技術(shù)領(lǐng)域
本申請涉及生物檢測領(lǐng)域，具體涉及胃病的檢測。
背景技術(shù)：
胃蛋白酶原II(簡稱PG II)來源于全胃腺和遠(yuǎn)端十二指腸Brunner氏腺，胃粘膜合成的PGII約為總量的25％，PG II大部分進(jìn)入消化道，少量進(jìn)入血液循環(huán)，因此被稱為“反映胃部狀態(tài)和功能的指針”。
國內(nèi)外臨床研究指出，PG II與胃底粘膜病變的相關(guān)性較大，其升高與胃底腺管萎縮、腸上皮化生或假幽門腺化生、異型增生有關(guān)。測定PG II含量有助檢測出十二指腸潰瘍、萎縮性胃炎、胃炎、胃癌等其他消化道疾病，供臨床檢測和體檢篩查需求。在人群胃病篩查中，每個人做胃鏡是不現(xiàn)實的，可通過非侵入性血清PG檢測將淺表性胃炎、糜爛性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃癌等高危人群篩查出來，再進(jìn)行胃鏡檢查是一種切實可行的方案?，F(xiàn)有技術(shù)已知采用時間分辨熒光測量技術(shù)，組建的PGII的TRFIIA試劑盒是目前PGII檢測方法中最靈敏、測量范圍最寬的方法之一，但是價格昂貴不利于大規(guī)模推廣。
系統(tǒng)進(jìn)化指數(shù)富集技術(shù)(SELEX技術(shù))是20世紀(jì)90年代初發(fā)展起來的一種新的組合化學(xué)技術(shù)，其運用大容量的隨機(jī)寡核苷酸文庫，結(jié)合體外PCR擴(kuò)增技術(shù)，以指數(shù)富集與靶分子特異結(jié)合的寡核苷酸，經(jīng)過多輪篩選，獲得親和力高、特異性強(qiáng)的寡核苷酸適配子(aptamers)。該技術(shù)己成功運用于許多靶分子的篩選，包括金屬離子、有機(jī)染料、藥物、蛋白質(zhì)、氨基酸以及各種細(xì)胞因子等。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是通過系統(tǒng)進(jìn)化指數(shù)富集技術(shù)(SELEX技術(shù))篩選胃蛋白酶原II的寡核苷酸適配子來替代抗體，提供一種簡潔快速、高靈敏度、高特異性的胃蛋白酶原II早期檢測及分離純化方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案：
本發(fā)明中用于系統(tǒng)進(jìn)化指數(shù)富集技術(shù)篩選的單鏈DNA隨機(jī)文庫及引物，由美國invitrogen公司合成，兩端為固定序列，中間為42個堿基的隨機(jī)序列：5'-TACGACATGAACCGTGATAA(N42)CAGTGAAACCTGATGATCGA-3'，庫容量為1014以上；
引物1:5'–TACGACATGAACCGTGATAA-3'；
引物2:5'-TCGATCAGCAGGTTTCACTG-3'。
人胃蛋白酶原II根據(jù)CN103387971A中公開的重組人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白的方法制備獲得；
GelRed核酸染料購于Biotium公司；
硝酸纖維素濾膜購于美國密理博(MilliPore)公司；
寡聚核苷酸的純化試劑購于北京天為時代公司；
PCR試劑盒和T載體購于美國普洛麥格(ftOmega)公司。
一種親和人胃蛋白酶原II核酸適配子，其特征在于核苷酸序列為：SEQ ID NO：1-17任一所示的DNA分子。
一種上述親和人胃蛋白酶原II核酸適配子，其特征在于：具有相同功能的寡核苷酸適配子同源序列占60％以上。
一種上述親和人胃蛋白酶原II核酸適配子，其特征在于：衍生的RNA序列具有相同的功能。
一種上述親和人胃蛋白酶原II核酸適配子，其特征在于：為能與DNA序列進(jìn)行雜交的寡核苷酸序列。
一種上述親和人胃蛋白酶原II核酸適配子，其特征在于：在核酸適配子的任何位置刪除或增加部分寡核苷酸殘基所得到的寡核苷酸適配子序列具有相同的功能。
一種上述親和人胃蛋白酶原II核酸適配子，其特征在于：在核酸適配子的任何位置進(jìn)行核苷酸種類和稀有堿基的置換后，得到的寡核苷酸適配子序列具有相同的功能。
一種上述親和人胃蛋白酶原II核酸適配子，其特征在于：在核酸適配子的任何位置進(jìn)行磷酸化、甲基化、氨基、巰基、同位素、生物素、地高辛、熒光物質(zhì)、納米發(fā)光材料或酶標(biāo)記修飾后，得到的寡核苷酸適配子序列具有相同的功能。
一種上述親和人胃蛋白酶原II核酸適配子，其特征在于：用于人胃蛋白酶原II的檢測和分離純化，從而用于腦疾病的檢測。
一種上述親和人胃蛋白酶原II核酸適配子的制備方法，按以下步驟進(jìn)行：1)單鏈DNA隨機(jī)寡核苷酸文庫的合成；2)利用系統(tǒng)進(jìn)化指數(shù)富集方法對寡核苷酸文庫進(jìn)行篩選；3)擴(kuò)增與人白蛋白特異結(jié)合的寡核苷酸；4)進(jìn)行下一輪篩選，經(jīng)過12輪以上篩選后獲得目的寡核苷酸序列；5)克隆測序。
本發(fā)明的優(yōu)點是：具有簡便、快速、經(jīng)濟(jì)等特點，與其他組合化學(xué)庫如隨機(jī)肽庫、抗體庫和噬菌體表面展示文庫相比，從寡核苷酸文庫中篩選出的適配子具許多優(yōu)勢：1)本身是寡核苷酸，分子量較小，可以化學(xué)合成，節(jié)約成本；2)具有比抗體更高的親和性和特異性；3)便于標(biāo)記且可以在不同部位有選擇性的標(biāo)記；4)重復(fù)性和穩(wěn)定性好，且易于保存，即對高溫和劇烈條件不敏感。因此，系統(tǒng)進(jìn)化指數(shù)富集技術(shù)具有良好的應(yīng)用前景。
具體實施方式
實施例1人胃蛋白酶原II的制備
根據(jù)CN103387971A中公開的重組人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白的方法制備獲得人胃蛋白酶原II，蛋白濃度為100mg/mL。
實施例2合成隨機(jī)單鏈DNA文庫和引物
隨機(jī)單鏈DNA(ssDNA)文庫:5'-TACGACATGAACCGTGATAA(N42)CAGTGAAACCTGATGATCGA-3'，構(gòu)建了長度為82nt的隨機(jī)ssDNA文庫，兩端為固定引物序列，中間為42個堿基的隨機(jī)序列，庫容量為I014以上；引物1:5'–TACGACATGAACCGTGATAA-3'；引物2:5'-TCGATCAGCAGGTTTCACTG-3'；將隨機(jī)ssDNA文庫和兩種引物均用TE緩沖液配制成100μmol/L貯存液_20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>
將單鏈DNA文庫擴(kuò)增為雙鏈DNA,產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收純化；以回收的雙鏈DNA為模板，體外轉(zhuǎn)錄出單鏈RNA隨機(jī)文庫，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)PAGE純化。75μg RNA文庫經(jīng)硝酸纖維素膜反篩去除與膜結(jié)合的RNA分子，然后與2ug人胃蛋白酶原II蛋白，37℃孵育30min，反應(yīng)液經(jīng)硝酸纖維素膜濾過，洗滌濾膜；然后將濾膜剪碎，置于洗脫緩沖液(6mol/L尿素，0.55mol/L醋酸銨，l.5mmol/L EDTA,0.15％SDS)中煮沸5min，離心，取上清，無水乙醇沉淀RNA，并重新溶解于20μ1DEPC水中；以RNA為模板RT-PCR擴(kuò)增雙鏈DNA，體外轉(zhuǎn)錄出RNA文庫用于下一輪篩選；每輪篩選過程中RT-PCR得到雙鏈DNA文庫，以該雙鏈DNA為模板體外轉(zhuǎn)錄出RNA適配子庫，篩選共進(jìn)行10輪。得到了14個適配子，其序列分別為SEQ ID NO:1-14所示。具體序列如下所示：
實施例3蛋白結(jié)合適配子的性能測定
將適配子分別取2.0μg，用牛小腸堿性磷酸酶(CIP)37℃消化lh，純化回收去磷酸化的RNA；通過T4多核苷酸激酶標(biāo)記[γ-32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末端。10nmol放射性標(biāo)記的適配子分別與不同濃度(1-200nM)的人胃蛋白酶原II 37℃孵育30min，各組反應(yīng)液經(jīng)硝酸纖維素膜濾過，洗滌濾膜，干燥濾膜，液閃計數(shù)儀測定濾膜上殘留的放射量，同一樣品平行做兩次測定。計算各個適配子與目的蛋白的解離常數(shù)。結(jié)果如下：
實施例4所述適配子特異性分析以及穩(wěn)定性分析
分別采用人血白蛋白，免疫血清球蛋白，pg120蛋白，大腸桿菌外膜蛋白A，胃蛋白酶原II，與14條適配子進(jìn)行特異性檢測，經(jīng)過結(jié)合試驗發(fā)現(xiàn)，這些適配子都不與這些蛋白相結(jié)合，而只與人蛋白結(jié)合保持較高的特異性。
將所述的適配子，取0.2ug，分別置于常溫的血清、水溶液中，放置四周。通過RT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)四周的放置其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，沒有被降解。
實施例5所述適配子疾病的診斷
取9個胃潰瘍患者和4個正常人的血液，使用生理鹽水稀釋，獲得目標(biāo)樣本。
將14個偶聯(lián)有標(biāo)記的適配子分別與9個患者以及4個正常人的樣本混合40min，通過生物素分離，定量分析其中的人胃蛋白酶原II的含量，通過分析發(fā)現(xiàn)，9個患者中胃蛋白酶原II的含量顯著增加，超過了規(guī)定的閾值。達(dá)到了相應(yīng)胃病病的診斷標(biāo)準(zhǔn)。由此可見，其診斷效果較好。
以上僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
序列表
〈110〉盧美珍
〈120〉一種用于胃病檢測的試劑盒
〈160〉14
〈210〉1
〈211〉 82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉PG II-1
TACGACATGAACCGTGATAACTCATATATGTTCCCAACACGTCCAACTTATCCCTGACAATACAGTGAAACCTGATGATCGA
〈210〉2
〈211〉 82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉PG II-2
TACGACATGAACCGTGATAACCGCTTCACACACTACCGCTCTCTCTTAGACTATTAACAATTCAGTGAAACCTGATGATCGA
〈210〉3
〈211〉 82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉PG II-3
TACGACATGAACCGTGATAAATTCATACTTGTACAAATACTCTCGCATCTCCACTTATAATACAGTGAAACCTGATGATCGA
〈210〉4
〈211〉 82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉PG II-4
TACGACATGAACCGTGATAAATAATTCTTTGCTTACCCTAAATATTCCAAACCCATCGACCACAGTGAAACCTGATGATCGA
〈210〉5
〈211〉 82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉PG II-5
TACGACATGAACCGTGATAAACCTTATTATCCTACCACATCTCCTCAAACCAGCATTTAATACAGTGAAACCTGATGATCGA
〈210〉6
〈211〉 82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉PG II-6
TACGACATGAACCGTGATAACAATCCACTGCCTCATTCCTTCCTTTATTCACATATTCCAAACAGTGAAACCTGATGATCGA
〈210〉7
〈211〉 82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉PG II-7
TACGACATGAACCGTGATAACGCTTATCTTCTCACATAATTCCGAAACATAAAACCTCTCCACAGTGAAACCTGATGATCGA
〈210〉8
〈211〉 82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉PG II-8
TACGACATGAACCGTGATAAATCGCCAACACCCTCCGTCTCGCTCTCCTAATATACAATCCTCAGTGAAACCTGATGATCGA
〈210〉9
〈211〉 82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉PG II-9
TACGACATGAACCGTGATAATCGAACATTAACAATACCACGCCTATATTCTTAACATAAATACAGTGAAACCTGATGATCGA
〈210〉10
〈211〉 82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉PG II-10
TACGACATGAACCGTGATAACACTTATAACAAACTCCAAGCCTCCTACAACGTACTATCACACAGTGAAACCTGATGATCGA
〈210〉11
〈211〉 82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉PG II-11
TACGACATGAACCGTGATAAAAATATAAAGCTCTATGTTATTCACACGCATACTTCTTATCACAGTGAAACCTGATGATCGA
〈210〉12
〈211〉 82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉PG II-12
TACGACATGAACCGTGATAACGCCCTACAATTCCCAATTAGCCTATTATTTAACATCCTAATCAGTGAAACCTGATGATCGA
〈210〉13
〈211〉 82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉PG II-13
TACGACATGAACCGTGATAACCATATCTTGACCTATCACTTAGCCTAAATACTTTAAACATTCAGTGAAACCTGATGATCGA
〈210〉14
〈211〉 82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉PG II-14
TACGACATGAACCGTGATAACTACCTTCATACAATCGCAATATTCACTTTTAAACACAATAACAGTGAAACCTGATGATCGA