本發(fā)明屬于水產(chǎn)動物免疫學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒抗體的膠體金免疫層析檢測試紙及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

七帶石斑魚（Epinephelus septemfasciatus Thunberg，1793）是我國沿海分布緯度最高的石斑魚種類，除了具有個體大、生長速度快和經(jīng)濟價值高等特點外，對低溫的耐受能力較強，生存水溫9~34℃，攝食水溫12~32℃，有“冷水石斑”之稱，被認(rèn)為是東北亞溫帶海域網(wǎng)箱養(yǎng)殖理想海水魚類品種之一，其苗種繁育技術(shù)的突破，可以緩解我國東海北部和黃渤海沿岸網(wǎng)箱適養(yǎng)魚類品種缺乏的問題，因此備受業(yè)界重視。但是盡管國內(nèi)外研究多年，七帶石斑魚的苗種繁育技術(shù)始終不能穩(wěn)定，在所面臨的技術(shù)瓶頸中，神病毒性神經(jīng)壞死病(viral nervousnecrosis，VNN)造成的早期苗種死亡率居高不下是目前最亟待解決的關(guān)鍵問題。

病毒性神經(jīng)壞死病(viral nervousnecrosis，VNN)是目前全球范圍內(nèi)除非洲外海水養(yǎng)殖魚類危害最嚴(yán)重的病毒性疾病之一，分為SJNNV、TPNNV，BFNNV和RGNVV4種類型，已報道的感染養(yǎng)殖魚類種類已超過13科近40種。養(yǎng)殖石斑魚受害尤其嚴(yán)重，受到感染后，早期仔稚魚死亡率高達100%，中間培育稚魚死亡率也常常超過50%，即便是體重超過1.5kg的養(yǎng)殖成魚受到感染后也會死亡。因此，VNN已經(jīng)成為造成養(yǎng)殖石斑魚從苗種到養(yǎng)殖大量死亡的主要原因之一。我國是石斑魚養(yǎng)殖大國，2008年產(chǎn)量達到4.5萬t，占世界石斑魚養(yǎng)殖總產(chǎn)量7.5萬t的一半以上，為保障我國石斑魚養(yǎng)殖這一海水養(yǎng)殖支柱產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展，亟需對石斑魚病毒性神經(jīng)壞死病的防治技術(shù)開展深入研究。

病毒性神經(jīng)壞死?。╲iral nervousnecrosis，VNN）是由諾達病毒科（Nodaviridae）的一種小RNA病毒引起的，該病毒被稱為神經(jīng)壞死病病毒（nervousnecrosis virus，NNV），NNV的傳播主要有兩條途徑，一是由攜帶病毒的親魚通過配子垂直傳播給子代，另外一條途徑是同一養(yǎng)殖環(huán)境中養(yǎng)殖魚群體間、不同種類養(yǎng)殖魚類或者棲息生物間以及從生鮮餌料魚和生物餌料至養(yǎng)殖群體的水平傳播。為了明晰NNV的傳播途徑和研發(fā)出相應(yīng)的預(yù)防技術(shù)，目前國內(nèi)外研究學(xué)者已經(jīng)開發(fā)出了多種NNV檢測技術(shù)，如原位雜交、免疫組織化學(xué)方法、熒光抗體技術(shù)、細胞培養(yǎng)、ELISA、逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄酶鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)（RT-PCR）和實時定量PCR等方法。目前在生產(chǎn)實際中較為有效的檢測手段均建立在神經(jīng)壞死病毒外殼蛋白基因核苷酸序列的PCR擴增基礎(chǔ)之上，但仍然存在檢測成本高、操作繁瑣、周期長、需要專用儀器設(shè)備等缺點，無法滿足養(yǎng)殖現(xiàn)場大規(guī)?？焖贉?zhǔn)確檢測的需求。

膠體金免疫層析技術(shù)則是在膠體金標(biāo)記技術(shù)和免疫層析技術(shù)發(fā)展的基礎(chǔ)上，結(jié)合了單克隆抗體技術(shù)和新材料技術(shù)，它以膠體金為標(biāo)記物，利用特異性抗原抗體反應(yīng)，在層析反應(yīng)過程中，通過帶顏色的膠體金顆粒來放大免疫反應(yīng)系統(tǒng)，使反應(yīng)結(jié)果在固相載體上直接顯示出來。該技術(shù)操作簡便、可靠性好、靈敏度高、反應(yīng)迅速、結(jié)果直觀并可大量制備，成本低廉，適合養(yǎng)殖場的大批量快速檢測，真正實現(xiàn)了長期以來人們在檢測技術(shù)領(lǐng)域所追求的“快速、簡便、特異、敏感”的目標(biāo)。膠體金免疫層析技術(shù)已在豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病毒等多種動物病毒檢測中得到應(yīng)用，研究技術(shù)成熟，但現(xiàn)尚未見有將膠體金免疫層析技術(shù)用于石斑魚神經(jīng)壞死病毒抗體檢測的相關(guān)報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對石斑魚神經(jīng)壞死病毒檢測，提供了一種用于檢測七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒抗體的膠體金免疫層析檢測試紙及其應(yīng)用。本發(fā)明的檢測試紙操作簡便、靈敏度高、結(jié)果快速、成本低廉，適合養(yǎng)殖場開展七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒抗體的快速診斷。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：

本發(fā)明提供了一種用于檢測七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒抗體的MCP重組蛋白的編碼基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3 所示。

本發(fā)明還提供了一種用于檢測七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒抗體的膠體金免疫層析檢測試紙，所述檢測試紙包括有底座、襯板、試紙芯和覆蓋于試紙芯上的面板，襯板連接在底座之上，所述試紙芯安裝在襯板內(nèi)，所述面板上設(shè)有加樣孔和結(jié)果顯示窗，所述試紙芯包括樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素反應(yīng)膜和吸水墊，依次粘貼于襯板上；

所述加樣孔設(shè)于樣品墊的上方位置，所述結(jié)果顯示窗設(shè)于硝酸纖維素反應(yīng)膜上方對應(yīng)的位置，所述硝酸纖維素膜上設(shè)有檢測線和對照線，檢測線上包被有七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP重組蛋白，對照線上包被有鼠抗七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP蛋白單克隆抗體，所述的膠體金結(jié)合墊為包被有膠體金標(biāo)記的七帶石斑魚MCP重組蛋白的玻璃纖維紙。

進一步的：所述七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP重組蛋白的包被量為1.0 ~ 10μg蛋白，所述膠體金標(biāo)記的七帶石斑魚MCP重組蛋白中膠體金標(biāo)記量為1~20μg/mL，所述鼠抗七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP蛋白單克隆抗體的包被量為0.5 ~5.0μg 蛋白。

進一步的：所述檢測線和對照線兩者線間距為5-7 mm。

進一步的：所述的七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP重組蛋白采用以下方法制備得到：

(1) 七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP蛋白重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建

以七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒RNA 為模板，設(shè)計引物克隆得到編碼七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP蛋白的cDNA 序列，將該序列插入表達載體，獲得重組表達載體；

(2) 七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP重組蛋白在大腸桿菌中的表達

將重組表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選含重組表達載體的大腸桿菌接種到培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，然后加入IPTG 誘導(dǎo)表達，收集細菌培養(yǎng)物；

(3) 七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP重組包涵體蛋白的變復(fù)性

收集包涵體，包涵體用緩沖液稀釋后，裝入透析袋中進行透析；

(4) 七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP重組蛋白的Ni柱親和純化；

將透析后的包涵體溶液上樣至親和層析柱進行蛋白純化，收集蛋白流出液；將其裝入透析袋中進行透析，獲得純化的MCP重組蛋白。

進一步的：所述步驟(1) 中引物序列為：

正向引物(F):Forward 5’-CCGGAATTCATGGTACGCAAAGGTGAGAAG-3’；

反向引物(R)：Forward 5’-CCGCTCGAGGTTTTCCGAGTCAACCCTAGTG-3’。

進一步的：所述步驟(2)中當(dāng)細菌濃度生長到OD600=0.5~1.0時，按濃度0.5 ~ 0.7mmol/L 加入IPTG 誘導(dǎo)3 ~5h，離心，收集細菌培養(yǎng)物。

進一步的：所述膠體金標(biāo)記的七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP重組蛋白采用以下方法制備得到：采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液，取膠體金溶液和七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP重組蛋白，攪拌震蕩使其結(jié)合，加入牛血清白蛋白，離心，棄上清，沉淀加入金標(biāo)緩沖溶液懸浮后定容制得。

本發(fā)明還提供了膠體金免疫層析檢測試紙在制備用于檢測七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒抗體的檢測用品中的應(yīng)用。

進一步的：在加樣孔內(nèi)加入稀釋后的魚類待檢血清樣本，靜置后如果若檢測線和對照線均呈現(xiàn)紅色，表明待檢血清樣本中含有神經(jīng)壞死病毒抗體；如果只有對照線呈現(xiàn)紅色，表明檢測樣品中不含有神經(jīng)壞死病毒抗體。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點和技術(shù)效果是：本發(fā)明提供的檢測試紙包括有底座、襯板、試紙芯和覆蓋于試紙芯上的面板，試紙芯包括樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素反應(yīng)膜和吸水墊，所述膠體金結(jié)合墊包被有膠體金標(biāo)記的七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP重組蛋白；所述硝酸纖維素膜上設(shè)有檢測線和對照線，檢測線和對照線上分別包被的是七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP重組蛋白和鼠抗七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP蛋白單克隆抗體。

本發(fā)明提供的檢測試紙操作簡便、靈敏度高、結(jié)果快速直觀、成本低廉，無需特殊的設(shè)備和儀器，十分適合養(yǎng)殖場開展七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒抗體的快速診斷。

附圖說明

圖1 為本發(fā)明所述膠體金免疫層析檢測試紙的表面結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2 為本發(fā)明所述膠體金免疫層析檢測試紙的內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖。

其中1、襯板；2、樣品墊；3、膠體金結(jié)合墊；4、硝酸纖維素反應(yīng)膜；5、檢測線；6、對照線；7、吸水墊；8、底座；9、加樣孔；10、結(jié)果顯示窗；11、面板。

圖3為本發(fā)明所述七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒外殼MCP重組蛋白的電泳圖譜。其中，M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1：未純化的包涵體蛋白；泳道2：變復(fù)性后的包涵體蛋白；泳道3：純化后的蛋白。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步詳細的說明。

實施例1

一、用于檢測七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒抗體的膠體金免疫層析檢測試紙的結(jié)構(gòu)

如圖1和圖2所示，本發(fā)明提供了一種用于檢測七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒抗體的膠體金免疫層析檢測試紙，所述的檢測試紙包括有底座8、襯板1、試紙芯和覆蓋在試紙芯上的面板11，其中試紙芯安裝在所述襯板上，襯板可以通過嵌入方式來安裝在底座上，所述面板11上設(shè)有加樣孔9 和結(jié)果顯示窗10，所述試紙芯包括樣品墊2、膠體金結(jié)合墊3、硝酸纖維素反應(yīng)膜4和吸水墊7，并按照如圖1所示的方式依次排列粘貼在所述襯板1上。

所述樣品墊2的上方位置對應(yīng)著面板上設(shè)有的加樣孔9，便于待檢測樣品通過加樣孔進入樣品墊2；所述硝酸纖維素反應(yīng)膜4上方位置對應(yīng)著面板上設(shè)有的結(jié)果顯示窗10，硝酸纖維素膜上設(shè)有檢測線5和對照線6，所述檢測線5上包被的是七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP重組蛋白，所述對照線6上包被的是鼠抗七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP蛋白單克隆抗體，所述膠體金結(jié)合墊3為包被有膠體金標(biāo)記的七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP重組蛋白的玻璃纖維紙。

所述七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP重組蛋白的合適包被量為1.0 ~ 10μg蛋白，所述膠體金標(biāo)記的七帶石斑魚MCP重組蛋白中膠體金標(biāo)記量為1~20μg/mL，所述鼠抗七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP蛋白單克隆抗體合適包被量為0.5 ~5.0μg 蛋白。

二、本發(fā)明所述膠體金免疫層析檢測試紙的制備方法

1、制備七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒外殼MCP重組蛋白

(1) 構(gòu)建七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP蛋白重組表達質(zhì)粒

以七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒RNA 為模板，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄后設(shè)計帶有酶切位點和保護堿基的引物：

正向引物(F):Forward 5’-CCGGAATTCATGGTACGCAAAGGTGAGAAG-3’（SEQ ID NO.1）；

反向引物(R)：Forward 5’-CCGCTCGAGGTTTTCCGAGTCAACCCTAGTG-3’（SEQ ID NO.2）。

（斜體CCG為保護堿基；粗體GAATTC為Xhol位點；粗體CTCGAG為EcoR1位點）

克隆得到編碼七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP蛋白的cDNA 序列（SEQ ID NO.3）并且兩端分別帶有XhoI和EcoRI酶切位點，將該序列經(jīng)過限制性內(nèi)切酶XhoI和EcoRI酶切后，插入pET-24a(+)表達載體XhoI和EcoRI酶切位點之間，獲得重組質(zhì)粒pET-MCP。

編碼七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP重組蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示。

(2) 七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP重組蛋白在大腸桿菌中的表達

將重組質(zhì)粒pET-MCP轉(zhuǎn)化大腸桿菌BG21，挑選陽性克隆，測序正確后，將含pET-MCP質(zhì)粒的BL21菌株50μL接種于含有2μL Km的2ml LB液體培養(yǎng)瓶中，37℃180rpm振蕩培養(yǎng)過夜，次日按1:100 ~ 1:500(V/V) 轉(zhuǎn)接到含有10L LB 培養(yǎng)基的15L 的發(fā)酵罐中，以250rpm 轉(zhuǎn)速37℃培養(yǎng)4~ 10h，當(dāng)細菌濃度生長到OD600=0.5~1.0時，按濃度0.5 ~ 0.7mmol/L 加入IPTG 誘導(dǎo)3 ~5h，6000rpm 離心10min，收集細菌培養(yǎng)物放到置于-20℃保存。

(3) 七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP重組包涵體蛋白的變復(fù)性

將誘導(dǎo)表達后的菌體沉淀重懸于裂解液Lysis buffer (20 mM Tris-HCl containing 1 mM PMSF and bacteria protease inhibitor cocktail, pH 8.0)中，超聲破碎(功率400 W，工作4 sec，間歇8 sec，共20 min)；將超聲破碎的細胞裂解液4℃ 10000g離心20 min，收集沉淀即為包涵體。

使用包涵體洗滌液(20mM Tris，1mM EDTA，2M尿素，1M NaCl，1％Triton X-100，pH8.0)洗滌包涵體3-5次；用溶解緩沖液(20mM Tris，5mM DTT，8M尿素 pH8.0)，按一定比例溶解包涵體，4度放置過夜；室溫，15000rpm離心15min；將上述溶液滴加20 mM Tris-HCL 5mM EDTA Buffer PH7.8緩沖液中，逐步成倍梯度稀釋緩慢攪拌，剪取處理好適量長度的透析袋，在純水中沖洗，將蛋白溶液裝入透析袋中，放入1*PBS（PH7.4）緩沖液中，4℃透析過夜。

(4) 七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP重組蛋白的Ni柱親和純化

利用低壓層析系統(tǒng)，將透析后的包涵體溶液以0.5 ml/min流速上樣至Ni-IDA Binding-Buffer預(yù)平衡的Ni-IDA -Sepharose CL-6B親和層析柱；用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5 ml/min流速沖洗，至流出液OD280值到達基線；用Ni-IDA Washing-Buffer(20 mM Tris-HCl，20 mM咪唑，0.15 M NaCl，pH8.0)以1 ml/min流速沖洗，至流出液OD280值到達基線；用Ni-IDA Elution-Buffer(20 mM Tris-HCl，250 mM咪唑，0.15 M NaCl，pH8.0)以1 ml/min流速洗脫目的蛋白，收集蛋白流出液；剪取處理好適量長度的透析袋，在純水中沖洗，將上述收集的蛋白溶液裝入透析袋中，放入1*PBS（PH7.4）緩沖液中，4℃透析過夜；分步收集洗脫液，檢測純度和含量。

分別取3μL未純化包涵體蛋白、3μL變復(fù)性的蛋白和1μL洗脫的純化產(chǎn)物與蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)進行12％的聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)考馬斯藍染色后，于凝膠成像系統(tǒng)觀察重組蛋白純化效果，結(jié)果見圖3所示。經(jīng)親和層析法純化后獲得純化的重組蛋白，收集后作為樣品備用。

2、制備鼠抗七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒單克隆抗體

(1) 動物免疫

選取5 只6-8 周齡雌性BALB/c 小鼠，將七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP 蛋白與弗氏完全佐劑混合首次免疫，皮下注射100ug，2-3 周加強免疫一次，采用免疫佐劑與抗原混合，皮下注射100ug。四免后采血檢測，通過間接ELISA 方法確定抗血清針對七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP 蛋白的效價，待效價大于1:10000，選擇1-2 只小鼠安排進行細胞融合。

(2)細胞融合

融合前一周，用含10%FBS DMEM 培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)SP2/0 細胞。到融合時，細胞長滿大約6 瓶T25 細胞培養(yǎng)瓶，在融合當(dāng)天收集SP2/0 細胞到50ml 離心管中，1000rpm,5min 離心。棄上清，然后再加入20ml DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基，吹散細胞然后計數(shù)。

四次免疫后血清ELISA 效價在1：10000 以上的小鼠，在融合前3 天終免，腹腔注射抗原100ug，融合當(dāng)天用頸椎脫臼法安樂死要融合的小鼠，用75%酒精浸泡5min，無菌取脾臟，把脾臟放入內(nèi)有10mlDMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)的培養(yǎng)皿中。取篩網(wǎng)放入另一個平皿中，將脾臟轉(zhuǎn)移到篩網(wǎng)上，用注射器內(nèi)心研磨脾臟。加入DMEM 到篩網(wǎng)上，沖洗篩網(wǎng)，使脾細胞更多的收集到平皿中。將細胞移至10ml 離心管中，用不含血清的DMEM 洗脾細胞兩次，1000 rpm離心5min，收集脾細胞計數(shù)。

混合骨髓瘤細胞和脾細胞，使骨髓瘤細胞同脾細胞數(shù)量比在1：20 為宜。把細胞放到50ml離心管中，用DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋，然后離心1000rpm 5min。棄上清。搖動離心管使細胞均勻。緩慢加入0.8ml 50%PEG，反應(yīng)90 秒，然后加入20-30ml DMEM 培養(yǎng)基終止PEG，把融合的細胞放到37℃水浴鍋中反應(yīng)10 分鐘。1000rpm 5min，棄上清然后加入HAT DMEM培養(yǎng)基. 把融合的細胞鋪到96 孔板中，每孔100μL。然后將細胞培養(yǎng)板放到CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合后4 天查看，雜交瘤細胞克隆率在50%以上，有少量的細胞碎片，細胞生長狀態(tài)良好。融合10 天后進行篩選檢測，確定后的陽性孔細胞進行亞克隆。

(3) 融合篩選及亞克隆

在檢測的前一天，用PBS 包被5ug/ml 抗原于ELISA 板，過夜。次日吸取細胞上清100ul/孔進行ELISA 檢測根據(jù)ELISA 結(jié)果，判斷陽性孔（樣品孔OD 值/陰性孔OD 值≥2.1 則判定為陽性孔。用單道移液器挑檢整板檢測出的陽性孔，進行第二次確認(rèn)檢測，進一步確認(rèn)陽性孔。確定后的陽性孔細胞進行亞克隆。

吹打陽性孔中細胞，計數(shù)，在離心管中加入N/4 ml DMEM 培養(yǎng)基，取100ul 細胞懸液到離心管中，吹勻后留1ml，補加DMEM 到4ml，吹勻，留100ul（約2 滴）在管底。在離心管中加DMEM 至5ml，混勻后滴加至96 孔板的前三行，每孔一滴管底留1.8-2ml 左右，補加DMEM 至5ml，吹勻后滴加至96 孔板的D、E、F 三行，每孔一滴，管底留1.5-1.8ml左右，補加DMEM 至2.8-3ml 左右，吹勻后滴加至96 孔板的G、H 行，每孔一滴，7-10 天后在顯微鏡下觀察，檢測有克隆生長的孔，標(biāo)記出單克隆的孔，盡可能挑取陽性的單克隆細胞進行再次亞克隆，檢測至100％陽性后，挑出單克隆孔擴大培養(yǎng)定株。

(4) 腹水制備（單抗大量生產(chǎn)）

在接種雜交瘤細胞前1 周，用0.5 mL液體石蠟腹腔注射正常BALB/C小鼠。將培養(yǎng)的雜交瘤細胞離心，棄去上清，雜交瘤細胞用無血清培養(yǎng)液懸浮，并將細胞數(shù)調(diào)至106/mL，每只小鼠腹腔注射0.5 mL。接種雜交瘤細胞后約7~12 天，小鼠腹部可見明顯膨大。用75 %酒精棉球消毒腹部皮膚后，用注射器抽取腹水。每只小鼠抽取腹水2 mL，間隔5天后，待腹水再生積聚后，同法抽取。收集的腹水3 000 r/min 離心20 min，收集上清，經(jīng)硫酸銨沉淀純化即得純化的鼠抗七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒單克隆抗體，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3、膠體金標(biāo)記的七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP重組蛋白的制備

膠體金標(biāo)記的七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP重組蛋白采用以下方法制備得到：采用檸檬酸三鈉還原法制備粒徑為30 nm 的膠體金溶液。取膠體金溶液10mL和七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP重組蛋白150μg，在PH7.5 的條件下攪拌30 min震蕩使其結(jié)合，加入10％(w/w) 的牛血清白蛋白，使其終濃度為1％ (w/v)，10000 rpm /min 離心30 min，棄上清，沉淀加入金標(biāo)緩沖溶液懸浮后定容至1mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4、膠體金免疫層析檢測試紙的制備

所述檢測七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒抗體的膠體金免疫層析檢測試紙的制備方法，按照如下步驟進行：將膠體金標(biāo)記的七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP重組蛋白以2-5μL/cm 的速度噴涂到玻璃纖維紙上得到膠體金結(jié)合墊，將濃度為1mg/ml 的七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP重組蛋白以1μL /cm 的速度噴涂到硝酸纖維膜上得到檢測線5，將濃度為0.5mg/ml的鼠抗七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP蛋白單克隆抗體以1.0μL /cm 的速度噴涂到硝酸纖維膜上得到對照線6，檢測線和對照線兩者線間距為5-7 mm，干燥后切割成4 mm 寬的硝酸纖維素膜條，進行組裝得到一種檢測七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒抗體的膠體金免疫層析檢測試紙。

實施例2、所述膠體金免疫層析檢測試紙的應(yīng)用

在應(yīng)用所述免疫層析檢測試紙在檢測七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒抗體時，在本發(fā)明膠體金免疫層析檢測試紙的加樣孔9內(nèi)加入少量用1mL 0.01M pH值為7.4 的 PBS 稀釋后的七帶石斑魚待檢血清樣本，等待約10min后，若對照線呈現(xiàn)紅色表明所述的免疫層析檢測試紙有效，若檢測線和對照線均呈現(xiàn)紅色，表明如果待檢血清樣本中含有神經(jīng)壞死病毒抗體，若只有對照線呈現(xiàn)紅色，表明檢測樣品中不含有神經(jīng)壞死病毒抗體。

上述實施例可以看出，本發(fā)明可對七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒抗體進行快速診斷，且操作簡便、靈敏度高、結(jié)果快速直觀、成本低廉，無需特殊的設(shè)備和儀器，十分適合養(yǎng)殖場開展七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒抗體的快速診斷。

以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其進行限制；盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，依然可以對前述實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明所要求保護的技術(shù)方案的精神和范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所

<120> 一種用于檢測七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒抗體的膠體金免疫層析檢測試紙及其

應(yīng)用

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ccggaattca tggtacgcaa aggtgagaag 30

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccgctcgagg ttttccgagt caaccctagt g 31

<210> 3

<211> 1017

<212> DNA

<213> 七帶石斑魚

<400> 3

atggtacgca aaggtgagaa gaaattggca aaacccgcga ccaccaaggc cgcgaatccg 60

caaccccgcc gacgtgctaa caatcgtcgg cgtagtaatc gcactgacgc acctgtgtct 120

aaggcctcga ctgtaactgg atttggacgt gggaccaatg acgtccatct ctcaggtatg 180

tcgagaatct cccaggccgt cctcccagcc gggacaggaa cagacggata cgttgttgtt 240

gacgcaacca tcgtccccga cctcctgcca cgactgggac acgctgctag aatcttccag 300

cgatacgctg ttgaaacact ggagtttgaa attcagccaa tgtgccccgc aaacacgggc 360

ggtggttacg ttgctggctt cctgcctgat ccaactgaca acgatcacac cttcgacgcg 420

cttcaagcaa ctcgtggtgc agtcgttgcc aaatggtggg aaagcagaac agtccgacct 480

cagtacaccc gcacgctcct ctggacctcg tcgggaaagg agcagcgtct cacgtcacct 540

ggtcggctga tactcctgtg tgtcggcaac aacactgatg tggtcaacgt gtcagtgctg 600

tgtcgctgga gtgttcgact gagcgttcca tctcttgaga cacctgaaga gaccaccgct 660

cccatcatga cacaaggttc cctgtacaac gattcccttt ccacaaatga cttcaagtcc 720

atcctcctag gatccacacc actggacatt gcccctgatg gagcagtctt ccagctggac 780

cgtccgctgt ccattgacta cagccttgga actggagatg ttgaccgtgc tgtttattgg 840

cacctcaaga agtttgctgg aaatgctggc acacctgcag gctggtttcg ctggggcatc 900

tgggacaact tcaacaagac gttcgcagat ggcgttgcct actactctga tgagcagcct 960

cgtcaaatcc tgctgcctgt tggcactgtc tgcactaggg ttgactcgga aaactaa 1017