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一種用于檢測七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒抗體的膠體金免疫層析檢測試紙及其應(yīng)用的制作方法

文檔序號:11946428閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種用于檢測七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒抗體的MCP重組蛋白的編碼基因,其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO:3 所示。

2.一種用于檢測七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒抗體的膠體金免疫層析檢測試紙,其特征在于:所述檢測試紙包括有底座、襯板、試紙芯和覆蓋于試紙芯上的面板,襯板連接在底座之上,所述試紙芯安裝在襯板內(nèi),所述面板上設(shè)有加樣孔和結(jié)果顯示窗,所述試紙芯包括樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素反應(yīng)膜和吸水墊,依次粘貼于襯板上;

所述加樣孔設(shè)于樣品墊的上方位置,所述結(jié)果顯示窗設(shè)于硝酸纖維素反應(yīng)膜上方對應(yīng)的位置,所述硝酸纖維素膜上設(shè)有檢測線和對照線,檢測線上包被有七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP重組蛋白,對照線上包被有鼠抗七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP蛋白單克隆抗體,所述的膠體金結(jié)合墊為包被有膠體金標(biāo)記的七帶石斑魚MCP重組蛋白的玻璃纖維紙。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的膠體金免疫層析檢測試紙,其特征在于:所述七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP重組蛋白的包被量為1.0 ~ 10μg蛋白,所述膠體金標(biāo)記的七帶石斑魚MCP重組蛋白中膠體金標(biāo)記量為1~20μg/mL,所述鼠抗七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP蛋白單克隆抗體的包被量為0.5 ~5.0μg 蛋白。

4.根據(jù)權(quán)利要求2 所述的膠體金免疫層析檢測試紙,其特征在于:所述檢測線和對照線兩者線間距為5-7 mm。

5.根據(jù)權(quán)利要求2 所述的膠體金免疫層析檢測試紙,其特征在于:所述的七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP重組蛋白采用以下方法制備得到:

(1) 七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP蛋白重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒RNA 為模板,設(shè)計引物克隆得到編碼七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP蛋白的cDNA 序列,將該序列插入表達(dá)載體,獲得重組表達(dá)載體;

(2) 七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)

將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌,挑選含重組表達(dá)載體的大腸桿菌接種到培養(yǎng)基中進(jìn)行擴大培養(yǎng),然后加入IPTG 誘導(dǎo)表達(dá),收集細(xì)菌培養(yǎng)物;

(3) 七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP重組包涵體蛋白的變復(fù)性

收集包涵體,包涵體用緩沖液稀釋后,裝入透析袋中進(jìn)行透析;

(4) 七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP重組蛋白的Ni柱親和純化;

將透析后的包涵體溶液上樣至親和層析柱進(jìn)行蛋白純化,收集蛋白流出液;將其裝入透析袋中進(jìn)行透析,獲得純化的MCP重組蛋白。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的膠體金免疫層析檢測試紙,其特征在于:所述步驟(1) 中引物序列為:

正向引物(F):Forward 5’-CCGGAATTCATGGTACGCAAAGGTGAGAAG-3’;

反向引物(R):Forward 5’-CCGCTCGAGGTTTTCCGAGTCAACCCTAGTG-3’。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的膠體金免疫層析檢測試紙,其特征在于:所述步驟(2)中當(dāng)細(xì)菌濃度生長到OD600=0.5~1.0時,按濃度0.5 ~ 0.7mmol/L 加入IPTG 誘導(dǎo)3 ~5h,離心,收集細(xì)菌培養(yǎng)物。

8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的免疫層析檢測試紙,其特征在于:所述膠體金標(biāo)記的七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP重組蛋白采用以下方法制備得到:采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液,取膠體金溶液和七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP重組蛋白,攪拌震蕩使其結(jié)合,加入牛血清白蛋白,離心,棄上清,沉淀加入金標(biāo)緩沖溶液懸浮后定容制得。

9.權(quán)利要求2所述的膠體金免疫層析檢測試紙在制備用于檢測七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒抗體的檢測用品中的應(yīng)用。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的膠體金免疫層析檢測試紙在制備用于檢測七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒抗體的檢測用品中應(yīng)用,其特征在于:在加樣孔內(nèi)加入稀釋后的魚類待檢血清樣本,靜置后如果若檢測線和對照線均呈現(xiàn)紅色,表明待檢血清樣本中含有神經(jīng)壞死病毒抗體;如果只有對照線呈現(xiàn)紅色,表明檢測樣品中不含有神經(jīng)壞死病毒抗體。

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