的乙酸銨溶液與乙腈組成，其中乙腈占流動相總量的65％(v/v)；流速為0.6mL/min；柱溫為30℃。在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，滿足以下條件：ELSD檢測器的飄移管溫度55℃，氣體流速22psi，進樣量17μL。所述C8色譜柱的長度為150mm。內(nèi)徑4.3mm，填料平均粒徑4μm。以上對本發(fā)明的實施例進行了詳細說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3