專利名稱：一種肌紅蛋白檢測試劑盒及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術領域，具體地說涉及一種檢測人肌紅蛋白的檢測試劑盒。
背景技術：
肌紅蛋白存在于肌肉中，心肌中含量特別豐富，肌紅蛋白是目前人類研究最多的蛋白質之一。肌紅蛋白是哺乳動物肌肉中運輸氧的蛋白質。它由一條多肽鏈構成，有153個氨基酸殘基和一個血紅素輔基，分子量為17 800。具有在肌細胞內轉運和貯存氧的功能。人體心肌、骨骼肌內含有大量肌紅蛋白，正常人的血液中很少，主要由腎臟代謝并排泄。肌 紅蛋白增高見于急性心肌梗死早期、急性肌損傷、肌營養(yǎng)不良、肌萎縮、多發(fā)性肌炎、急性或慢性腎功能衰竭、嚴重充血性心力衰竭和長期休克等。肌紅蛋白更是檢測急性心肌梗死(AMI)的早期指標，在AMI后1_2小時，在患者血清中的濃度即迅速增加，6-9 h達到高峰。一旦患者診斷為AMI且已進行相應治療，主要的是進一步評價患者在住院期間是否有并發(fā)癥及再梗死。此時用肌鈣蛋白可能是不適宜的，因為疾病發(fā)作后肌鈣蛋白的長期釋放模式可能掩飾發(fā)生額外新的損傷。而肌紅蛋白在發(fā)作后第一天內即返回到基線濃度，當有再梗死時，則又迅速上升，形成"多峰"現(xiàn)象，可以反映局部缺血心肌周期性自發(fā)的冠脈再梗塞和再灌注。肌紅蛋白測定方法很多，其敏感性和特異性不同。分光光度法是1963年Reynafarje等首先建立，將待測肌紅蛋白轉變?yōu)镃O化合物，測其中兩個最大吸收峰(538nm，568nm)，計算肌紅蛋白含量，但敏感度較差，故僅適用于含量較高標本的檢測。用HPLC法測定血清或尿肌紅蛋白最低檢測限為2mg/L，線性范圍為2(T3000mg/L。但需特殊設備，不適合中、小型醫(yī)院開展。超濾法在測定肌紅蛋白回收率時出現(xiàn)高度差異，而免疫檢測法不受尿中其它蛋白質或顆粒性物質的影響，并且能準確地測定尿中肌紅蛋白含量。用超濾-浸潰片法定性地檢測尿肌紅蛋白，對肌紅蛋白繼發(fā)腎功能障礙的患者可能造成誤診，特別是在尿肌紅蛋白< 60000 μ g/L時，上述方法均不適用于臨床常規(guī)應用。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種肌紅蛋白的檢測試劑盒。該試劑盒可直接應用于全自動生化分析儀上，結果準確性強、試劑穩(wěn)定性好、使用方便、便于大規(guī)模推廣。本發(fā)明的另一目的是提供上述檢測試劑盒的生產制備及使用方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的試劑盒組成為
試劑Rl :緩沖液、聚乙二醇、疊氮鈉、乙二胺四乙酸鈉、牛血清白蛋白；
試劑R2:緩沖液、結合有肌紅蛋白單克隆抗體的乳膠粒子、吐溫-20、疊氮鈉、乙二胺四乙酸鈉、牛血清白蛋白。本發(fā)明提供的上述試劑盒的制備方法及操做步驟如下
(a)按下列比例配制好試劑試劑Rl
Tris 緩沖液 200-220mmol/L 聚乙二醇5-10 mmol /I,
疊氮鈉1-5 mmol/L
乙二胺四乙酸鈉l_5mmol/L 牛血清白蛋白 l-5mmol/L ;
試劑R2
Tris 緩沖液 200-220mmol/L
結合有肌紅蛋白單克隆抗體的乳膠粒子 3.5-5% (v/v)
吐溫-20l-5mmol/L
疊氮鈉O. 5-3 mmol/L
乙二胺四乙酸鈉l_5mmol/L 牛血清白蛋白 l_5mmol/L
(b)將試劑與待測樣本按一定比例混合，使其完全反應；
(c)用半/全自動生化分析儀測定吸光度變化值；
Cd)根據(jù)吸光度變化值計算出樣本中肌紅蛋白的濃度。
具體實施例方式下述實施例是為了更詳細的解釋本發(fā)明，但不應理解為本發(fā)明局限于此。實施例I :
本發(fā)明的試劑盒舉例是雙試劑，其中
試劑Rl
Tris 緩沖液 200mmol/L 聚乙二醇8 mmol /I,
疊氮鈉5 mmol/L
乙二胺四乙酸鈉5mmol/L 牛血清白蛋白 5mmol/L ;
試劑R2
Tris 緩沖液 200mmol/L
結合有肌紅蛋白單克隆抗體的乳膠粒子 5% (v/v)
吐溫 _20Smmol /I,
疊氮鈉3 mmol/L
乙二胺四乙酸鈉5mmol/L 牛血清白蛋白 5mmol/L。實施例2 :試劑盒使用方法。I.試劑準備，試劑為液體雙試劑，開瓶即用，其中
試劑Rl Tris 緩沖液 200mmol/L 聚乙二醇8 mmol /I,疊氮鈉5 mmol/L
乙二胺四乙酸鈉5mmol/L 牛血清白蛋白 5mmol/L ;
試劑R2
Tris 緩沖液 200mmol/L
結合有肌紅蛋白單克隆抗體的乳膠粒子 5% (v/v)
吐溫 _20Smmol /I,
疊氮鈉3 mmol/L
乙二胺四乙酸鈉5mmol/L 牛血清白蛋白 5mmol/L。2.全自動生化儀參數(shù)設置
(a)檢測溫度37°C
(b)檢測波長主波長為500nm;副波長為700 nm ；
(c)反應時間8分20秒，其中，溫育時間3分鐘，反應時間100秒，檢測時間220秒。3.檢測步驟(全部在全自動生化分析儀中完成)
(a)取150μ L試劑I和10 μ L血清樣本混勻；
(b)將混勻后的溶液在37°C溫育3分鐘；
(c)添加50μ L試劑2，反應100秒后，在500nm條件下檢測220秒的吸光度變化。4.通過讀取的連詞吸光度值的計算出肌紅蛋白的濃度。本發(fā)明具有的優(yōu)點
該試劑盒結果準確性強、試劑穩(wěn)定性好、使用方便、便于大規(guī)模推廣。所需檢測儀器(生化分析儀)在各大醫(yī)院和檢測中心普遍使用。
權利要求
1.一種肌紅蛋白檢測試劑盒，其組成為試劑R1、試劑R2， 其中 a、試劑Rl 包括200-220mmol/L Tris 緩沖液、5-10 mmol/L 聚乙二醇、1_5 mmol/L 疊氮鈉、l-5mmol/L乙二胺四乙酸鈉、l_5mmol/L牛血清白蛋白； b、試劑R2200-220mmol/L Tris緩沖液、結合有肌紅蛋白單克隆抗體的乳膠粒子、l_5mmol/L 吐溫 _20、0. 5-3 mmol/L 疊氣納、l_5mmol/L 乙二胺四乙酸納、l-5mmol/L 牛血清白蛋白。
2.權利要求I的試劑盒，其特征在于試劑R2中的肌紅蛋白單克隆抗體的乳膠粒子的制備方法為10. 5mg/ml的肌紅蛋白單克隆抗體與10%的乳膠顆粒(直徑50_100nm),加入到200-220mmol/L Tris緩沖液中，震蕩反應4小時，離心去上清，再用200-220mmol/L Tris緩沖液稀釋至O. 5%，并加入O. 1-0. 3 mmol/L疊氮鈉。
3.上述試劑盒的制備和操作方法，主要步驟為 (a)按下列比例配制好試劑 試劑Rl Tris 緩沖液 200-220mmol/L 聚乙二醇5-10 mmol /I, 疊氮鈉1-5 mmol/L 乙二胺四乙酸鈉l_5mmol/L 牛血清白蛋白 l-5mmol/L ; 試劑R2 Tris 緩沖液 200-220mmol/L 結合有肌紅蛋白單克隆抗體的乳膠粒子 3.5-5% (v/v) 吐溫-20l-5mmol/L 疊氮鈉0. 5-3 mmol/L 乙二胺四乙酸鈉l_5mmol/L 牛血清白蛋白 l_5mmol/L (b)將試劑與待測樣本按一定比例混合，使其完全反應； (c)用半/全自動生化分析儀測定吸光度變化值； Cd)根據(jù)吸光度變化值計算出樣本中肌紅蛋白的濃度。
4.權利要求3的方法，其特征在于，被測樣品與試劑比例應控制在I: 15到I :25之間。
5.權利要求3的方法，其特征在于，反應溫度為37(±1) °C。
6.權利要求3的方法，其特征在于，反應時間為8-12分鐘。
7.權利要求3的方法，其特征在于，用半/全自動生化分析儀檢測的主波長為500nm，副波長為700 nm。
全文摘要
一種肌紅蛋白的檢測試劑盒。試劑盒盒體內包括試劑R1緩沖液、聚乙二醇、疊氮鈉、乙二胺四乙酸鈉、牛血清白蛋白；試劑R2緩沖液、結合有肌紅蛋白單克隆抗體的乳膠粒子、吐溫-20、疊氮鈉、乙二胺四乙酸鈉、牛血清白蛋白。通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列反應，再將反應物置于半/全自動生化分析儀下，檢測主波長500nm處吸光度變化的速度，從而測算出肌紅蛋白的濃度大小。本試劑盒具有準確、穩(wěn)定、方便的優(yōu)點。
文檔編號G01N33/68GK102818899SQ20121029078
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月16日 優(yōu)先權日2012年8月16日
發(fā)明者謝兵 申請人:北京恩濟和生物科技有限公司