金納米簇作為谷胱甘肽熒光探針的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了金納米簇作為谷胱甘肽熒光探針的應(yīng)用，其中，所述金納米簇由以下方法制成：氯金酸和組氨酸在常溫下避光反應(yīng)2–8h，即得金納米簇。本發(fā)明將金納米簇作為谷胱甘肽熒光探針、在谷胱甘肽檢測(cè)和癌細(xì)胞識(shí)別方面的應(yīng)用，可以有效避免半胱氨酸和同型半胱氨酸等各種常見生物分子對(duì)谷胱甘肽檢測(cè)的影響，方法簡(jiǎn)單、檢測(cè)范圍寬和靈敏度高。
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及金納米簇在谷胱甘肽檢測(cè)中的應(yīng)用。 金納米簇作為谷胱甘肽熒光探針的應(yīng)用

【背景技術(shù)】
[0002] 谷胱甘肽是重要的抗氧化劑，也是體內(nèi)含量最多（1 - 15mM)的小分子巰基分子。 它能防止細(xì)胞成分被活性氧（R0S)破壞，同時(shí)谷胱甘肽參與很多生理過程包括異生物質(zhì)代 謝、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)和基因調(diào)控。更重要的是，谷胱甘肽參與調(diào)控癌細(xì)胞死亡，包括凋亡、壞 死和自噬。癌細(xì)胞谷胱甘肽含量的提高能夠引發(fā)癌細(xì)胞對(duì)化療藥物（例如阿霉素）的抗性。 因?yàn)楣入赘孰牡闹匾?，所以需要一種高靈敏、高選擇檢測(cè)谷胱甘肽的方法。
[0003] 熒光檢測(cè)法由于其在研究中不會(huì)破壞樣品、靈敏度高，被人們廣泛采用。Yang等設(shè) 計(jì)了一種基于B0DIPY(氟化硼二吡咯）分子的熒光探針用來檢測(cè)谷胱甘肽，并且應(yīng)用到活 細(xì)胞中檢測(cè)（J Am Chem Soc，2012, 134, 18928)。Yoon等成功合成兩種基于青色素的熒光 探針檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液和活小鼠組織中的谷胱甘肽（J Am Chem Soc，2014, 136, 5351)。
[0004] 除了利用有機(jī)熒光探針檢測(cè)谷胱甘肽，量子點(diǎn)和金屬納米簇也被用于 谷胱甘肽檢測(cè)。利用包括谷胱甘肽的生物巰基分子能夠使"金納米簇-汞離 子"（Langmuir, 2012, 28, 3945)和"碲化鎘/硒化鎘量子點(diǎn)-汞離子"（Anal Chem, 2009, 81，5569)系統(tǒng)熒光恢復(fù)，可以檢測(cè)谷胱甘肽。
[0005] 然而，以上現(xiàn)有技術(shù)檢測(cè)谷胱甘肽的方法復(fù)雜、樣品具有毒性、無法有效區(qū)分半胱 甘酸和同型半胱氨酸對(duì)檢測(cè)谷胱甘肽的干擾等問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的是提供金納米簇作為谷胱甘肽熒光探針 的應(yīng)用，其中，所述金納米簇由以下方法制成：氯金酸和組氨酸在常溫下避光反應(yīng)2-8h， 即得金納米簇。
[0007] 優(yōu)選地，所述氯金酸和組氨酸的摩爾比為1:20 - 1:60。
[0008] 本發(fā)明還提供了金納米簇在谷胱甘肽含量檢測(cè)中的應(yīng)用，其中，所述金納米簇由 以下方法制成：氯金酸和組氨酸在常溫下避光反應(yīng)2 - 8h，即得金納米簇。
[0009] 優(yōu)選地，所述氯金酸和組氨酸的摩爾比為1:20 - 1:60。
[0010] 所述應(yīng)用，包括以下步驟：
[0011] (1)將樣品加入到金納米簇水溶液中，混勻后室溫靜置6 - 48小時(shí)；
[0012] (2)采用熒光分光光度計(jì)測(cè)定金納米簇在414nm激發(fā)時(shí)的熒光發(fā)射光譜，通過與 標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線對(duì)比，即得樣品谷胱甘肽的濃度。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種腫瘤靶向熒光探針，該熒光探針為金納米簇，其由以下方法 制成：氯金酸和組氨酸在常溫下避光反應(yīng)2 - 8h，即得金納米簇。
[0014] 優(yōu)選地，所述氯金酸和組氨酸的摩爾比為1:20 - 1:60。
[0015] 有益效果：本發(fā)明提供了金納米簇作為谷胱甘肽熒光探針、在谷胱甘肽檢測(cè)和癌 細(xì)胞識(shí)別方面的應(yīng)用，可以有效避免半胱氨酸和同型半胱氨酸等各種常見生物分子對(duì)谷胱 甘肽檢測(cè)的影響，方法簡(jiǎn)單、檢測(cè)范圍寬和靈敏度高。此外，由于該金納米簇具有顯著增強(qiáng) 的熒光特性，可有效區(qū)分正常細(xì)胞和癌細(xì)胞，尤其對(duì)肝癌細(xì)胞具有很好的區(qū)分效果。相對(duì)于 現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下突出的優(yōu)勢(shì)：
[0016] (1)該探針的合成方法簡(jiǎn)單，僅需要將氯金酸和組氨酸在室溫下，即可制得，整個(gè) 實(shí)驗(yàn)過程中沒有復(fù)雜的有機(jī)合成、純化、分離等步驟，工藝簡(jiǎn)單。
[0017] (2)該探針不含有毒的重金屬離子。之前的文獻(xiàn)（Langmuir, 2012, 28, 3945 ;Anal Chem，2009, 81，5569)報(bào)道過，用重金屬離子（例如汞離子）將金納米簇或量子點(diǎn)的熒光淬 滅，然后通過重金屬離子和谷胱甘肽的高親和性，恢復(fù)其原有熒光，以這種方法來檢測(cè)谷胱 甘肽。但是很多金屬離子都是有毒的，并通過富集作用引起疾病，因此本發(fā)明方法更加安 全。
[0018] (3)本發(fā)明提供的方法能夠特異地、靈敏地檢測(cè)谷胱甘肽。培養(yǎng)基中的其他常見物 質(zhì)對(duì)谷胱甘肽檢測(cè)造成的影響很小，包括生物巰基分子半胱氨酸、同型半胱氨酸（這兩種 物質(zhì)對(duì)生物體內(nèi)谷胱甘肽檢測(cè)有很大影響），且產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與谷胱甘肽的濃度呈線性 關(guān)系。
[0019] (4)谷胱甘肽能選擇性、特異性地增強(qiáng)由氯金酸和組氨酸混合制得的金納米簇的 熒光，本發(fā)明利用谷胱甘肽能選擇性地增強(qiáng)該金納米簇?zé)晒鈴?qiáng)度的原理，該金納米簇能夠 有效地區(qū)分正常細(xì)胞和癌細(xì)胞，尤其是谷胱甘肽含量最高的肝癌細(xì)胞。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1為金納米簇制備過程及谷胱甘肽增強(qiáng)金納米簇?zé)晒獾臋C(jī)制示意圖；
[0021] 圖2為本發(fā)明制得的金納米簇在加入谷胱甘肽前（A)、加入谷胱甘肽后（C)的透射 電子顯微鏡（TEM)圖、加入谷胱甘肽前（B)的粒徑分布圖、加入谷胱甘肽后（D)的粒徑分布 圖；
[0022] 圖3為加入谷胱甘肽后金納米簇的紫外-可見吸收光譜圖（A) ;365nm紫外光激發(fā) 下不同比例金/谷胱甘肽的樣品的照片圖（B) ;414nm光激發(fā)下不同比例金/谷胱甘肽的樣 品的熒光發(fā)射光譜圖（C);谷胱甘肽濃度與金納米簇?zé)晒鈴?qiáng)度（496nm處）的關(guān)系圖（D);
[0023] 圖4為金納米簇?zé)晒鈱?duì)生物體內(nèi)常見小分子和離子的響應(yīng)；
[0024] 圖5正常肺細(xì)胞（ΑΤΠ )和肺癌細(xì)胞（A549)加入金納米簇前（A&B)和加入100 μ Μ 的金納米簇后（C&D)的共聚焦顯微鏡照片圖；
[0025] 圖6正常肝細(xì)胞（L02)和肝癌細(xì)胞（Hep G2)加入金納米簇前（A&B)和加入100 μ Μ 的金納米簇后（C&D)的共聚焦顯微鏡照片圖。

【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做出進(jìn)一步說明。
[0027] 實(shí)施例1
[0028] 該金納米簇的制備方法，包括以下步驟：5mL 10mM的氯金酸和15mL 100mM的組氨 酸在常溫下避光反應(yīng)2h，得到具有藍(lán)綠色熒光的金納米簇溶液，其TEM結(jié)果見圖2 (A)，粒徑 分布結(jié)果見圖2(B)。其中氯金酸和組氨酸的物質(zhì)的量比為1:30。
[0029] 實(shí)施例2
[0030] 該金納米簇的制備方法，包括以下步驟：5mL 10mM的氯金酸和10mL 100mM的組氨 酸在常溫下避光反應(yīng)8h，得到具有藍(lán)綠色熒光的金納米簇溶液，其TEM結(jié)果與實(shí)施例1 一 致。其中氯金酸和組氨酸的物質(zhì)的量比為1:20。
[0031] 實(shí)施例3
[0032] 該金納米簇的制備方法，包括以下步驟：0. 25mL 10mM的氯金酸和1. 5mL 100mM的 組氨酸在常溫下避光反應(yīng)5h，得到具有藍(lán)綠色熒光的金納米簇溶液，其TEM結(jié)果與實(shí)施例1 一致。其中氯金酸和組氨酸的物質(zhì)的量比為1:60。
[0033] 實(shí)施例4
[0034] 包含谷胱甘肽的金納米簇的制備方法，包括以下步驟：
[0035] lmL 10mM的氯金酸和3mL lOOmM的組氨酸在常溫下避光反應(yīng)4h，得到具有藍(lán)綠色 熒光的金納米簇溶液。其中氯金酸和組氨酸的物質(zhì)的量比為1:30。
[0036] 加入4mL 15mM的谷胱甘肽水溶液，混合后靜置12h。其中金/谷胱甘肽的物質(zhì)的 量比為1:6。
[0037] 其透射電子顯微鏡結(jié)果見圖2(C)，粒徑分布結(jié)果見圖2(D);
[0038] 其紫外-可見吸收光譜圖見圖3(A);
[0039] 其365nm紫外光激發(fā)下不同比例金/谷胱甘肽的樣品的照片圖見圖3(B);
[0040] 其414nm光激發(fā)下不同比例金/谷胱甘肽的樣品的熒光發(fā)射光譜圖見圖3 (C)。
[0041] 實(shí)施例5
[0042] 包含谷胱甘肽的金納米簇的制備方法，包括以下步驟：
[0043] lmL 10mM的氯金酸和3mL lOOmM的組氨酸在常溫下避光反應(yīng)4h，得到具有藍(lán)綠色 熒光的金納米簇溶液。其中氯金酸和組氨酸的物質(zhì)的量比為1:30。
[0044] 加入4mL 30mM的谷胱甘肽水溶液，混合后靜置12h。其中金/谷胱甘肽的物質(zhì)的 量比為1:12。
[0045] 其TEM圖、紫外-可見吸收光譜圖、365nm紫外光激發(fā)下不同比例金/谷胱甘肽的 樣品的照片圖、414nm光激發(fā)下不同比例金/谷胱甘肽的樣品的熒光發(fā)射光譜圖與實(shí)施例4 一致。
[0046] 實(shí)施例6
[0047] 包含谷胱甘肽的金納米簇的制備方法，包括以下步驟：
[0048] lmL 10mM的氯金酸和3mL lOOmM的組氨酸在常溫下避光反應(yīng)4h，得到具有藍(lán)綠色 熒光的金納米簇溶液。其中氯金酸和組氨酸的物質(zhì)的量比為1:30。
[0049] 加入4mL 2. 5mM的谷胱甘肽水溶液，混合后靜置48h。其中金/谷胱甘肽的物質(zhì)的 量比為1: 1。
[0050] 其TEM圖、紫外-可見吸收光譜圖、365nm紫外光激發(fā)下不同比例金/谷胱甘肽的 樣品的照片圖、414nm光激發(fā)下不同比例金/谷胱甘肽的樣品的熒光發(fā)射光譜圖與實(shí)施例4 一致。
[0051] 實(shí)施例7
[0052] 包含谷胱甘肽的金納米簇的制備方法，包括以下步驟：
[0053] lmL 10mM的氯金酸和3mL lOOmM的組氨酸在常溫下避光反應(yīng)4h，得到具有藍(lán)綠色 熒光的金納米簇溶液。其中氯金酸和組氨酸的物質(zhì)的量比為1:30。
[0054] 加入4mL 80mM的谷胱甘肽水溶液，混合后靜置6h。其中金/谷胱甘肽的物質(zhì)的量 比為1:32。
[0055] 其TEM圖、紫外-可見吸收光譜圖、365nm紫外光激發(fā)下不同比例金/谷胱甘肽的 樣品的照片圖、414nm光激發(fā)下不同比例金/谷胱甘肽的樣品的熒光發(fā)射光譜圖與實(shí)施例4 一致。
[0056] 實(shí)施例8
[0057] 制備包含不同比例金/谷胱甘肽的金納米簇的方法，包括以下步驟：
[0058] (1)制備一組混合液：將0· 25mL10mM的氯金酸和0· 75mL100mM的組氨酸，在常溫 下避光反應(yīng)4h ;
[0059] (2)取5份步驟⑴的混合液，分別加入lmL濃度分別為3. 75mM、7. 5mM、15mM、30mM 和60mM的谷胱甘肽水溶液，搖晃后室溫靜置12h后，用365nm紫外燈激發(fā)，得到如圖3 (B) 的熒光照片圖；
[0060] (3)取9份步驟⑴的混合液稀釋25倍，取稀釋后的混合液lmL，分別加入lmL不 同濃度的谷胱甘肽水溶液（其中，谷胱甘肽含量依次為〇, 50,100,150, 200, 300,600,1200 和2400 μ M)，搖晃后靜置12h ;用熒光分光光度計(jì)測(cè)定這些樣品的熒光發(fā)射光譜圖，激發(fā)波 長(zhǎng)為414nm，結(jié)果見圖3(C)。圖3(D)為按照?qǐng)D3(C)方法制得的包含不同谷胱甘肽濃度的 金納米簇樣品在496nm處的相對(duì)熒光發(fā)射光譜強(qiáng)度變化值。
[0061] 標(biāo)準(zhǔn)曲線：
[0062] 谷胱甘肽為50 - 150 μ Μ時(shí)，擬合直線為：
[0063] Λ 1/1。= -3. 66+0. 0732 X [谷胱甘肽](R2 = 0· 9945);
[0064] 其檢測(cè)限為4. 1 μ Μ(信噪比為3);
[0065] 谷胱甘肽為150 - 1200 μ Μ時(shí)，擬合直線為：
[0066] Λ 1/1。= 2. 17+0. 0301 X [谷胱甘肽](R2 = 0· 9982);
[0067] 其檢測(cè)限為10. 0 μ Μ。
[0068] 其中，[谷胱甘肽]表示谷胱甘肽的濃度，單位為μ Μ。
[0069] 實(shí)施例9
[0070] 分別將lmL 100 μ Μ金納米簇與lmL 1200 μ Μ谷氨酸、甘氨酸、同型半胱氨酸、色氨 酸、精氨酸、賴氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、二硫蘇糖醇、葡萄糖、鉀離子、鈉離子、鈣離子和谷 胱甘肽混合，常溫避光孵育12h。
[0071] 測(cè)量它們用414nm激發(fā)下、496nm發(fā)射處的熒光光譜，結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示，谷氨 酸、甘氨酸、同型半胱氨酸、色氨酸、精氨酸、賴氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、二硫蘇糖醇、葡萄 糖、鉀離子、鈉離子、鈣離子對(duì)金納米簇的熒光強(qiáng)度影響不大，而谷胱甘肽能夠大大增強(qiáng)金 納米簇的熒光強(qiáng)度。
[0072] 實(shí)施例10
[0073] 分別將100 μ Μ的金納米簇與正常肺細(xì)胞ATII和肺癌細(xì)胞A549共同孵育24h。
[0074] 圖5分別顯示了 ：共聚焦顯微鏡觀察ΑΤΠ 細(xì)胞未加入金納米簇（Α)、ΑΤΠ 細(xì)胞加 入金納米簇（C)和Α549細(xì)胞未加入金納米簇（Β)、Α549細(xì)胞加入金納米簇（D)的結(jié)果。
[0075] 結(jié)果顯示：該金納米簇能夠作為腫瘤靶向熒光探針。
[0076] 因?yàn)榘┘?xì)胞中的谷胱甘肽含量一般遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞中的含量。因此，常見癌細(xì)胞 (如肺癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞），均可在405nm激發(fā)的共聚焦顯微鏡觀察中出現(xiàn)綠色熒光亮點(diǎn)。 尤其是肝癌細(xì)胞，由于其谷胱甘肽含量比其他類型細(xì)胞高很多，因此綠色熒光亮點(diǎn)出現(xiàn)最 多，成像效果最好。
[0077] 實(shí)施例11
[0078] 將分別將100 μ Μ的金納米簇與正常肝細(xì)胞L02和肝癌細(xì)胞Η印G2共同孵育24h。
[0079] 圖6分別顯示了 ：共聚焦顯微鏡觀察L02細(xì)胞未加入金納米簇（A)、L02細(xì)胞加入 金納米簇（C)和Η印G2細(xì)胞未加入金納米簇（B)、Η印G2細(xì)胞加入金納米簇（D)的結(jié)果。
[0080] 結(jié)果顯示：該金納米簇能夠作為腫瘤靶向熒光探針。
【權(quán)利要求】
1. 金納米簇作為谷胱甘肽熒光探針的應(yīng)用，其特征在于：所述金納米簇由以下方法制 成：氯金酸和組氨酸在常溫下避光反應(yīng)2 - 8h，即得金納米簇。
2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述氯金酸和組氨酸的摩爾比為1:20 -1:60。
3. 金納米簇在谷胱甘肽含量檢測(cè)中的應(yīng)用，其特征在于：所述金納米簇由以下方法制 成：氯金酸和組氨酸在常溫下避光反應(yīng)2 - 8h，即得金納米簇。
4. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：所述氯金酸和組氨酸的摩爾比為1:20 -1:60。
5. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：包括以下步驟： (1) 將樣品加入到金納米簇水溶液中，混勻后室溫靜置6 - 48小時(shí)； (2) 采用熒光分光光度計(jì)測(cè)定金納米簇在414nm激發(fā)時(shí)的熒光發(fā)射光譜，通過與標(biāo)準(zhǔn) 回歸曲線對(duì)比，即得樣品谷胱甘肽的濃度。
6. -種腫瘤靶向熒光探針，其特征在于：該熒光探針為金納米簇，其由以下方法制成： 氯金酸和組氨酸在常溫下避光反應(yīng)2 - 8h，即得金納米簇。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的腫瘤靶向熒光探針，其特征在于：所述氯金酸和組氨酸的摩 爾比為 1:20 - 1:60。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK104101584SQ201410261543
【公開日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2014年6月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月12日
【發(fā)明者】吳富根, 張曉東, 陳戰(zhàn) 申請(qǐng)人:東南大學(xué)