本發(fā)明涉及一種包被工藝，具體涉及一種抗體的包被工藝，并提供了該工藝制成的肌紅蛋白測定試劑盒。
背景技術(shù)：
：肌紅蛋白是一種小分子蛋白質(zhì)，其分子結(jié)果與血紅蛋白相似，具有在肌細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和貯存氧的功能。人體心肌、骨骼肌內(nèi)含有大量肌紅蛋白，正常人的血液中很少，主要由腎臟代謝并排泄。當(dāng)心肌或橫紋肌有損傷時(shí)，肌紅蛋白便釋放入血中，血清中的肌紅蛋白即可明顯升高，因此肌紅蛋白測定可用于某些肌病和心臟病的診斷，如急性心肌梗死(AMI)、急性肌損傷、急慢性腎衰竭、嚴(yán)重充血性心力衰竭、長時(shí)間休克、肌營養(yǎng)不良、肌萎縮和多發(fā)性肌炎等疾病。膠乳增強(qiáng)免疫比濁法中，需采用物理或化學(xué)的方法將抗體吸附或偶聯(lián)到膠乳微球的表面。其中物理吸附法存在穩(wěn)定性不佳，抗體容易脫落下來，同時(shí)對(duì)于樣本中的干擾物質(zhì)的抗性差，容易產(chǎn)生假陽性的測定結(jié)果?；瘜W(xué)偶聯(lián)法將抗體隨機(jī)偶聯(lián)到微球表面，因偶聯(lián)的隨機(jī)性，可能導(dǎo)致部分抗體損失結(jié)合力，大大增加了試劑的成本。而現(xiàn)有采用化學(xué)偶聯(lián)的方法制備的肌紅蛋白測定試劑盒中，抗體與微球之間通常是采用多種化學(xué)物質(zhì)搭橋來提高偶聯(lián)效率，該方式會(huì)導(dǎo)致抗體微球的配制工藝更加復(fù)雜、成本更高。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：現(xiàn)有抗體與微球的偶聯(lián)效率通常是通過多種化學(xué)物質(zhì)搭橋來提高，該方式導(dǎo)致抗體微球的配制工藝更加復(fù)雜、成本更高；本發(fā)明的目的在于提供僅僅只使用一種活化劑即可有效提高抗體與微球之間偶聯(lián)效率的抗體包被工藝，并提供了包括該工藝制備的抗體微球的肌紅蛋白測定試劑盒。本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種抗體的包被工藝，包括：步驟一、將微球和活化劑分別溶于pH6.0的緩沖液中；步驟二、利用活化劑對(duì)微球表面的羧基進(jìn)行活化得到活化微球；步驟三、將抗體加入到活化微球中進(jìn)行偶聯(lián)；步驟四、再將pH8.0的緩沖液加入到抗體偶聯(lián)的活化微球中繼續(xù)反應(yīng)；步驟五、反應(yīng)完成后加入封閉劑完成封閉即可。本發(fā)明采用的是不同于常規(guī)的抗體與聚苯乙烯微球化學(xué)偶聯(lián)的方法，在常規(guī)的化學(xué)偶聯(lián)的工藝上對(duì)包被過程中的pH值進(jìn)行調(diào)整，將抗體與聚苯乙烯羧基微球有效連接，提高抗體與微球之間的有效結(jié)合，大大提高了化學(xué)偶聯(lián)的效率，同時(shí)有效節(jié)約成本。進(jìn)一步，所述緩沖液采用磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液，所述微球采用聚苯乙烯膠乳微球，所述活化劑為EDAC。EDAC或EDC為同一物質(zhì)，均為常用的水溶性碳二亞胺，是1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽。1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)能夠催化羧基，使其與氨基縮合形成酰胺鍵，反應(yīng)條件溫和、方便易行，只要蛋白質(zhì)與要偶聯(lián)的標(biāo)記分子及EDC按一定比例混合到一起，室溫下中性pH即可反應(yīng)，一般1-2小時(shí)即可完成。更進(jìn)一步地，所述步驟二中微球活化時(shí)間為30min，所述步驟三中抗體與微球的偶聯(lián)時(shí)間為1h，所述步驟四中反應(yīng)時(shí)間為1h。優(yōu)選地，所述步驟五中封閉劑為酪蛋白或/和甘氨酸。為了能提高試劑的穩(wěn)定性能，所述步驟五的封閉時(shí)間為30min，封閉完成后再加入pH8.0的緩沖液，調(diào)節(jié)pH后加入保護(hù)劑。優(yōu)選地，所述保護(hù)劑為海藻糖或/和木糖醇。一種肌紅蛋白測定試劑盒，包括R1試劑和R2試劑，所述R1試劑的配比為：磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液50-150mmol/L，酪蛋白1-10g/L，TritonX-1005-10g/L，氯化鉀15-30g/L，聚乙二醇5-30g/L，疊氮鈉1g/L；所述R2試劑的配比為：磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液50-150mmol/L，酪蛋白1-10g/L，疊氮鈉1g/L，海藻糖20-50g/L，木糖醇20-50g/L，甘氨酸1-10g/L，采用上述工藝制成的結(jié)合有肌紅蛋白抗體的聚苯乙烯膠乳微球，所述結(jié)合有肌紅蛋白抗體的聚苯乙烯膠乳微球占R2試劑總體積的3-5％。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：1、本發(fā)明通過對(duì)包被過程中pH值的調(diào)整，使抗體與聚苯乙烯羧基微球有效連接，大大提高了化學(xué)偶聯(lián)的效率；2、本發(fā)明僅僅只采用一種活化劑即可實(shí)現(xiàn)抗體與聚苯乙烯羧基微球之間的偶聯(lián)，且偶聯(lián)效率明顯高于現(xiàn)有方法偶聯(lián)的效率，操作更加簡單、成本更加低廉，效果更加顯著。具體實(shí)施方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，本發(fā)明的示意性實(shí)施方式及其說明僅用于解釋本發(fā)明，并不作為對(duì)本發(fā)明的限定。實(shí)施例1一種抗體的包被工藝，具體過程如下：步驟一、將微球和活化劑分別溶于pH6.0的緩沖液中；本步驟中所述緩沖液采用磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液，所述微球采用聚苯乙烯膠乳微球，所述活化劑為EDAC。步驟二、利用活化劑對(duì)微球表面的羧基進(jìn)行活化；即將包含有EDAC的緩沖液加入到溶解后的微球中進(jìn)行微球表面羥基的活化，活化時(shí)間為30min。步驟三、然后將抗體加入到活化后的微球中進(jìn)行偶聯(lián)，偶聯(lián)時(shí)間為1h；步驟四、再將pH8.0的磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液加入到抗體偶聯(lián)的微球中繼續(xù)反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為1h；步驟五、反應(yīng)完成后加入酪蛋白和甘氨酸完成封閉，封閉時(shí)間為30min；封閉完成后再加入pH8.0的磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液并調(diào)整pH值至7.5，然后加入海藻糖和木糖醇作為保護(hù)劑后保存即可。由于微球和抗體的添加量，以及封閉劑和保護(hù)劑的類型與添加量均與現(xiàn)有技術(shù)相同，因此上述各物質(zhì)的添加量和添加種類不再一一贅述。本發(fā)明中僅僅只采用一種活化劑，即EDAC，并通過整個(gè)過程中pH梯度包被的方式有效實(shí)現(xiàn)抗體與微球之間偶聯(lián)效率的增加，其檢測結(jié)果如表1和圖1所示。實(shí)施例2本實(shí)施例為實(shí)施例1的對(duì)照實(shí)施例，本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別在于，本實(shí)施例修改了步驟三以后的具體操作過程，同時(shí)，本實(shí)施例整個(gè)過程中的pH值不同，該步驟三以后的具體過程如下：步驟三、然后將抗體加入到活化后的微球中進(jìn)行偶聯(lián)，偶聯(lián)時(shí)間為2h；步驟四、反應(yīng)完成后加入酪蛋白和甘氨酸完成封閉，封閉時(shí)間為30min；封閉完成后再加入與步驟一中pH值相同的磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液，并調(diào)整pH值至7.5，然后加入海藻糖和木糖醇作為保護(hù)劑后保存即可。本實(shí)施例分別采用不同pH值的緩沖液進(jìn)行試驗(yàn)，檢測出不同pH包被后校準(zhǔn)曲線的數(shù)值，檢測出的數(shù)值結(jié)果如表1所示。表1濃度(ng/ml)pH5.0pH6.0pH7.0pH8.0pH梯度包被0142511221510010520027824534520025438758751171140054875411521015148280010101584227521012904并檢測出不同PH條件下抗體與微球之間的偶聯(lián)效率圖，如圖1所示。通過圖1中偶聯(lián)效率的顯示可知，采用實(shí)施例1中pH梯度包被的方式，能極大地增加偶聯(lián)效率，效果十分顯著。實(shí)施例3本實(shí)施例與實(shí)施例1和實(shí)施例2的區(qū)別在于，本實(shí)施例中采用的活化劑選擇為EDAC和Sulfo-NHS兩種，即在活化過程中，同時(shí)采用EDAC和Sulfo-NHS對(duì)微球進(jìn)行活化，其他操作步驟與實(shí)施例1和實(shí)施例2完全相同。本實(shí)施例同時(shí)給出了采用實(shí)施例1和實(shí)施例2中兩種活化包被方法進(jìn)行包被后的校準(zhǔn)曲線的數(shù)值，該數(shù)值如表1所示，并檢測出不同pH條件下的偶聯(lián)效率圖，如圖2所示。表2通過圖2的結(jié)果顯示可知，采用本發(fā)明中pH梯度包被的方式相對(duì)pH固定值而言，抗體與微球之間的偶聯(lián)效率有一定的提高。但通過實(shí)施例2與實(shí)施例3的試驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)比可知：僅僅采用一種活化劑時(shí)，其偶聯(lián)效率明顯高于同時(shí)使用兩種活化劑時(shí)，因而證明本發(fā)明的方法非常適用于僅僅采用一種活化劑時(shí)的微球偶聯(lián)效率的提高，尤其適用于僅僅采用EDAC作為活化劑的微球偶聯(lián)效率的提高。實(shí)施例4本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別在于，本實(shí)施例對(duì)步驟2中的活化時(shí)間進(jìn)行了調(diào)整，即把活化時(shí)間分別設(shè)定為15min，30min，45min，其他操作步驟與實(shí)施例1完全相同。本實(shí)施例同時(shí)給出了在不同活化時(shí)間條件下進(jìn)行活化包被后的校準(zhǔn)曲線的數(shù)值，該數(shù)值如表3所示。表3濃度(mg/ml)15min30min45min0301544100333345327200387711399400139714821411800286729042879通過上述表3可知，活化時(shí)間對(duì)抗體與微球之間的偶聯(lián)效率無顯著影響。實(shí)施例5本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別在于，本實(shí)施例對(duì)步驟3中的抗體與微球的偶聯(lián)時(shí)間設(shè)定為0.5h，1h，1.5h，或在步驟4中的中的繼續(xù)反應(yīng)時(shí)間設(shè)置為0.5h，1h，1.5h，其他操作步驟與實(shí)施例1完全相同。本實(shí)施例同時(shí)給出了在步驟3中，不同偶聯(lián)時(shí)間條件下的校準(zhǔn)曲線的數(shù)值，其他操作步驟與實(shí)施例1完全相同，該數(shù)值如表4所示。表4濃度(mg/ml)0.5h1.0h1.5h0141525100331345341200698711725400141114821433800287729042914本實(shí)施例中同時(shí)給出了在步驟4中，將pH8.0的緩沖液加入到抗體偶聯(lián)的活化微球中后，不同反應(yīng)時(shí)間的校準(zhǔn)曲線數(shù)值，其他操作步驟與實(shí)施例1完全相同，該數(shù)值如表5所示.表5通過上述表4、表5可知，步驟3、步驟4的反應(yīng)時(shí)間對(duì)偶聯(lián)效率無顯著影響。實(shí)施例6本實(shí)施例還公開了一種肌紅蛋白測定試劑盒，該試劑盒包括R1試劑和R2試劑，所述R1試劑的配比為：磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液50-150mmol/L，酪蛋白1-10g/L，TritonX-1005-10g/L，氯化鉀15-30g/L，聚乙二醇5-30g/L，疊氮鈉1g/L；所述R2試劑的配比為：磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液50-150mmol/L，酪蛋白1-10g/L，疊氮鈉1g/L，海藻糖20-50g/L，木糖醇20-50g/L，甘氨酸1-10g/L，采用實(shí)施例1的工藝制成的結(jié)合有肌紅蛋白抗體的聚苯乙烯膠乳微球，所述結(jié)合有肌紅蛋白抗體的聚苯乙烯膠乳微球占R2試劑總體積的3-5％。本發(fā)明采用上述試劑盒對(duì)肌紅蛋白的含量進(jìn)行檢測，同時(shí)，采用日本生研肌紅蛋白測定試劑盒作為對(duì)照試劑盒，檢測結(jié)果如表6所示。表6通過上述表6可知，本發(fā)明最終試劑性能與日本生研肌紅蛋白測定試劑盒性能一致，效果十分顯著。以上所述的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進(jìn)行了進(jìn)一步詳細(xì)說明，所應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式而已，并不用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3