專利名稱：合金氧化物納米管陣列上固定的肌紅蛋白電化學(xué)生物傳感器的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及污染控制和材料化學(xué)領(lǐng)域，尤其是涉及一種合金氧化物納米管陣列上固定的肌紅蛋白電化學(xué)生物傳感器的制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
三氯乙酸(TCA)，是有機鹵素環(huán)境污染物之一，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)和公共安全領(lǐng)域， 也經(jīng)常存在于用次氯酸消毒過的飲用水中。對三氯乙酸的毒理學(xué)研究表明，三氯乙酸能夠?qū)е律矬w內(nèi)的肺腫瘤，也可以造成癌癥和影響人類生殖功能。世界衛(wèi)生組織明確規(guī)定水環(huán)境中三氯乙酸的安全存在量為100 ygL—1。因此，研發(fā)出快速而準(zhǔn)確的分析方法來檢測三氯乙酸的含量是非常必要的。傳統(tǒng)的用于檢測三氯乙酸的方法通常是氣相色譜和液相色譜法。色譜法雖然能夠提供比較準(zhǔn)確的檢測，但是，它通常需要繁瑣的樣品制備過程、昂貴的儀器和高度專業(yè)的技術(shù)操作人員。同時色譜法也難以實現(xiàn)實時現(xiàn)場監(jiān)測，因而在實際應(yīng)用中受到限制。一種替代的檢測技術(shù)，電化學(xué)生物傳感器，由于具有相對簡單、可以實現(xiàn)快速檢測，同時也具有高靈敏和高選擇性，引起了科學(xué)家們的興趣和關(guān)注。在發(fā)展電化學(xué)生物傳感器時，一個非常重要的關(guān)鍵點就是能夠制備出一種理想的基底材料提供快速的電子轉(zhuǎn)移通道。一些納米管材料(碳納米管等)，由于具有生物兼容性好、比表面積大、生物分子易于在表面修飾和負(fù)載等優(yōu)點，已廣泛地用于蛋白質(zhì)直接電化學(xué)反應(yīng)和生物傳感器的電極基體材料。但我們應(yīng)該注意到在碳納米管表面實現(xiàn)生物分子的直接電化學(xué)和生物傳感，需要將碳納米管修飾在一定的基底上，不僅過程冗繁，而且其穩(wěn)定性也常常值得懷疑。近年來， 在鈦基底上由電化學(xué)陽極化得到的TiO2納米管陣列(TW2 NTs),由于其具有環(huán)境友好性、低成本、高的表面活性位點和相對較高的催化活性，在光催化降解污染物、光解水產(chǎn)氫、染料敏化太陽能電池等方面得到了廣泛的應(yīng)用。同時，由于其具有化學(xué)惰性、高的尺寸穩(wěn)定性、 親水性和生物兼容性，經(jīng)常被用來固定生物分子，實現(xiàn)生物分子的直接電化學(xué)，并用來制備電化學(xué)生物傳感器。但是，由于TW2 NTs的半導(dǎo)體特性，導(dǎo)致其導(dǎo)電能力相對較差，從而導(dǎo)致了在簡單的TW2納米管內(nèi)難以實現(xiàn)生物分子的電化學(xué)傳感。在TiA納米管內(nèi)填塞具有導(dǎo)電性和生物催化活性的摻雜物種可以克服這一缺點。Liu等在納米管內(nèi)同時吸附巰瑾和辣根過氧化物酶，制備了一種新穎的H2A傳感器。Kafi等通過在Au修飾的TW2納米管內(nèi)修飾殼聚糖和辣根過氧化物酶，實現(xiàn)了對H2A的電化學(xué)傳感。我們的前期工作也成功將納米金顆粒修飾在TiO2納米管內(nèi)，實現(xiàn)了細(xì)胞色素C的直接電化學(xué)和對H2O2的催化還原測定。 這些工作都取得了很有意義的結(jié)果。但是我們可以注意到，在這些研究工作中，都用到了一種或者幾種媒介物，以提高T^2納米管的導(dǎo)電性，來促進生物分子直接電化學(xué)和生物催化作用的實現(xiàn)。由于這些媒介物是填塞在納米管道內(nèi)，或多或少對納米管結(jié)構(gòu)特有的自由空間和高比表面積會造成一定的破壞，生物分子在納米管內(nèi)的負(fù)載量因而大打折扣。同時也會帶來一些雜質(zhì)響應(yīng)信號。這些因素都會對所制備電化學(xué)生物傳感器的靈敏度和可重復(fù)性造成不利的影響。
因此采用貴金屬摻雜的鈦合金作為原材料，采用簡單的電化學(xué)陽極化的方法，在鈦合金基底上原位直立生長出高度有序的貴金屬摻雜的TW2納米管，在提高TW2納米管電催化性能的同時，完美的保持了納米管陣列結(jié)構(gòu)和高比表面積、高親水性和優(yōu)異的生物兼容性等優(yōu)點，使其成為一種制備電化學(xué)生物傳感器的基底材料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種制備工藝簡單， 成本低廉，檢測速度快，靈敏度高的合金氧化物納米管陣列上固定的肌紅蛋白電化學(xué)生物傳感器的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)
本發(fā)明提出的合金氧化物納米管陣列上固定的肌紅蛋白電化學(xué)生物傳感器的制備方法，具體步驟如下
(1)將合金Ti-Pd(Pd的重量百分比為0. 2-0. 5%)表面用金相砂紙進行打磨拋光，并依次在丙酮、二次蒸餾水、無水乙醇中超聲清洗各l(T20min ；
(2)在含有0.2(Γ0.30 %的冊(氫氟酸)溶液中，以步驟(1)預(yù)處理過的鈦合金片為工作電極，鉬片為對電極，進行預(yù)氧化處理，預(yù)氧化電位為+1(T20V ；
(3)在含有0.2(Γ0. 30%的NH4F, Γ2% H2O的乙二醇溶液中，以步驟(2)得到的鈦合金片為工作電極，鉬片為對電極，進行電化學(xué)陽極化處理，在鈦合金基底表面獲得有序的納米管陣列，陽極化電位為+3(T40V;
(4)將步驟(3)制備得到的鈦合金片在管式爐中采用程序升溫進行熱處理，得到電催化性能良好、高比表面積、高親水性和良好生物兼容性的Pd-TW2 NTs ；
(5)將步驟(5)得到的Pd-TW2NTs浸于含有5(Γ80μ mol/L馬心肌紅蛋白pH為7. 0 的磷酸鹽緩沖溶液中2(T30h，得到肌紅蛋白自組裝的Pd-TW2 NTs,即為產(chǎn)品。本發(fā)明中，步驟中所述熱處理為按廣5°C /min的升溫速率升至45(T550°C熱處理；T5h。利用本發(fā)明方法合成的肌紅蛋白電化學(xué)生物傳感器用于測定含鹵有機廢水，具體步驟為以肌紅蛋白電化學(xué)生物傳感器為工作電極，鉬絲為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，采用恒電位下電流-時間曲線的方法，對有機含鹵廢水進行測定。本發(fā)明中，所述含鹵有機廢水為含有三氯乙酸(TCA)的廢水。所述的基底材料Pd-TW2 NTs是以Ti-0. 2Pd合金為基底，經(jīng)電化學(xué)陽極化方法處理制備得到的具有高的電催化活性和高比表面積、高親水性、良好生物兼容性的Ti-Pd合金氧化物納米管陣列Pd-Tih NTs。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明用于固定蛋白質(zhì)的基底材料，是利用電化學(xué)陽極化 Ti-o. 2Pd合金而不是純鈦板，在Ti-o. 2Pd合金上原位直立生長一層高度有序的混合氧化物納米管陣列Pd-TiA NTs，所得到的納米管陣列在獲得高的電催化活性的同時，保持了傳統(tǒng)TiA NTs的優(yōu)點。利用該納米管陣列可以進行生物分子組裝并進而對含鹵有機廢水-三氯乙酸進行高靈敏測定，具體包括以下優(yōu)點
(1)與傳統(tǒng)TiA NTs納米管陣列相比，由于采用Ti-o. 2Pd合金而不是純鈦板作為原始材料，Pd-TiA NTs納米管陣列在納米管的管底和管壁都高度均勻的原位摻雜有Pd，使得所得到的納米管具有良好的導(dǎo)電性和電催化活性。(2) Pd-TiO2 NTs納米管陣列形成的同時伴隨著Pd的摻雜，不同于傳統(tǒng)摻雜的方法，即在TiA NTs制備完成后，再通過電沉積和化學(xué)氣相沉積等方法在TiA NTs上修飾一層具有電催化活性的物質(zhì)。Pd-TW2 NTS納米管陣列的形成和Pd的摻雜是在一個步驟內(nèi)全部完成。(3)基底材料的制備很容易控制，通過改變電化學(xué)陽極化的參數(shù)，可以得到形貌可控的納米管陣列結(jié)構(gòu)，制備工藝簡單，成本低廉。(4)由于Pd-TW2 NTs納米管陣列兼具高催化活性、高比表面積和良好生物兼容性，可以擁有更多的電催化活性位點和組裝更多的肌紅蛋白分子，使得本發(fā)明制備的電化學(xué)生物傳感器對于含鹵有機廢水的電化學(xué)測定具有極高的靈敏度。


圖1為實施例1制備的Pd-TiA NTs的掃描電鏡照片。圖2為實施例1制備的Pd-TW2 NTs和TW2 NTs在鐵氰化鉀溶液中的交流阻抗圖。圖3為實施例1制備的Pd-TW2 NTs的接觸角示意圖。圖4為肌紅蛋白分子固定在實施例1制備的Pd-TW2 NTs上和處于溶液中時的紫外-可見吸收光譜圖。圖5為實施例1制備的Pd-TW2 NTs與傳統(tǒng)TW2 NTs對肌紅蛋白直接電子傳遞的對比。圖6為實施例2制備電化學(xué)生物傳感器在連續(xù)添加一定量三氯乙酸的0. Imol Γ1 磷酸鹽緩沖溶液中的電流響應(yīng)圖(內(nèi)插圖為所得到的電流響應(yīng)與三氯乙酸的線性關(guān)系曲線)。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明進行詳細(xì)說明。實施例1
一種快速而靈敏測定致癌性物質(zhì)三氯乙酸的合金氧化物納米管陣列上固定的肌紅蛋白電化學(xué)生物傳感器的制備方法，具體包括以下步驟
將厚度為0. 4mm的Ti-o. 2Pd合金(Pd的重量比為0. 2%)表面依次用100#，300#和 500 #砂紙打磨，用金相砂紙進行拋光，使合金板表面如鏡面般光滑，然后將打磨過地合金片依次在丙酮、二次蒸餾水、無水乙醇中超聲清洗各15min后，用二次蒸餾水清洗干凈。隨后進行預(yù)氧化，以得到的鈦合金片為工作電極，鉬片為對電極。預(yù)氧化的電解液組成為0. 25% HF，預(yù)氧化電位為20V，預(yù)氧化時間為lh。預(yù)氧化完成后，進行陽極化。陽極化的電解液為含有0. 25%的NH4F, 1% H2O的乙二醇溶液。以得到的鈦合金片為工作電極，鉬片為對電極， 進行電化學(xué)陽極化處理，陽極化電位為+35V，陽極化時間為池。將陽極化后的鈦合金片在管式爐中采用程序升溫進行熱處理，即按1°C /min的升溫速率升至500°C熱處理3h，得到 Pd-TiO2 NTs ；
材料表面形貌通過場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM)進行表征，見圖1，從圖上可以看到在Ti-Pd合金片表面已經(jīng)形成了一層高度有序的納米管陣列Pd-TW2 NTs。納米管呈現(xiàn)出管口開放且管底閉合的形式，管與管之間連接緊密。從表面和截面圖可以看到陽極化后形成的納米管，管口直徑約為70nm，管長約300nm，管壁厚10nm。采用三電極電化學(xué)測量體系，在CHI660c電化學(xué)工作站上，以制備得到的 Pd-TiO2 NTs為工作電極，鉬電極為對電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極，在5mmol/L K4(Fe[CN]6) + 5 mmol/L K3(Fe[CN]6)+0. IM KCl溶液中測定電極的電化學(xué)阻抗譜，見圖2， 可以看到，由合金制備Pd-TW2 NTs電極，相比于TW2 NTs來說，其電荷傳遞電阻大幅度下降，由原來的7600Ω降低到600Ω。表明Pd摻雜后，其導(dǎo)電性和電催化能力的確有很大程度的提高。采用靜滴接觸角/界面張力測量儀對Pd-TW2 NTs表面與純水之間的接觸角進行了測量，見圖3。如圖3所示，Pd-TW2 NTs表面與水的接觸角達(dá)低于10°，跟傳統(tǒng)TW2 NTs 與純水之間的接觸角接近，這表明由Ti合金制備的納米管陣列保持了良好的親水性。將制備得到的Pd-TiR NTs浸泡于含有50 μ M Mb的0. 1Μ，ρΗ為7. 0的磷酸鹽緩沖溶液中Mh，得到Mb/Pd-TiA NTs傳感器。采用紫外-可見吸收光譜儀對固定在Pd-TW2 NTs上和處于溶液中的Mb進行了表征，見圖4。如圖4所示，在Pd-TW2 NTs上固定了肌紅蛋白后，在410nm處有一個最大吸收峰，這與處于溶液狀態(tài)的肌紅蛋白在406nm有一個吸收峰相比，只有4nm的位移，表明 Pd-TNTs是一個生物兼容性很好的材料，同時也表明肌紅蛋白成功負(fù)載到了 Pd-TiO2 NTs 上。采用三電極電化學(xué)測量體系，在CHI660c電化學(xué)工作站上，以制備得到的Mb/ Pd-TiO2 NTs為工作電極，鉬電極為對電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極，在0. 1M，ρΗ為 7.0的磷酸鹽緩沖溶液中測定電極的循環(huán)伏安曲線，見圖5，可以知道，在電位掃描范圍內(nèi)， Pd-TiO2 NTs在PBS中沒有氧化還原峰，而Mb/Pd-TiA NTs在矢量電位為_0. 375V的地方有一對峰形良好的氧化還原峰，說明這一對位于-0. 375V的峰是由于所固定的Mb的氧化還原所產(chǎn)生的。圖5中對比實驗的結(jié)果表明固定在Ti02 NTs內(nèi)的Mb僅僅表現(xiàn)出非常微弱的氧化還原峰。這清楚地表明Mb的直接電化學(xué)更容易在Pd-TW2 NTs內(nèi)實現(xiàn)。再一次表明本發(fā)明所制備的Pd-TW2 NTs比傳統(tǒng)TW2 NTs具有更高的電催化活性。實施例2
采用得到的Mb電化學(xué)生物傳感器測定廢水中的三氯乙酸
采用三電極電化學(xué)測量體系，在CHI660c電化學(xué)工作站上，以制備得到的Mb/Pd-TiA NTs為工作電極，鉬電極為對電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極，以0. 1M，ρΗ為7. 0的磷酸鹽緩沖溶液為支持電解質(zhì)，在工作電極上施加-0. 4V的偏壓。向反應(yīng)池中連續(xù)加入標(biāo)準(zhǔn)三氯乙酸溶液，三氯乙酸在工作電極上被固定在Pd-TiO2 NTs上的Mb電化學(xué)還原而產(chǎn)生電流信號，加入標(biāo)準(zhǔn)三氯乙酸后的溶液與空白溶液產(chǎn)生的電流差即為響應(yīng)電流，根據(jù)響應(yīng)電流與標(biāo)準(zhǔn)三氯乙酸溶液濃度的關(guān)系繪制工作曲線；向反應(yīng)池中加入待測含三氯乙酸有機鹵廢水溶液，測得響應(yīng)電流，通過計算即可得到待測三氯乙酸溶液的濃度。如圖6，連續(xù)加入一定量標(biāo)準(zhǔn)三氯乙酸溶液后，三氯乙酸被Mb電化學(xué)還原產(chǎn)生電流信號，電流10 S內(nèi)可達(dá)到穩(wěn)定，加入樣品溶液與空白溶液產(chǎn)生的電流差值即為響應(yīng)電流。 制備的Mb電化學(xué)傳感器對三氯乙酸測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖6插圖，從圖中可以看到，電流響應(yīng)與三氯乙酸理論濃度值形成良好的線性關(guān)系，線性方程為I (μ A)= -7. 76Ctca ( μ mol/ L) -105，相關(guān)系數(shù)為0. 998，其檢測限為94nmol/L，檢測范圍為0. 5^96ymol/L0
上述的對實施例的描述是為了便于該技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能理解和應(yīng)用本發(fā)明。熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的人員顯然可以容易地對這些實施例做出各種修改，并把在此說明的一般原理應(yīng)用到其他實施例中而不必經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動。因此，本發(fā)明不限于這里的實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，對于本發(fā)明做出的改進和修改都應(yīng)該在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種合金氧化物納米管陣列上固定的血紅素類蛋白質(zhì)電化學(xué)生物傳感器的制備方法，其特征在于具體步驟如下(1)將合金Ti-Pd板表面用金相砂紙進行打磨拋光，并依次在丙酮、二次蒸餾水、無水乙醇中超聲清洗各l(T20min ；其中Pd的重量百分比為0. 2^0. 5% ；(2)將步驟(1)預(yù)處理過的鈦合金片作為工作電極，以鉬片為對電極，在含有0.2(Γ0. 30 %的氫氟酸溶液中進行預(yù)氧化處理；(3)在含有0.2(Γ0. 30%的NH4F, Γ2% H2O的乙二醇溶液中，以上述步驟(2)處理過的鈦合金片作為工作電極，鉬片為對電極，進行電化學(xué)陽極化處理，在鈦合金基底表面獲得有序的納米管陣列；(4)將上述步驟(3)處理過的鈦合金片在管式爐中采用程序升溫進行熱處理，得到 Pd-TiO2 NTs ；(5 )將上述步驟(4)得到的Pd-TW2 NTs浸于含有50 80 μ mol/L馬心肌紅蛋白pH為7. 0 的磷酸鹽緩沖溶液中20 30h，得到肌紅蛋白自組裝的Pd-TW2 NTs，標(biāo)記為Mb/TiA NTs,即為廣品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟中所述熱處理為按廣5°C/ min的升溫速率升至45(T550°C熱處理3 5h。
3.—種如權(quán)利要求1所述制備方法得到的肌紅蛋白電化學(xué)生物傳感器測定含鹵有機廢水的應(yīng)用，具體步驟為以肌紅蛋白電化學(xué)生物傳感器為工作電極，鉬絲為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，采用恒電位下電流-時間曲線的方法，對有機含鹵廢水進行測定。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述含鹵有機廢水為含有三氯乙酸的廢水。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種合金氧化物納米管陣列上固定的肌紅蛋白電化學(xué)生物傳感器的制備方法及其應(yīng)用。即采用電化學(xué)陽極化的方法，在Ti-Pd合金表面直立向上生長一層高度有序的納米管陣列膜Pd-TiO2NTs，所得到的Pd-TiO2NTs進一步被用來自組裝血紅素類蛋白質(zhì)。這種生物傳感器不僅可以對有機鹵素污染物-三氯乙酸進行快速而靈敏測定，而且所組裝的蛋白質(zhì)不易脫落，具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，壽命比較長。由于本發(fā)明中用于組裝蛋白質(zhì)的基底材料Pd-TiO2NTs電極在原位生長了高催化活性Pd的同時具有高的比表面積，所以Pd-TiO2NTs不但可以組裝大量的蛋白質(zhì)分子，而且具有高的電催化活性，直接導(dǎo)致三氯乙酸測定的靈敏度大大提高。該電極制備工藝簡單、制作成本低廉，具有廣泛的經(jīng)濟和社會效益。
文檔編號B81C1/00GK102353709SQ201110163079
公開日2012年2月15日 申請日期2011年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月17日
發(fā)明者劉梅川, 李明芳, 趙國華 申請人:同濟大學(xué)