本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體的說是涉及細(xì)粒棘球絳蟲亮氨酸氨基肽酶的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：細(xì)粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus)屬帶科(Taeniidae)棘球?qū)?Echinococcus)，其中絳期幼蟲寄生于動物和人的肝、肺及其他器官內(nèi)所引起細(xì)粒棘球蚴病，又稱囊性包蟲病，是一種人獸共患病，主要寄生在人和家畜等多種哺乳動物體內(nèi)。90％以上的細(xì)粒棘球蚴包囊生長于宿主的肝臟、肺臟或者同時生長于肝肺。細(xì)粒棘球蚴病呈世界性分布，引起一系列的經(jīng)濟(jì)和公共衛(wèi)生問題。在一些流行地區(qū)，其感染率可高達(dá)5-10％，死亡率高達(dá)2-4％。據(jù)估計，全球人囊性棘球蚴病每年至少損失1-3.6百萬傷殘調(diào)整生命年(DALYs)，而動物囊性棘球蚴病每年造成的經(jīng)濟(jì)損失至少為20億美元。因此，世界衛(wèi)生組織已經(jīng)把棘球蚴病列為《被忽視的熱帶疾病》，作為其2008-2015年重點防治計劃。目前，細(xì)粒棘球蚴病免疫診斷的研究主要集中在粗囊液抗原上，但是其成分復(fù)雜，具有難以大量提純、抗原來源不穩(wěn)定、成本高、診斷特異性低等缺陷。缺乏標(biāo)準(zhǔn)有效的特異性重組抗原是細(xì)粒棘球蚴病免疫診斷中的一個尚未解決的難題。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供細(xì)粒棘球絳蟲亮氨酸氨基肽酶(Eg-lap)的應(yīng)用，使其能夠能被自然感染細(xì)粒棘球蚴病的綿羊陽性血清識別，具有良好的免疫原性，并具有較高的特異性和敏感性，減少與其他帶科絳蟲病陽性血清的交叉反應(yīng)。亮氨酸氨基肽酶(LAPs)具有水解N末端氨基酸的功能，屬于M1或者M(jìn)17基因家族，并且在調(diào)節(jié)合成代謝和分解代謝、維持細(xì)胞形態(tài)、生長和免疫方面具有重要的作用。LAPs是金屬肽酶；有Mn2+，Co2+，或者Ni2+離子存在時能提高該酶的活性。LAPs在較高溫度(60-70℃)和偏堿的PH(8.5-9.5)條件下仍然具有穩(wěn)定性。葡萄球菌的LAP參與葡萄球菌的生物膜形成和生長，表明LAP對在細(xì)菌生長和致病機(jī)理潛在的重要性。目前，關(guān)于亮氨酸氨基肽酶的研究在寄生蟲、線蟲和瘧原蟲上有一些功能性的報道，但是關(guān)于免疫抗原識別的研究還未見任何報道。因此，本發(fā)明對細(xì)粒棘球絳蟲亮氨酸氨基肽酶(Eg-lap)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并通過反轉(zhuǎn)錄表達(dá)出rEg-lap蛋白，制備出抗rEg-lap的多克隆抗體，對該蛋白進(jìn)行免疫印跡分析表明其可被自然感染細(xì)粒棘球蚴病的綿羊陽性血清識別，具有良好的免疫原性，利用rEg-lap蛋白建立細(xì)粒棘球蚴病間接ELISA診斷方法，為細(xì)粒棘球蚴病的防控提供監(jiān)測手段。因此，本發(fā)明提出了細(xì)粒棘球絳蟲亮氨酸氨基肽酶在制備檢測細(xì)粒棘球蚴病的免疫抗原和/或試劑盒中的應(yīng)用。其中，作為優(yōu)選，所述試劑盒為ELISA檢測試劑盒或免疫印跡檢測試劑盒。同時，本發(fā)明還提供了一種檢測細(xì)粒棘球蚴病的ELISA檢測試劑盒，包括細(xì)粒棘球絳蟲亮氨酸氨基肽酶(作為抗原進(jìn)行包被)和ELISA檢測試劑盒常規(guī)組分。所述試劑盒依據(jù)間接ELISA檢測原理。作為優(yōu)選，所述ELISA檢測試劑盒常規(guī)組分包括抗原包被液、酶標(biāo)板、封閉液、HRP標(biāo)記的二抗和TMB底物。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述封閉液為5％脫脂奶粉；所述HRP標(biāo)記的二抗為HRP標(biāo)記的山羊或綿羊抗兔二抗。在具體的ELISA檢測過程中，抗原包被最佳條件是4℃過夜，抗原最佳濃度為0.14μg/每孔，最佳血清稀釋濃度為1:80，血清孵育最佳時間是37℃1h，二抗孵育最佳時間是37℃1h，二抗最佳稀釋濃度為1:3000。作為優(yōu)選，所述ELISA檢測試劑盒常規(guī)組分還包括顯色反應(yīng)終止液H2SO4、洗滌液PBST和稀釋液PBS。本發(fā)明先提取細(xì)粒棘球絳蟲總RNA，而后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，根據(jù)Eg-lap的基因序列，用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計引物擴(kuò)增目的片段，然后進(jìn)行測序驗證。最后連接至表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)，獲得細(xì)粒棘球絳蟲亮氨酸氨基肽酶的反轉(zhuǎn)錄重組蛋白rEg-lap。免疫印跡顯示rEg-lap能被自然感染細(xì)粒棘球蚴病的綿羊陽性血清識別，具有良好的免疫原性。間接ELISA結(jié)果顯示，該方法的cut-off值為0.4952，特異性和敏感性分別為78.5％(11/14)和95.8％(23/24)。由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明提供了細(xì)粒棘球絳蟲亮氨酸氨基肽酶在制備檢測細(xì)粒棘球蚴病的免疫抗原和/或試劑盒中的應(yīng)用，其作為免疫抗原能夠被自然感染細(xì)粒棘球蚴病的綿羊陽性血清識別，應(yīng)用于間接ELISA檢測時，具備較高的特異性和敏感性，臨床檢測符合率高達(dá)97.9％。以細(xì)粒棘球絳蟲亮氨酸氨基肽酶為免疫抗原建立的檢測方法具有良好的診斷效果，可以用于疫區(qū)綿羊細(xì)粒棘球蚴病的初步篩選。附圖說明圖1所示為Eg-lapPCR擴(kuò)增凝膠圖；其中，M為DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1為Eg-lapcDNAPCR產(chǎn)物；圖2所示為rEg-lap的westernblot凝膠圖；其中，M為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品；1為IPTG誘導(dǎo)的含pET28a(+)-Eg-LAP的細(xì)菌；2為純化后的rEg-lap；圖3所示為rEg-lap的westernblot凝膠圖；其中，M為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品；1為自然感細(xì)粒棘球蚴病的綿羊陽性血清識別rEg-lap；2為健康綿羊血清識別rEg-lap；圖4所示為間接ELISA對不同血清的檢測結(jié)果；其中，橫坐標(biāo)從左至右依次為綿羊抗細(xì)粒棘球蚴陽性血清、綿羊抗腦多頭蚴陽性血清、山羊抗細(xì)頸囊尾蚴陽性血清；Cuto-offvalue表示臨界值；圖5所示為間接ELISA對不同血清的檢測結(jié)果；其中，橫坐標(biāo)從左至右依次為陽性血清和陰性血清；Cuto-offvalue表示臨界值。具體實施方式本發(fā)明公開了細(xì)粒棘球絳蟲亮氨酸氨基肽酶的應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明所述應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。在本發(fā)明具體實施方式中，各試驗所涉及的材料和試劑如下：1、主要試劑動物組織總RNA抽提試劑盒(TRIzol.R.TotalRNAIsolation.Reagent)和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit)，購自GIBCOBRL公司；DNAMarker、ProteinMarker、限制性內(nèi)切酶(BamHI、HindIII、EcoRI、XhoI)、T4DNA連接酶，購自TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、Ni-NTAAgarose，購自Qiagen公司；TaqPCRMasterMix、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、HRP-DAB底物顯色試劑盒，購自北京天根生化科技有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體，HRP標(biāo)記的兔抗山羊IgG抗體，HRP標(biāo)記的兔抗綿羊IgG抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體購自武漢博士德生物有限公司；IPTG，弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，購自Sigma公司；HiTrapProteinAHP，購自Bio-Rad公司，PCR引物合成和測序由上海英俊生物工程有限公司完成；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。2、菌株和質(zhì)粒載體宿主菌大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21(DE3)、pMD19-TVector購自TaKaRa公司；pET32a(+)載體由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物寄生蟲病實驗室提供。3、常用緩沖溶液和培養(yǎng)基的配制PBSBuffer①：分別稱取下列試劑于燒杯中：NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO41.42g，KH2PO40.27g。加入約500mL滅菌雙蒸水混勻溶解，加入濃HCl使pH達(dá)到7.4，定容到1L。高壓滅菌后室溫保存。電泳緩沖液(50×TAEBuffer)：稱取242gTris和37.2gNa2EDTA·2H2O于燒杯中，加入500mL滅菌雙蒸水并混勻溶解，加58mL的CH3COOH再次充分?jǐn)嚢?，定容?L并室溫保存。EB：將0.1gEB加入100mL的滅菌雙蒸水中，分裝后常溫保存。LB培養(yǎng)基：液態(tài)培養(yǎng)基：分別稱取Triptone10g，5gYeastExtract,10gNaCl加入燒杯中溶于500mL滅菌H2O中并用燒堿調(diào)節(jié)pH至7.0，定容到1L后高壓滅菌，4℃保存。LB平板：每1L溶液中加15g瓊脂粉，高壓滅菌，4℃保存。IPTG溶液：電子天平稱取2g的異丙基硫代半乳糖苷溶于8mL超純水中，充分?jǐn)嚢枞芙夂蠹铀?0mL，用0.45μm濾膜過濾后用EP管分裝貯存于-20℃。30％聚丙烯酰胺溶液：稱取0.8g的Bis-acrylamide和29.2g的Acrylamide，加入50mL去離子水混勻溶解，加水到100mL，用0.22μm濾膜過濾。1MTris-HCl(pH6.8)：稱取12.11g的Tris于燒杯中，加80mL雙蒸水充分?jǐn)嚢枞芙?，加濃鹽酸并使用酸度計調(diào)整pH到6.8后加水到100mL，用0.22μm濾膜過濾。1.5MTris-HCl(pH8.8)：取19g的Tris于燒杯中，加50mL雙蒸水充分?jǐn)嚢枞芙?，加濃鹽酸并使用酸度計調(diào)整pH到8.8后加水到100mL，4℃保存。10％十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液：稱取10g的SDS于燒杯中，加入80mL雙蒸水充分?jǐn)嚢枞芙夂蠖ㄈ葜?00mL，用0.45μm濾膜過濾后常溫保存。10％過硫酸銨溶液：稱取0.1g的APS，加水定容到1mL，常溫保存?？捡R斯亮藍(lán)染色液：用電子天平稱取0.1g考馬斯亮藍(lán)粉末于20mL酒精中，取100mL濃磷酸到200mL，用0.45μm濾膜過濾后常溫保存。氨芐西林鈉溶液(AMP)：使用電子天平稱取1gAmpicilin粉末，吸取9mL超純水充分?jǐn)嚢枞芙夂蠖ㄈ葜?0mL，用0.22μm微孔濾膜過濾除菌，分裝EP管-20℃保存。4、試驗動物2只健康新西蘭兔，1.4～2.2kg，購自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗動物中心。下面結(jié)合實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。實施例1：細(xì)粒棘球蚴總RNA的提取細(xì)粒棘球絳蟲的中絳期幼蟲(細(xì)粒棘球蚴)包囊來自于自然感染的綿羊肝臟，樣本采自青海西寧或四川甘孜，液氮保存。取出液氮保存的細(xì)粒棘球蚴，用研缽將其磨碎，隨后參照天根的動物組織RNA提取試劑盒說明書提取總RNA。(1)每10-20mg原頭蚴加300μL裂解液，使用研磨棒研磨；(2)向勻漿液中加入ProteinaseK(10μL)和RNase-FreeddH2O(590μL)，混勻后反應(yīng)15min(56℃)。(3)離心5min(12,000rpm)，將上清轉(zhuǎn)移到干凈的管子中；在管子中加入0.5倍上清體積的無水乙醇，混勻后轉(zhuǎn)入吸附柱中，離心1min(12,000rpm)后棄廢液。(4)在吸附柱中加去蛋白質(zhì)液RW1(350μL)，離心1min(12,000rpm)后，棄廢液。(5)將DNaseI工作液(80μL)加入吸附柱，室溫放置反應(yīng)15min；隨后加去蛋白質(zhì)液RW1(350μL)，離心1min(12,000rpm)后棄廢液。(6)500μL漂洗液RW加入吸附柱中，放置2min(室溫)，離心1min(12,000rpm)后棄廢液。(7)重復(fù)(6)。(8)空離，棄廢液，晾干殘余漂洗液。(9)把吸附柱放入一個新的離心管中，用RNase-FreeddH2O(30-100μL)洗脫，靜置2min(室溫)，離心2min(12,000rpm)后得到細(xì)粒棘球蚴總RNA提取液。實施例2：第一鏈cDNA的合成以抽提的細(xì)粒棘球蚴總RNA為模板，以O(shè)ligodT(18)為反轉(zhuǎn)錄引物，參照Thermo公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作：(1)冰上制備反應(yīng)混合物OligodT181μL模板RNA1μLDEPCddH2O1μL(2)在70℃(5min)孵育后轉(zhuǎn)到冰上冷卻(3)在冰上按照順序加入以下反應(yīng)物：5reactionbuffer4μL核糖核酸酶抑制劑1μL10dNTP混合物2μL(4)37℃(5min)孵育后加RevertAidTM反轉(zhuǎn)錄酶1μL。(5)PCR程序：42℃，1h；70℃，10min。(6)得到的cDNA于-80℃保存。實施例3：Eg-lap基因的擴(kuò)增根據(jù)Eg-lap的基因序列，用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計引物：上游：5’-CCGGAATTCATGTGGCGCTTTTTATC-3’下劃線為EcoRI下游：5’-CCGCTCGAGCTCTAAAAGTTCAGCAAGTG-3’下劃線XhoI擴(kuò)增體系(25μL)：DNA模板各1μL，上下游引物各1μL，PCRMixture12.5μL，滅菌雙蒸水9.5μL。擴(kuò)增條件：預(yù)變性：95℃5min；38個循環(huán)(變性：95℃，40s；退火：54℃，45s；延伸：72℃，45s)；最后延伸：72℃，10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠中電泳，Gold-view染色，以細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴的cDNA為模板擴(kuò)增出一條1824bp左右的條帶，與預(yù)期相符(圖1)，切下目的條帶，純化并連接到pMD19-T載體。實施例4：Eg-lap基因克隆測序和比對(1)將下列試劑混合：4μL的Solution1，3.5μL的模板DNA，0.5μL的pMD19-Tvector，放入離心機(jī)瞬離后放于16℃恒溫水連接過夜。(2)從-70℃出感受態(tài)細(xì)胞，室溫融化后取30μL放入空EP管中，將連接過夜的8μL產(chǎn)物加入EP管并用微量加樣槍輕輕吹打混勻，立刻放入冰水混合物冰浴30min。42℃水浴90s立即冰浴5min。每個EP管中加入600μL的LB溶液，37℃中180r/min培養(yǎng)1.5h。將混勻的溶液倒在到LB平板上，37℃冷卻1h使表面干燥，反倒平板過夜。(3)挑取菌落到空EP管中，加入1mLLB溶液和1μLAMP溶液，160r/min震蕩培養(yǎng)6h至其渾濁。吸取1μL菌液擴(kuò)增并將產(chǎn)物跑電泳后觀察。選取電泳觀察陽性的菌液送至英濰捷基公司進(jìn)行測序。經(jīng)測序得到的序列與Eg-lap的序列同源性達(dá)到100％。實施例5：Eg-lap基因克隆、鑒定及轉(zhuǎn)化1、質(zhì)粒提取按照質(zhì)粒抽提試劑盒說明書提取PCR鑒定為陽性的克隆菌株質(zhì)粒，具體操作程序如下：(1)接種單個菌落于5mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃震蕩培養(yǎng)過夜后，將渾濁的培養(yǎng)液吸入另一離心管，12,000r/min離心30s，去掉上清。(2)向吸附柱中加入500μL的平衡液BL，12,000r/min離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中；(3)向離心管中加入250μL的預(yù)冷溶液(P1)，振蕩懸浮細(xì)胞；(4)向離心管中加入250μL溶液P2，輕柔地上下顛倒離心管使菌體與P2溶液充分混勻，靜置離心管數(shù)分鐘，至液體澄清為止；(5)向離心管中加入350μL溶液P3，輕柔地上下顛倒離心管，13,000r/min離心10min；(6)將上清液轉(zhuǎn)移到吸附柱中，靜置5min，待質(zhì)粒DNA與吸附柱充分結(jié)合，12,000r/min離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中；(7)將收集管中液體再次轉(zhuǎn)移到吸附柱，重復(fù)步驟(6)；(8)倒掉收集管中的廢液，向吸附柱中加入500μL去蛋白液，靜置1min，12,000r/min離心1min；(9)倒掉收集管中的廢液，向吸附柱中加入700μL漂洗液，12,000r/min離心1min；(10)重復(fù)步驟(9)(11)將吸附柱放入收集管中，放在12,000r/min空離2min，最大限度去除多余的漂洗液；(12)向吸附柱中滴加50μL已預(yù)熱的TE溶液，室溫靜置5min待TE溶液完全浸透硅膠膜，12000r/min，離心1min收集質(zhì)粒DNA溶液；(13)將離心管底部的溶液再次滴加到吸附柱中，重復(fù)步驟(12)，以最大程度的得到質(zhì)粒DNA。2、質(zhì)粒酶切回收將提取的pMD19-T-LAP用EcoRI和XhoI雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離后，用膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物。酶切體系如下：EcoRI，1μL；XhoI，1μL；10×Mbuffer，2μL；pMD19-T-LAP質(zhì)粒，10μL；ddH2O，6μL；共計20μL。3、目的片段連接表達(dá)載體將經(jīng)過EcoRI和XhoI酶切后的pMD19-T-LAP質(zhì)粒和pET28a(+)質(zhì)粒，在T4DNA連接酶的作用下，16℃過夜連接，連接體系如下：雙酶切LAP產(chǎn)物，4.5μL；pET28a(+)質(zhì)粒，1μL；ddH2O，2.5μL；10×T4DNALigasebuffer，1μL；T4DNALigase，1μL；共計10μL。將以上連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，并將其鋪于含有氨芐青霉(50μg/mL)的LB培養(yǎng)基中，37℃倒置過夜培養(yǎng)，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定。4、pET28a(+)-LAP重組質(zhì)粒雙酶切鑒定對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，方法參照“2、質(zhì)粒酶切回收”。實施例6：重組Eg-lap在大腸桿菌中的表達(dá)1、重組蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)將pET28a(+)-LAP質(zhì)粒的單個白色菌落BL21(DE3)接入2mLLB培養(yǎng)液(含Kana50μg/mL)中，37℃搖床過夜培養(yǎng)；分別取1mL培養(yǎng)液接種于另外兩瓶100mL的含Kana(100μg/mL)的LB培養(yǎng)液中，37℃搖床下培養(yǎng)直4h；其中一瓶中加入IPTG至終濃度1mmol/L，另一瓶為對照培養(yǎng)(不加IPTG)；分別取1mL菌液移入兩個新的離心管中，12,000r/min離心2min，去上清收集菌體。2、表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析(1)正確安裝聚丙烯酰胺凝膠電泳玻璃板，在兩塊玻璃板間注入雙蒸水，檢查裝置是否漏液，若不漏液則可繼續(xù)后面操作；(2)按表1配制12％分離膠5mL，用微量加樣器將分離膠迅速沿長玻璃板加入兩塊已經(jīng)固定好的玻璃板中，加至約距短玻璃板頂端1.5cm處時，立即向玻璃板中加入適量的雙蒸水，室溫下靜置待聚合，當(dāng)膠與水層間的界面重新出現(xiàn)時表明膠已聚合；(3)按后表配制5％的濃縮膠1mL，混勻，用濾紙小心吸干水層后，使用微量加樣器將濃縮膠注入，并插入樣品梳，防止梳子底部產(chǎn)生氣泡，待膠凝固后，取出樣品梳；(4)將提取的菌液蛋白按1:1的比例分別加入2倍樣品緩沖液，混勻后，100℃沸水浴5min，以12,000r/min離心10min。用微量加樣器在樣品孔內(nèi)分別加入標(biāo)準(zhǔn)樣品和待檢樣品，每孔10μL；(5)蓋上電泳槽，接通電源，70V恒壓電泳，直至溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)整為180V，當(dāng)溴酚藍(lán)前沿移至接近膠底時，斷開電源，停止電泳；(6)取出凝膠后，置于平皿中用蒸餾水漂洗3次，加入考馬斯亮藍(lán)R-250染色液，將平板放置于搖床上，室溫染色60min；(7)取出已經(jīng)染好色的凝膠，置于平皿中，用自來水漂洗3次后，往平皿中加入考馬斯亮藍(lán)脫色液，當(dāng)脫色液顏色變深時更換脫色液，直至蛋白條帶清晰。(8)拍照，保存實驗結(jié)果。表1試劑12％分離膠5％濃縮膠緩沖液(mL)－0.25緩沖液(mL)1.3－Acr/Bis貯液(mL)2.00.33ddH2O(mL)1.61.410％APS(mL)0.050.0210％SDS(mL)0.050.02TEMED(μL)223、重組蛋白的純化(1)將過夜培養(yǎng)的含pET28a(+)-LAP的BL21(DE3)菌落接種至含50μg/mL濃度Kana的LB液體培養(yǎng)基中，在最適IPTG工作濃度和最佳誘導(dǎo)時間條件下，搖床振蕩培養(yǎng)，獲得重組蛋白菌液；(2)將菌液12,000r/min離心10min，棄上清，留菌體，-20℃放置50min，反復(fù)凍融，使菌體細(xì)胞壁充分破除；(3)超聲波破碎菌體，直到菌液澄清，并依次用含有不同濃度尿素的蛋白緩沖液洗滌沉淀；(4)洗滌后，再用含8mol/L尿素結(jié)合蛋白緩沖液，懸浮沉淀，冰上放置60min，12,000r/min離心30min，用NC膜(孔徑0.45mm)過濾收集上清液；(5)用His結(jié)合樹脂純化，用緩沖液(50mmol/L咪唑，6mol/L尿素，0.5mol/LNaCl，20mmol/LTris-HC1pH7.9)洗去雜蛋白，用洗脫液(lmol/L咪唑，6mol/L尿素，0.5mol/LNaC1，20mmol/LTris-HC1pH7.9)洗脫目的重組蛋白；(6)4℃下，將重組蛋白分別在含2mol/L尿素的PBS及PBS溶液中依次透析，將重組蛋白溶液進(jìn)行冷凍干燥后，-80℃保存?zhèn)溆谩?、結(jié)果通過SDS-PAGE可溶性分析表明，重組表達(dá)蛋白大多數(shù)位于細(xì)菌包涵體，有少量在上清，誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物為與約6kDa的His-tag蛋白相偶聯(lián)的融合蛋白，大小約71.8kDa，rEg-lap表達(dá)為可溶性蛋白，純化后的重組蛋白為單一條帶(圖2)。實施例7：免疫原性分析1、兔抗rEg-lap-IgG的制備將純化后的rEg-lap蛋白分別與弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑按照1:1比例混合制備乳劑苗。對兩只新西蘭兔進(jìn)行皮下四次注射免疫，每次間隔兩個周免疫一次，第一次用弗氏完全佐劑和200μg重組蛋白皮下注射免疫，后三次均用弗氏不完全佐劑和200μg重組蛋白皮下注射免疫。免疫結(jié)束后，使用HiTrapProteinA1mL預(yù)裝柱和HPLC純化系統(tǒng)(Bio-Rad)純化血清，將流速調(diào)為1.0mL/min，使用A2Buffer洗柱子10min。將0.45μmNC膜過濾過的血清放入柱子中，0.5mL/min。用10-20ml的BBuffer洗脫，收集洗脫下來的IgG，并用50mM的Tris調(diào)節(jié)洗脫下來的IgG溶液的PH。平衡后用20％的酒精洗滌柱子，直到離子濃度降為0。通過SDS-PAGE鑒定抗體純化情況。2、免疫印跡(1)按照上述方法制備蛋白質(zhì)電泳凝膠，對純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳。(2)蛋白質(zhì)電泳結(jié)束后，取蛋白質(zhì)所在的相應(yīng)凝膠部位，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中進(jìn)行平衡，共3次，每次4min。(3)將硝酸纖維素濾膜(NC膜)和24層濾紙置于轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡5min。(4)按順序?qū)㈥帢O電極板、24層濾紙、凝膠、NC膜、24層濾紙置于Bio-Rad半干式轉(zhuǎn)印槽內(nèi)，蓋上陽極電極板。(5)將電轉(zhuǎn)移裝置接到電轉(zhuǎn)儀上，并加入轉(zhuǎn)移緩沖液35mA轉(zhuǎn)移30min。(6)轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出NC膜，浸泡在3％BSA的TBST中，4℃封閉過夜。(7)封閉結(jié)束后，剪開NC膜，陰性和陽性分開放置，加入1：1000稀釋的一抗，室溫孵育2h后，倒掉一抗，用TBST快速洗膜3次，5min/次。(8)將HRP標(biāo)記的Goat-anti-sheepIgG按1:1000稀釋后，加入NC膜，室溫孵育2h后，倒掉二抗，用TBST快速洗膜3次，5min/次。(9)將NC膜置于平皿中，以新鮮底物顯色液沖洗直至顯色。(10)顯色后，用雙蒸水沖洗NC膜終止顯色，并對結(jié)果進(jìn)行拍照記錄。3、結(jié)果免疫印跡顯示，rEg-lap能被細(xì)粒棘球蚴病陽性綿羊血清識別，且為單一條帶(圖3)，說明rEg-lap具有較好的免疫原性。實施例8：間接ELISA方法的建立1、間接ELISA操作步驟(1)以抗原包被液按比列稀釋rEg-lap蛋白，每孔100μL加入96酶標(biāo)板中進(jìn)行包被；(2)倒掉包被液，拍干孔內(nèi)液體，用PBST洗滌，重復(fù)四次；(3)加入封閉液(5％的脫脂奶粉)封閉后，洗滌四次；(4)用PBS按比例稀釋血清后，加入酶標(biāo)孔孵育，倒掉液體，洗滌四次；(5)加入稀釋好的HRP標(biāo)記的山羊或綿羊抗兔二抗，孵育，洗滌四次；(6)在避光條件下向孔中加入可溶性單組分底物TMB進(jìn)行顯色反應(yīng)；(7)在孔中加入100μL2MH2SO4終止反應(yīng)，在紫外吸光度為450nm時測定其OD值。(8)倒掉液體，拍干后，按(2)所示洗滌四次，每次3min；(9)倒掉液體，拍干后，在避光條件下進(jìn)行顏色反應(yīng)，向孔中加入可溶性單組分底物TMB，每孔100μL，室溫孵育10～20min；(10)再向孔中加入100μL2MH2SO4終止反應(yīng)，立即將96孔板置于酶標(biāo)儀上，在紫外吸光度為450nm時測定其OD值。2、確定最佳條件(1)抗原包被濃度及抗體稀釋度的確定。將重組蛋白用包被液稀釋為5.6、2.8、1.4、0.7、0.35和0.175ug/mL，100ul每孔，包被96孔板，4℃過夜；洗滌、封閉后，將陰性和陽性血清分別按1:20、1:40、1:80、1：160、1：320、1：640倍比稀釋，每孔100ul，37℃反應(yīng)2h。后面步驟按常規(guī)ELISA方法進(jìn)行，以P/N值最大時的條件為最佳抗原濃度和最佳血清稀釋度。(2)酶標(biāo)記二抗稀釋度的確定?？乖脱遄罴褲舛却_定以后，將HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG按1:250、1：500、1:1000、1:2000和1:4000倍稀釋，反應(yīng)1h，再加入TMB顯色，出現(xiàn)P/N值最大的二抗?jié)舛葹樽罴严♂尪取?3)血清最佳反應(yīng)時間的確定。將抗原和血清稀釋到最佳濃度后，分別反應(yīng)0.5、1、1.5和2h，加入酶標(biāo)二抗，顯色測定OD450nm，以P/N值確定最佳反應(yīng)時間。(4)酶標(biāo)二抗最佳孵化時間的確定。加二抗后分別作用60、90和120min，常規(guī)方法進(jìn)行ELISA試驗。比較各組陰、陽性血清的OD450nm值和P/N值，以確定二抗最佳的反應(yīng)時間。間接ELISA結(jié)果顯示，抗原包被最佳條件是4℃過夜，抗原最佳濃度為0.14μg/每孔，最佳血清稀釋濃度為1:80，血清孵育最佳時間是37℃1h，二抗孵育最佳時間是37℃1h，二抗最佳稀釋濃度為1:3000。3、臨界值的確定在最佳條件下，測定24份綿羊細(xì)粒棘球蚴病陰性血清的OD450。設(shè)置2個重復(fù)。按照臨界值＝平均值+3倍標(biāo)準(zhǔn)差計算。用24份綿羊陰性血清樣品的OD450值確定臨界值，通過統(tǒng)計學(xué)分析，計算出24份綿羊陰性血清樣品OD450值的平均值為0.3404，標(biāo)準(zhǔn)差為0.0516。根據(jù)計算公式：臨界值＝陰性樣本OD450平均值+3倍標(biāo)準(zhǔn)差，得出臨界值為0.4952，即OD450>0.4952時，理論上可判定為陽性，OD450<0.4952可判定為陰性。4、敏感性和特異性檢測用建立的間接ELISA法檢測24份綿羊細(xì)粒棘球蚴陽性血清、7份山羊細(xì)頸囊尾蚴陽性血清、7份綿羊腦多頭蚴陽性血清和24份健康羊的血清，分別用下列公式對本方法的敏感性和特異性進(jìn)行了評價：敏感性(％)＝ELISA檢測陽性×100/真陽性；特異性(％)＝ELISA檢測陰性×100/真陰性。24份綿羊細(xì)粒棘球蚴陽性血清僅有1份OD450值低于cut-off值，敏感性為95.8％(23/24)；7份山羊細(xì)頸囊尾蚴陽性血清和7份綿羊腦多頭蚴陽性血清分別有2份、1份OD450值高于cut-off值，24份健康山羊血清OD450值均低于cut-off值，特異性為78.5％(11/14)(見圖4和圖5)。8、臨床試驗用建立的間接ELISA方法分別對24份細(xì)粒棘球蚴病陰性綿羊血清和24分細(xì)粒棘球蚴病陽性綿羊血清進(jìn)行檢測，根據(jù)臨界值判斷該方法的可靠性。用24份綿羊細(xì)粒棘球蚴病陽性血清和24份陰性血清對建立的間接ELISA方法進(jìn)行臨床檢測(見圖5)，結(jié)果顯示23份綿羊細(xì)粒棘球蚴病陽性血清的OD450均大于臨界值，24份陰性血清OD450均小于臨界值，檢測的符合率高達(dá)97.9％(47/48)。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3