本發(fā)明涉及免疫檢測領(lǐng)域，具體涉及一種聯(lián)合診斷胃病的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒及其制備、使用方法。
背景技術(shù)：
胃癌是常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率在常見的惡性腫瘤中長居高位。中國是胃癌的高發(fā)區(qū)，在《2012年中國腫瘤登記年報》中指出胃癌發(fā)病率排名第二，僅次于肺癌，胃癌死亡率排名第三，僅次于肺癌和肝癌，據(jù)胃癌流行病學(xué)的研究，中國是世界范圍內(nèi)胃癌發(fā)病率最高的國家之一，我國每年胃癌的死亡人數(shù)居世界首位。目前胃癌和其他胃部疾病的診斷仍依靠胃鏡、鋇餐造影等檢測手段來進(jìn)行確診。其中胃鏡被稱為是確診胃癌的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但胃鏡檢查有一定痛苦，受醫(yī)生水平影響較大，一般人難以接受，而鋇餐造影檢查存在放射線照射損傷，對早期胃癌判定無力等問題，這兩種檢查都需要大型醫(yī)療設(shè)備和專職人員，耗時、費(fèi)力、費(fèi)用高、不適合用作普查手段。
臨床研究發(fā)現(xiàn)，對始發(fā)階段的小胃癌、微小胃癌進(jìn)行早期治療，10年存活率可達(dá)100％，而晚期胃癌患者術(shù)后5年生存率僅為20％。因此早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是降低胃癌病死率的關(guān)鍵措施之一，但早期胃癌缺乏特異性表現(xiàn)，當(dāng)出現(xiàn)明顯消化道癥狀時，病情往往已處于中、晚期。因此建立一種非介入性、簡便、快速、便于動態(tài)監(jiān)測的檢查方法，對篩選高危人群，降低胃癌風(fēng)險具有重要意義。
胃蛋白酶原(pepsinogen，PG)是由胃部分泌的參與消化的胃蛋白酶的前體，是由375個氨基酸組成的單鏈多肽，平均分子量42kD，分為PGⅠ和PGⅡ兩種亞型。胃蛋白酶原Ⅰ(PGⅠ)來源于胃底腺的主細(xì)胞和頸粘液細(xì)胞，胃蛋白酶原Ⅱ(PGⅡ)由胃底腺、賁門腺、幽門腺和Brμnner＇s腺分泌。正常情況下約1％的PG進(jìn)入血循環(huán)，進(jìn)入的量十分穩(wěn)定，可以反應(yīng)出胃總體分泌PG水平。血清PGⅠ與胃泌酸腺細(xì)胞功能相關(guān)，PGⅡ與胃底粘膜病變的相關(guān)性較大，PGⅠ/PGⅡ水平與胃癌和胃癌前期病變呈負(fù)相關(guān)。隨著胃病的發(fā)展，血清中PGⅠ先升高再降低、PGⅡ升高后維持較高水平，這樣PGⅠ、PGⅡ、PGⅠ/PGⅡ比值的異常會提示不同的胃病，所以PG是淺表性胃炎、糜爛性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、萎縮性胃炎、胃癌等胃部疾病的初篩選指標(biāo)和治療的監(jiān)控指標(biāo)。而且在2014年發(fā)布的首部國內(nèi)體檢行業(yè)“準(zhǔn)規(guī)范”——《健康體檢基本項目專家共識》中更是將胃蛋白酶原的檢測納入了胃癌風(fēng)險篩查檢測項目當(dāng)中。
目前市場上PGⅠ和PGⅡ的檢測方法主要有乳膠增強(qiáng)免疫比濁法、時間分辨免疫熒光法、酶聯(lián)免疫法及化學(xué)發(fā)光法。其中化學(xué)發(fā)光法興起于20世紀(jì)80年代，是繼酶聯(lián)免疫技術(shù)和放免技術(shù)后發(fā)展起來的新興技術(shù)，目前，這一技術(shù)已從實驗室的稀有技術(shù)過渡到臨床醫(yī)學(xué)的常規(guī)檢測手段?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析既具有放射免疫的高靈敏度，又具有酶聯(lián)免疫的操作簡便、快速的特點，易于標(biāo)準(zhǔn)化操作。且測試中不使用有害的試劑，試劑保持期長，應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究和臨床實驗診斷工作，成為非放射性免疫分析法中最有前途的方法之一。目前市場上測定PGⅠ和PGⅡ的試劑盒仍然是以免疫比濁法和酶聯(lián)免疫法為主。免疫比濁法和酶聯(lián)免疫法存在操作繁瑣、特異性差、敏感度低、時間長等缺點，而市面上其它的化學(xué)發(fā)光檢測試劑其檢測范圍及臨床應(yīng)用相對狹窄，對PGⅠ有效檢測范圍僅在1～200ng/mL；因此尋找一種更有效的檢測方式就成了臨床應(yīng)用的關(guān)鍵。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的第一個技術(shù)問題是：提供一種聯(lián)合診斷胃病的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，該聯(lián)合檢測試劑盒主要有兩個項目的檢測組成，分別檢測胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ；可以檢測出血清中的胃蛋白酶原Ⅰ(PGⅠ)和胃蛋白酶原Ⅱ(PGⅡ)的含量；
本發(fā)明所要解決的第二個技術(shù)問題是：提供一種聯(lián)合診斷胃病的化學(xué)發(fā)光檢測的方法；
本發(fā)明所要解決的第三個技術(shù)問題是：提供一種聯(lián)合診斷胃病的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒的應(yīng)用。
本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：
聯(lián)合診斷胃病的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，該試劑盒包括PGⅠ包被微孔板、PGⅠ酶結(jié)合物、PGⅠ參考品及質(zhì)控品、PGⅡ包被微孔板、PGⅡ酶結(jié)合物、PGⅡ參考品及質(zhì)控品、濃縮洗滌液、發(fā)光底物液A、發(fā)光底物液B。所述PGⅠ包被微孔板內(nèi)包被有PGⅠ抗體；所述PGⅠ參考品及質(zhì)控品為系列稀釋后的PGⅠ抗原；所述PGⅠ酶結(jié)合物為酶標(biāo)記的PGⅠ抗體；所述PGⅡ包被微孔板內(nèi)包被有PGⅡ抗體；所述PGⅡ參考品及質(zhì)控品為系列稀釋后的PGⅡ抗原；所述PGⅡ酶結(jié)合物為酶標(biāo)記的PGⅡ抗體；所述濃縮洗滌液為磷酸鹽緩沖液；所述發(fā)光底物液A為含有魯米諾的發(fā)光底物液，發(fā)光底物液B為含有過氧化氫的發(fā)光底物液。
本試劑是將雙抗體夾心法免疫測定原理與酶標(biāo)記技術(shù)和酶催化化學(xué)發(fā)光免疫分析相結(jié)合的檢測產(chǎn)品，定量測定人血清中的PGⅠ或PGⅡ的含量。以一株抗PGⅠ或PGⅡ抗體包被微孔板，用辣根過氧化物酶標(biāo)記另一株與之配對的抗體。檢測時血清樣本中的PGⅠ或PGⅡ與包被的和酶標(biāo)記的兩株抗體形成夾心抗原抗體復(fù)合物，再加入發(fā)光底物，用微孔板發(fā)光分析儀讀取發(fā)光數(shù)值并計算其含量。
優(yōu)選的，所述的PGⅠ抗體包被微孔板和PGⅡ抗體包被微孔板，更優(yōu)選不透明聚苯乙烯48孔或96孔化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板包被微孔板；
所述的PGⅠ抗體和PGⅡ抗體優(yōu)選為鼠源的單克隆抗體，上述單克隆抗體的包被濃度為1～5μg/mL，其中優(yōu)選5μg/mL作為包被濃度。
所述的PGⅠ酶結(jié)合物，為辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的PGⅠ抗體，是與包被微孔板的PGⅠ抗體配對的另一株單克隆抗體，雙抗體夾心法需要一對抗體，一株用于包被，另一株用于標(biāo)記，是針對蛋白不同表位的抗體，使用時用稀釋液稀釋至濃度為1:1000～1:1500(體積比)，其中優(yōu)選1:1500；
所述的PGⅡ酶結(jié)合物，為辣根過氧化物酶標(biāo)記的PGⅡ抗體，是與包被微孔板的PGⅡ抗體配對的另一株單克隆抗體，使用時用稀釋液稀釋至濃度為1:1000～1:1500(體積比)，其中優(yōu)選1:1000；
所述的PGⅠ參考品濃度分別為0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、100ng/mL、350ng/mL；
所述的PGⅠ質(zhì)控品濃度分別為10ng/mL、30ng/mL、100ng/mL；
所述的PGⅡ參考品濃度分別為0ng/mL、1ng/mL、3ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、100ng/mL；
所述的PGⅡ質(zhì)控品濃度分別為3ng/mL、10ng/mL、30ng/mL；
所述的參考品稀釋液為：含有牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、蔗糖及Proclin-300的pH＝8.5濃度0.05mol/L的Tris-Hcl緩沖溶液。
所述的濃縮洗滌液為：以體積百分比計，含有0.05％的Triton X-100、0.03％的Proclin-300、pH為7.4濃度為0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液；
所述的發(fā)光底物液A為每250ml溶液含有牛血清白蛋白2.5g、三羥甲基氨基甲烷(Tris)1.5g、3-氨基鄰苯二甲酰肼(魯米諾)0.05g、對位碘酚0.0075g，另外還有極少量鹽酸(每1000ml底物液A加500μl鹽酸)，用作調(diào)節(jié)溶液的pH值至pH＝9。
所述的發(fā)光底物液B為每250ml溶液含有牛血清白蛋白2.5g、Tris1.5g、過氧化氫0.25ml，另外還有極少量鹽酸(每1000ml底物液B加500μl鹽酸)，用作調(diào)節(jié)溶液的pH值至pH＝9。
本發(fā)明還提供了聯(lián)合診斷胃病的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟：
(1)制備PGⅠ包被微孔板；制備PGⅡ包被微孔板；
(2)配制PGⅠ參考品和質(zhì)控品；配制PGⅡ參考品和質(zhì)控品；
(3)配制PGⅠ酶結(jié)合物；配制PGⅡ酶結(jié)合物；
(4)配制濃縮洗滌液；
(5)配制發(fā)光底物液A和發(fā)光底物液B；
(6)酶結(jié)合物、參考品、質(zhì)控品、濃縮洗滌液、發(fā)光底物液A和發(fā)光底物液B的分裝。
所述的PGⅠ包被微孔板的制備方法為：采用pH＝9.6的碳酸鹽緩沖液作為包被緩沖溶液，將PGⅠ單克隆抗體稀釋至濃度為5μg/mL作為包被液，按100μL/孔對微孔板進(jìn)行包被，室溫放置3小時后放于2～8℃靜置21小時，從而將PGⅠ單克隆抗體吸附于微孔板上。再用濃縮洗滌液進(jìn)行洗滌、封閉液進(jìn)行封閉和保護(hù)，最后通過干燥制得PGⅠ包被微孔板。
所述的PGⅡ包被微孔板的制備方法為：采用pH＝9.6的碳酸鹽緩沖液作為包被緩沖溶液，將PGⅡ單克隆抗體稀釋至濃度為5μg/mL作為包被液，按100μL/孔對微孔板進(jìn)行包被，室溫放置3小時后放于2～8℃靜置21小時，從而將PGⅡ單克隆抗體吸附于微孔板上；再用濃縮洗滌液進(jìn)行洗滌、封閉液進(jìn)行封閉和保護(hù)，最后通過干燥制得PGⅡ包被微孔板。
所述的封閉液配制方法為：將10g牛血清白蛋白、20g海藻糖溶于1L包被緩沖液中，再加入0.3mL的Proclin-300。
所述的PGⅠ參考品和質(zhì)控品的配制方法為：使用參考品稀釋液將PGⅠ標(biāo)準(zhǔn)品按一定的比例稀釋成0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、100ng/mL、350ng/mL的系列濃度，建立定量參考品。
所述的PGⅡ參考品和質(zhì)控品的配制方法為：使用參考品稀釋液將PGⅡ標(biāo)準(zhǔn)品按一定的比例稀釋成0ng/mL、1ng/mL、3ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、100ng/mL的系列濃度，建立定量參考品。
所述的參考品稀釋液的配制方法為：1)基礎(chǔ)緩沖溶液(Tris-Hcl)的配制：稱取6.057g Tris溶于1L純水中，用鹽酸調(diào)節(jié)PH為8.5-9.0。2)稱取10g牛血清白蛋白、20g酪蛋白、100g蔗糖溶于1L的Tris-Hcl緩沖液中，再加入0.3mL的Proclin-300。
所述的PGⅠ酶結(jié)合物為HRP標(biāo)記的PGⅠ單克隆抗體。
所述的PGⅠ酶結(jié)合物的配制方法為：將HRP標(biāo)記的PGⅠ單克隆抗體與酶結(jié)合物稀釋液以體積比1:1000～1500配制成工作溶液；優(yōu)選比例為1:1500。
所述的PGⅡ酶結(jié)合物為HRP標(biāo)記的PGⅡ單克隆抗體。
所述的PGⅡ酶結(jié)合物的配制方法為：將HRP標(biāo)記的PGⅡ單克隆抗體與酶結(jié)合物稀釋液以體積比1:1000～1500配制成工作溶液；優(yōu)選比例為1:1000。
所述的酶結(jié)合物稀釋液的配制方法為：1)基礎(chǔ)緩沖溶液(Tris-Hcl)的配制：稱取6.057g Tris溶于1L純水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH為8.5～9.0。2)稱取20g牛血清白蛋白、100g蔗糖溶于1L的Tris-Hcl緩沖液中，再加入體積分?jǐn)?shù)10％的小牛血清和體積分?jǐn)?shù)0.03％的Proclin-300，經(jīng)過濾除菌后，加入0.3～1.0％的復(fù)合酶穩(wěn)定劑AES。
本發(fā)明試劑盒中涉及的各試劑盒組分包括：PGⅠ參考品和質(zhì)控品，PGⅡ參考品和質(zhì)控品，PGⅠ酶結(jié)合物，PGⅡ酶結(jié)合物，化學(xué)發(fā)光溶液(發(fā)光底物液A和發(fā)光底物液B)，濃縮洗滌液及在試劑盒制備過程中使用到的各溶液配方，這些組分及配制方法均對檢測結(jié)果有至關(guān)重要的影響。
按照上述方法制備的試劑盒能夠達(dá)到很好的線性范圍，PGⅠ標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍可以達(dá)到1ng/mL～350ng/mL；PGⅡ標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍可以達(dá)到1ng/mL～100ng/mL，以及很好的靈敏度，PGⅠ靈敏度為1ng/mL、PGⅡ靈敏度為1ng/mL。
本發(fā)明還提供了聯(lián)合診斷胃病的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒的使用方法，包括以下步驟：
(1)樣品收集
取待測者血液，靜置待測血清30分鐘，對所述待測血清進(jìn)行離心處理10～20分鐘，即可進(jìn)行檢測。
(2)加樣檢測步驟
PGⅠ測定：
a、將在冷藏環(huán)境中貯存的各試劑等在室溫下平衡15分鐘以上；
b、將濃縮洗滌液按1:40(體積比)的比例稀釋，搖勻備用，作為應(yīng)用洗滌液；
c、根據(jù)PGⅠ參考品、質(zhì)控品及待測樣品確定所需孔數(shù)；
d、直接取PGⅠ參考品、質(zhì)控品及待測樣品各50μL加入到各自的待測孔內(nèi)；
e、取50μL PGⅠ酶結(jié)合物分別加入到各孔，振蕩器振蕩30秒鐘，蓋上封板膜，置37℃水浴50～60分鐘；
f、取出微孔板，用洗滌液洗板5次，洗滌時每孔注滿洗滌液，停留10秒后吸盡拍干；
g、根據(jù)使用量，將底物液A、B按1：1混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配；每孔加入100μL，用振蕩器振蕩20秒鐘，設(shè)定每孔測量時間為1秒，于5分鐘內(nèi)測定結(jié)果。
PGⅡ測定：
a、將在冷藏環(huán)境中貯存的各試劑等在室溫下平衡15分鐘以上；
b、將濃縮洗滌液按1:40的比例稀釋，搖勻備用，作為應(yīng)用洗滌液；
c、根據(jù)PGⅡ參考品、質(zhì)控品及待測樣品確定所需孔數(shù)；
d、直接取PGⅡ參考品、質(zhì)控品及待測樣品各50μL加入相應(yīng)孔內(nèi)；
e、取50μL PGⅡ酶結(jié)合物加入各孔，振蕩器振蕩30秒鐘，蓋上封板膜，置37℃水浴50～60分鐘；
f、取出微孔板，用洗滌液洗板5次，洗滌時每孔注滿洗滌液，停留10秒后吸盡拍干；
g、根據(jù)使用量，將發(fā)光底物液A、發(fā)光底物液B按1:1混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配；每孔加入100μL，用振蕩器振蕩20秒鐘，設(shè)定每孔測量時間為1秒，于5分鐘內(nèi)測定結(jié)果。
(3)檢測結(jié)果
根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)溶液發(fā)光值，借助微孔板化學(xué)發(fā)光儀分析軟件進(jìn)行四參數(shù)Logistic擬合，坐標(biāo)選擇X-Y，得標(biāo)準(zhǔn)曲線；也可采用雙對數(shù)Log(X)-Log(Y)線性分析方法，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計算出樣本中PGⅠ、PGⅡ的濃度。
(4)結(jié)果分析
在上述試劑盒的制備和使用的基礎(chǔ)上，本發(fā)明也提供了一種僅適用于本試劑盒的可供參考的判斷胃部疾病的檢測用標(biāo)志物聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)值，具體內(nèi)容如下：
1)各試劑盒的正常參考區(qū)間為：
a.正常人PGⅠ含量：60ng/mL～240ng/mL；
b.正常人PGⅡ含量：<15ng/mL；
c.PGⅠ與PGⅡ比值(PGⅠ/PGⅡ)的正常標(biāo)準(zhǔn)值為：>7.5。
2)PGⅠ與PGⅡ進(jìn)行聯(lián)合檢測時的參考區(qū)間為：
a.PGⅠ：60ng/mL～240ng/mL；PGⅡ<15ng/mL；PGⅠ/PGⅡ>7.5或≤7.5，正常；
b.PGⅠ<60ng/mL或>240ng/mL；PGⅡ≧15ng/mL；PGⅠ/PGⅡ>7.5或≦7.5，則異常；
c.PGⅠ：60ng/mL～240ng/mL；PGⅡ≧15ng/mL；PGⅠ/PGⅡ>7.5，則正常；若PGⅠ/PGⅡ≦7.5，則異常；
d.PGⅠ<60ng/mL或>240ng/mL；PGⅡ<15ng/mL；若PGⅠ/PGⅡ>7.5，則正常；若PGⅠ/PGⅡ≦7.5，則異常；
若結(jié)果提示異常，則建議定期復(fù)查PG或進(jìn)一步進(jìn)行胃鏡檢查。
本發(fā)明是一種可以聯(lián)合診斷胃病的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，包括檢測胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ兩個項目，可以檢測出血清中的胃蛋白酶原Ⅰ(PGⅠ)和胃蛋白酶原Ⅱ(PGⅡ)的含量。
經(jīng)采用上述方案進(jìn)行制備后，本發(fā)明的有益技術(shù)效果是：
1)本發(fā)明是一種非介入性、簡便、快速、便于動態(tài)監(jiān)測的檢查方法，避免了X-射線對人體的侵害和使用胃鏡的不便，它具有無創(chuàng)、線性范圍寬、特異性好等優(yōu)點，本發(fā)明試劑盒能夠?qū)GⅠ和PGⅡ進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測，而且誤差小、檢測靈敏度高、對檢測設(shè)備要求低；
2)由于本發(fā)明試劑盒體系中所采用的溶液配方和各組分的制備方法中大部分是為本發(fā)明獨立制作，保障了檢測的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，使得本發(fā)明試劑盒的檢測結(jié)果的準(zhǔn)確程度優(yōu)于目前市場上其它類型的PGⅠ和PGⅡ試劑盒；
3)在本發(fā)明試劑盒的臨床應(yīng)用方面，本試劑盒還提供了更為詳細(xì)的可供參考的判斷早期胃部疾病的檢測用標(biāo)志物聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)值，拓寬了的應(yīng)用范圍，具有目前市場上其它PGⅠ和PGⅡ試劑盒不具備的應(yīng)用。
具體實施方式
以下對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進(jìn)行說明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
實施例一、聯(lián)合診斷胃病的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒
一種聯(lián)合診斷胃病的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，該試劑盒包括PGⅠ包被微孔板、PGⅠ酶結(jié)合物、PGⅠ參考品及質(zhì)控品、PGⅡ包被微孔板、PGⅡ酶結(jié)合物、PGⅡ參考品及質(zhì)控品、濃縮洗滌液、發(fā)光底物液A、發(fā)光底物液B。
其中，PGⅠ抗體包被微孔板和PGⅡ抗體包被微孔板，優(yōu)選進(jìn)口乳白色不透明聚苯乙烯48孔或96孔化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板包被微孔板；PGⅠ包被微孔板內(nèi)包被有PGⅠ抗體；PGⅠ參考品及質(zhì)控品為系列稀釋后的PGⅠ抗原；PGⅠ酶結(jié)合物為辣根過氧化物酶標(biāo)記的PGⅠ抗體，是與包被微孔板的PGⅠ抗體配對的另一株單克隆抗體，雙抗體夾心法需要一對抗體，一株用于包被，另一株用于標(biāo)記，是針對蛋白不同表位的抗體，工作濃度為1:1500；
PGⅡ包被微孔板內(nèi)包被有PGⅡ抗體；PGⅡ參考品及質(zhì)控品為系列稀釋后的PGⅡ抗原；PGⅡ酶結(jié)合物為辣根過氧化物酶標(biāo)記的PGⅡ抗體，是與包被微孔板的PGⅡ抗體配對的另一株單克隆抗體，工作濃度為1:1000；
其中，PGⅠ抗體和PGⅡ抗體優(yōu)選鼠源的單克隆抗體，上述單克隆抗體的包被濃度優(yōu)選5μg/mL。
試劑盒內(nèi)濃縮洗滌液為磷酸鹽緩沖液；發(fā)光底物液A為含有魯米諾的發(fā)光底物液，發(fā)光底物液B為含有過氧化氫的發(fā)光底物液。
試劑盒內(nèi)包括的PGⅠ參考品濃度分別為0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、100ng/mL、350ng/mL；
PGⅠ質(zhì)控品濃度分別為10ng/mL、30ng/mL、100ng/mL；
PGⅡ參考品濃度分別為0ng/mL、1ng/mL、3ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、100ng/mL；
PGⅡ質(zhì)控品濃度分別為3ng/mL、10ng/mL、30ng/mL；
其中，參考品稀釋液的配制方法為：
1)基礎(chǔ)緩沖溶液(Tris-Hcl)的配制：稱取6.057g Tris溶于1L純水中，用鹽酸調(diào)節(jié)PH為8.5。
2)稱取10g BSA、20g酪蛋白、100g蔗糖溶于1L的Tris-Hcl緩沖液中，再加入0.3mL的Proclin-300。
濃縮洗滌液配制方法為：含有體積分?jǐn)?shù)分別為0.05％的Triton X-100、0.03％的Proclin-300的pH＝7.4濃度0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液；
發(fā)光底物液A配制方法為：每250ml溶液含有牛血清白蛋白2.5g、三羥甲基氨基甲烷(Tris)1.5g、3-氨基鄰苯二甲酰肼(魯米諾)0.05g、對位碘酚0.0075g，另外還有極少量鹽酸(每1000ml底物液A加500μl鹽酸)，用作調(diào)節(jié)溶液的pH值至pH＝9。
發(fā)光底物液B配制方法為：每250ml溶液含有牛血清白蛋白2.5g、Tris1.5g、過氧化氫0.25ml，另外還有極少量鹽酸(每1000ml底物液B加500μl鹽酸)，用作調(diào)節(jié)溶液的pH值至pH＝9。
此外，本發(fā)明試劑盒還設(shè)置有固定包被微孔板的板架，防止潮濕的干燥劑，用于存放一次實驗未用完微孔板的自封袋，以及用于實驗時避光的封板膜。
實施例二、聯(lián)合診斷胃病的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒的制備方法
(1)制備PGⅠ包被微孔板；
(2)制備PGⅡ包被微孔板；
(3)配制PGⅠ參考品和質(zhì)控品；
(4)配制PGⅡ參考品和質(zhì)控品；
(5)配制PGⅠ酶結(jié)合物；
(6)配制PGⅡ酶結(jié)合物；
(7)配制濃縮洗滌液；
(8)配制發(fā)光底物液A和發(fā)光底物液B；
(9)酶結(jié)合物、參考品、質(zhì)控品、濃縮洗滌液、發(fā)光底物液A和發(fā)光底物液B的分裝。
其中，PGⅠ包被微孔板的制備方法為：
(1)配制包被緩沖液：包被緩沖溶液為PH＝9.6的碳酸鹽緩沖液；配制方法如下：稱取2.93g NaHCO3、1.59g Na2CO3溶于1L純水中，調(diào)節(jié)PH值至9.6。
(2)包被：用包被緩沖液將PGⅠ單克隆抗體分別稀釋至5μg/mL作為包被液，按100μL/孔對微孔板進(jìn)行包被，室溫放置3小時后放于2～8℃靜置21小時，從而將PGⅠ單克隆抗體吸附于微孔板上。
(3)洗滌：使用濃縮洗滌液進(jìn)行洗滌，洗板兩次。
(4)封閉：使用封閉液對微孔板進(jìn)行封閉和保護(hù)，130μL/孔，4℃放置24小時，封閉液配制方法為：將10g BSA、20g海藻糖溶于1L包被緩沖液中，再加入0.3mL的Proclin-300。
(5)干燥：甩出板孔中的封閉液，用吸水紙吸干，18～25℃干燥48小時；
(6)分別將上述干燥后的微孔板裝入鋁箔袋，封口，2～8℃保存?zhèn)溆谩?/p>
所述PGⅡ包被微孔板的制備方法為：
(1)配制包被緩沖液：包被緩沖溶液為PH＝9.6的碳酸鹽緩沖液；配制方法如下：稱取2.93g NaHCO3、1.59g Na2CO3溶于1L純水中，調(diào)節(jié)PH值至9.6。
(2)包被：用包被緩沖液將PGⅡ單克隆抗體分別稀釋至5μg/mL作為包被液，按100μL/孔對微孔板進(jìn)行包被，室溫放置3小時后放于2-8℃靜置21小時，從而將PGⅡ單克隆抗體吸附于微孔板上。
(3)洗滌：使用濃縮洗滌液進(jìn)行洗滌，洗板兩次。
(4)封閉：使用封閉液對微孔板進(jìn)行封閉和保護(hù)，130μL/孔，4℃放置24小時，封閉液配制方法為：將10g BSA、20g海藻糖溶于1L包被緩沖液中，再加入0.3mL的Proclin-300。
(5)干燥：甩出板孔中的封閉液，用吸水紙吸干，18～25℃干燥48小時；分別將上述干燥后的微孔板裝入鋁箔袋，封口，2～8℃保存?zhèn)溆谩?/p>
PGⅠ參考品和質(zhì)控品的配制方法為：使用參考品稀釋液將PGⅠ標(biāo)準(zhǔn)品按一定的比例稀釋成0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、100ng/mL、350ng/mL的系列濃度，建立定量參考品。
PGⅡ參考品和質(zhì)控品的配制方法為：使用參考品稀釋液將PGⅡ標(biāo)準(zhǔn)品按一定的比例稀釋成0ng/mL、1ng/mL、3ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、100ng/mL的系列濃度，建立定量參考品。
參考品稀釋液的配制方法為：1)基礎(chǔ)緩沖溶液(Tris-Hcl)的配制：稱取6.057g Tris溶于1L純水中，用鹽酸調(diào)節(jié)PH值為8.5。2)稱取10g BSA、20g酪蛋白、100g蔗糖溶于1L的Tris-Hcl緩沖液中，再加入0.3mL的Proclin-300。
PGⅠ酶結(jié)合物為HRP標(biāo)記的PGⅠ單克隆抗體。
PGⅠ酶結(jié)合物的配制方法為：使用酶結(jié)合物稀釋液將HRP標(biāo)記的PGⅠ單克隆抗體溶液稀釋配制為1:1500的工作濃度。
PGⅡ酶結(jié)合物為HRP標(biāo)記的PGⅡ單克隆抗體。
PGⅡ酶結(jié)合物的配制方法為：使用酶結(jié)合物稀釋液將HRP標(biāo)記的PGⅡ單克隆抗體溶液稀釋配制為1:1000的工作濃度。
酶結(jié)合物稀釋液的配制方法為：1)基礎(chǔ)緩沖溶液(Tris-Hcl)的配制：稱取6.057g Tris溶于1L純水中，用鹽酸調(diào)節(jié)PH值為8.5。2)稱取20g BSA、100g蔗糖溶于1L的Tris-Hcl緩沖液中，再加入100mL的小牛血清和0.3mL的Proclin-300，經(jīng)過濾除菌后，加入5mL的酶穩(wěn)定劑AES。
實施例三、聯(lián)合診斷胃病的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒的使用方法
(1)樣品收集
靜置待測血清30min，對所述待測血清進(jìn)行離心處理10～20分鐘，即可進(jìn)行檢測。
(2)檢測方法
PGⅠ測定：
a、將在冷藏環(huán)境中貯存的各試劑等在室溫下平衡15分鐘以上；
b、將濃縮洗滌液按1:40的比例稀釋，搖勻備用，作為應(yīng)用洗滌液；
c、根據(jù)PGⅠ參考品、質(zhì)控品及待測樣品確定所需孔數(shù)；
d、直接取PGⅠ參考品、質(zhì)控品及待測樣品各50μL加入相應(yīng)孔內(nèi)；
e、取50μL PGⅠ酶結(jié)合物加入各孔，振蕩器振蕩30秒鐘，蓋上封板膜，置37℃水浴50～60分鐘；
f、取出微孔板，用洗滌液洗板5次，洗滌時每孔注滿洗滌液，停留10秒后吸盡拍干；
g、根據(jù)使用量，將底物液A、B按1：1混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配；每孔加入100μL，用振蕩器振蕩20秒鐘，設(shè)定每孔測量時間為1秒，于5分鐘內(nèi)測定結(jié)果。
PGⅡ測定：
a、將在冷藏環(huán)境中貯存的各試劑等在室溫下平衡15分鐘以上；
b、將濃縮洗滌液按1:40的比例稀釋，搖勻備用，作為應(yīng)用洗滌液；
c、根據(jù)PGⅡ參考品、質(zhì)控品及待測樣品確定所需孔數(shù)；
d、直接取PGⅡ參考品、質(zhì)控品及待測樣品各50μL加入相應(yīng)孔內(nèi)；
e、取50μL PGⅡ酶結(jié)合物加入各孔，振蕩器振蕩30秒鐘，蓋上封板膜，置37℃水浴50～60分鐘；
f、取出微孔板，用洗滌液洗板5次，洗滌時每孔注滿洗滌液，停留10秒后吸盡拍干；
g、根據(jù)使用量，將底物液A、B按1：1混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配；每孔加入100μL底物液A、B混合液，用振蕩器振蕩20秒鐘，設(shè)定每孔測量時間為1秒，于5分鐘內(nèi)測定結(jié)果
(3)檢測結(jié)果
根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)溶液發(fā)光值，借助微孔板化學(xué)發(fā)光儀分析軟件進(jìn)行四參數(shù)Logistic擬合，坐標(biāo)選擇X-Y，得標(biāo)準(zhǔn)曲線；也可采用雙對數(shù)Log(X)-Log(Y)線性分析方法，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計算出樣本中PGⅠ、PGⅡ的濃度。
(4)結(jié)果分析
在上述試劑盒的制備和使用的基礎(chǔ)上，本發(fā)明也提供了一種僅適用于本試劑盒的可供參考的判斷早期胃部疾病及胃癌風(fēng)險的檢測用標(biāo)志物聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)值，具體內(nèi)容如下：
1)各試劑盒的正常參考區(qū)間為：
a、正常人PGⅠ含量：60ng/mL～240ng/mL；
b、正常人PGⅡ含量：<15ng/mL；
c、PGⅠ與PGⅡ比值的正常標(biāo)準(zhǔn)值為：>7.5。
2)PGⅠ與PGⅡ進(jìn)行聯(lián)合檢測時的參考區(qū)間為：
a、PGⅠ：60ng/mL～240ng/mL；PGⅡ<15ng/mL；PGⅠ/PGⅡ>7.5或≤7.5，正常；
b、PGⅠ<60ng/mL或>240ng/mL；PGⅡ≧15ng/mL；PGⅠ/PGⅡ>7.5或≦7.5，則異常；
c、PGⅠ：60ng/mL～240ng/mL；PGⅡ≧15ng/mL；PGⅠ/PGⅡ>7.5，則正常；若PGⅠ/PGⅡ≦7.5，則異常；
d、PGⅠ<60ng/mL或>240ng/mL；PGⅡ<15ng/mL；若PGⅠ/PGⅡ>7.5，則正常；若PGⅠ/PGⅡ≦7.5，則異常；
若結(jié)果提示異常，則建議定期復(fù)查PG或進(jìn)一步進(jìn)行胃鏡檢查。
實施例四、聯(lián)合診斷胃病的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒的主要產(chǎn)品性能指標(biāo)為：
(1)最低檢測限(靈敏度)
10孔平行測定樣本稀釋液，計算測定結(jié)果的平均數(shù)(M)與標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，得出M+2SD對應(yīng)的發(fā)光值，代入劑量-反應(yīng)曲線，計算出相應(yīng)的濃度值，該濃度值即為本試劑盒的最低檢測限。經(jīng)驗證，本試劑盒的最低檢測限指標(biāo)檢測結(jié)果如下表：
表1試劑盒最低檢測限的測定
測定的PGⅠ樣本稀釋液的平均發(fā)光值M＝1125.1，SD＝143.57，將(M+2SD)的值帶入此次反應(yīng)曲線，得其靈敏度為：0.04ng/mL(<1ng/mL)，符合要求。
測定的PGⅡ樣本稀釋液的平均發(fā)光值M＝1158.60，SD＝157.64，將(M+2SD)的值帶入此次反應(yīng)曲線，得其靈敏度為：0.01ng/mL(<1ng/mL)，符合要求。
(2)劑量-反應(yīng)曲線的線性
PGⅠ：復(fù)孔測定試劑盒的參考品(S0～S5，濃度依次為0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、100ng/mL、350ng/mL)，用四參數(shù)進(jìn)行擬合，劑量-反應(yīng)曲線線性相關(guān)系數(shù)(r)應(yīng)不小于0.9900。經(jīng)驗證，r＝0.9997，符合要求。
PGⅡ：復(fù)孔測定試劑盒的參考品(S0～S5，濃度依次為0ng/mL、1ng/mL、3ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、100ng/mL)，用四參數(shù)進(jìn)行擬合，劑量-反應(yīng)曲線線性相關(guān)系數(shù)(r)應(yīng)不小于0.9900。經(jīng)驗證，r＝0.9998，符合要求。
(3)準(zhǔn)確度
PGⅠ：濃度為10ng/mL和100ng/mL的參考品的測定值與靶值的相對偏差(Bias％)應(yīng)不超過15.0％。
PGⅡ：濃度為3ng/mL和30ng/mL的參考品的測定值與靶值的相對偏差(Bias％)應(yīng)不超過15.0％。
表2試劑盒準(zhǔn)確度的測定
(4)精密度
a、分析內(nèi)精密度
PGⅠ：濃度分別為10ng/mL和100ng/mL的參考品重復(fù)檢測，其變異系數(shù)(CV)均應(yīng)不高于15.0％。經(jīng)驗證，10ng/mL、CV＝2.01％；100ng/mL、CV＝2.26％，符合要求。
PGⅡ：濃度分別為3ng/mL和30ng/mL的參考品重復(fù)檢測，其變異系數(shù)(CV)均應(yīng)不高于15.0％。經(jīng)驗證，3ng/mL、CV＝3.47％；30ng/mL、CV＝3.99％，符合要求。
b、分析間精密度
PGⅠ：同一批號試劑盒，用濃度分別為10ng/mL和100ng/mL的參考品檢測，3次獨立分析，其變異系數(shù)(CV)均應(yīng)不高于20.0％。經(jīng)驗證，10ng/mL、CV＝3.3％；100ng/mL、CV＝3.0％，符合要求。
PGⅡ：同一批號試劑盒，用濃度分別為3ng/mL和30ng/mL的參考品檢測，3次獨立分析，其變異系數(shù)(CV)均應(yīng)不高于20.0％。經(jīng)驗證，3ng/mL、CV＝4.5％；30ng/mL、CV＝4.1％，符合要求。
c、批間精密度
PGⅠ：用3個批號的試劑盒分別檢測濃度為10ng/mL和100ng/mL的參考品，各重復(fù)10次，則3個批號試劑盒之間的批間變異系數(shù)(CV)均應(yīng)不高于20.0％。經(jīng)驗證，10ng/mL、CV＝4.5％；100ng/mL、CV＝3.1％，符合要求。
PGⅡ：3個批號的試劑盒分別檢測濃度為3ng/mL和30ng/mL的參考品，各重復(fù)10次，則3個批號試劑盒之間的批間變異系數(shù)(CV)均應(yīng)不高于20.0％。經(jīng)驗證，3ng/mL、CV＝4.8％；30ng/mL、CV＝4.4％，符合要求。
從上述中可以看出，本發(fā)明設(shè)計的聯(lián)合診斷胃病或評價胃癌風(fēng)險的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒在靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度等各項質(zhì)量參數(shù)均處于領(lǐng)先地位。
實施例五、聯(lián)合診斷胃病的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒的檢測實例如下：
(1)PGⅠ：采用本發(fā)明試劑盒進(jìn)行檢測，總共檢測樣本240例。其中陽性樣本約80例(均經(jīng)胃鏡檢查，病理確診)；陰性樣本約160例(體檢后經(jīng)證實無消化道疾病，肝、腎疾病，無胃痛史人群)，其中包含干擾因素及交叉反應(yīng)樣本40例(高脂血樣本、溶血樣本、高膽紅素樣本、類風(fēng)濕因子陽性樣本各10例)。檢測結(jié)果如下表：
表3 PGⅠ考核試劑與對比試劑檢測結(jié)果比較
結(jié)論：t值＜t0.05,500＝1.965＜t0.05,200，P＞0.05，兩種試劑差別無顯著性，說明兩試劑測定結(jié)果高度相關(guān)，具有等效性。
PGⅠ考核試劑與對比試劑陽性符合率為98.75％，陰性符合率為100％，總符合率為99.58％。通過相關(guān)性分析、卡方檢驗及配對t檢驗，說明考核試劑和臨床診斷不存在顯著性差異，具有很好的相關(guān)性。
(2)PGⅡ：采用本發(fā)明試劑盒進(jìn)行檢測，總共檢測樣本240例。其中陽性樣本約80例(均經(jīng)胃鏡檢查，病理確診)；陰性樣本約160例(體檢后經(jīng)證實無消化道疾病，肝、腎疾病，無胃痛史人群)，其中包含干擾因素及交叉反應(yīng)樣本40例(高脂血樣本、溶血樣本、高膽紅素樣本、類風(fēng)濕因子陽性樣本各10例)。檢測結(jié)果如下表：
表4 PGⅡ考核試劑與對比試劑檢測結(jié)果比較
結(jié)論：t值＜t0.05,500＝1.965＜t0.05,200，P＞0.05，兩種試劑差別無顯著性，說明兩試劑測定結(jié)果高度相關(guān)，具有等效性。
PGⅡ考核試劑與對比試劑陽性符合率為97.5％，陰性符合率為100％，總符合率為98.75％。通過相關(guān)性分析、卡方檢驗及配對t檢驗，說明考核試劑和臨床診斷不存在顯著性差異，具有很好的相關(guān)性。
最后應(yīng)說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。