專利名稱：納米金作為葡萄糖氧化酶的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測(cè)葡萄糖的方法，具體涉及利用納米金作為葡萄糖氧化酶的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著糖尿病人越來越多，葡萄糖檢測(cè)技術(shù)目前被廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)中。目前，普遍被應(yīng)用的葡萄糖檢測(cè)方法主要包括兩大類酶學(xué)比色法和電化學(xué)法。電化學(xué)法檢測(cè)比較 靈敏，但是需要專門儀器即電極和電化學(xué)工作站，不便于檢測(cè)。酶學(xué)比色法應(yīng)用的較多，且 被制成試紙條用于便攜檢測(cè)，但由于這個(gè)反應(yīng)體系中用到了酶聯(lián)反應(yīng)，而生物酶需要一定 的反應(yīng)條件且很容易失活，所以保存時(shí)必須注意到維持兩種酶的活性。為了提高生物酶的穩(wěn)定性，增強(qiáng)酶活性，提高酶的反應(yīng)效率，有很多文獻(xiàn)常使 用固定化酶技術(shù)來改善酶的活性及保存條件。Jianhong Liu (Langmuir2009, 25 (23), 13456-13460)等合成了一種新型的復(fù)合物，將葡萄糖氧化酶固定在復(fù)合物表面，在增強(qiáng)酶 活性的同時(shí)，也提高了酶的穩(wěn)定性。Pratibha Pandey (Langmuir 2007，23 (6)，3333-3337) 等在這個(gè)反應(yīng)體系中引入了納米材料，通過化學(xué)鍵將葡萄糖氧化酶固定在納米金表面，增 強(qiáng)酶活性，提高了穩(wěn)定性，且增強(qiáng)了酶對(duì)溫度和PH的耐受性。還有一些文獻(xiàn)中，引入了量子 點(diǎn)、Fe3O4等納米材料。但是上述方法只是通過在反應(yīng)體系中引入其他物質(zhì)，利用固定化酶技術(shù)提高了酶 的活性，并沒有從根本上解決問題，酶的活性還是受到一系列因素的制約，如溫度、PH、保存 條件等，且在反應(yīng)體系中弓I入其他物質(zhì)后，使整個(gè)體系變得更復(fù)雜。本發(fā)明力求從根本上解 決生物酶的劣勢(shì)，制備出一種穩(wěn)定性高，反應(yīng)容易進(jìn)行，保存方便，成本較低的“納米酶”。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的問題在于在葡萄糖的檢測(cè)中，將納米金作為葡萄糖氧化酶的應(yīng) 用，以克服傳統(tǒng)的生物酶在反應(yīng)條件及保存上的種種問題，制備出一種穩(wěn)定性高，不需要特 定的反應(yīng)條件，易于保存，成本較低的“納米酶”，應(yīng)用于葡萄糖的檢測(cè)。本發(fā)明的技術(shù)方案如下納米金作為葡萄糖氧化酶的應(yīng)用，其中，將粒徑為10nm-20nm的納米金與葡萄糖 反應(yīng)，加入過氧化物酶及顯色物質(zhì)，以檢測(cè)葡萄糖。所述納米金的粒徑為13nm，所述納米金的溶度為17nM。所述的納米金的制備方法包括取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 % HAuCl4溶液1. 7ml和48. 3ml的 超純水混合并加熱攪拌；在完全沸騰后，加入5ml的11. 6mg/ml的檸檬酸三鈉；停止加熱后 繼續(xù)攪拌，冷卻；靜置后過濾得到納米金顆粒。所述納米金與葡萄糖反應(yīng)的溫度為0°C -70°c，優(yōu)選為55_70°C。所述納米金與葡 萄糖反應(yīng)的酸堿度為PH2. 0-9. 0，優(yōu)選為pH2-4或pH7_9。所述過氧化物酶是辣根過氧化物酶。本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于
1、本發(fā)明中制備的納米金，制備方法簡(jiǎn)便且快速、原料易得、成本較低、可重復(fù)性
尚ο2、本發(fā)明中制得的納米金的葡萄糖氧化酶活性與傳統(tǒng)的葡萄糖氧化酶相當(dāng)，對(duì)葡 萄糖的親和力相差不大。3、本發(fā)明中制得的納米金對(duì)反應(yīng)溫度和反應(yīng)pH沒有特殊的要求。4、本發(fā)明中制得的納米金與傳統(tǒng)的葡萄糖氧化酶相比，具有很高的穩(wěn)定性，能在 室溫下保存。



圖1為不同粒徑納米金的催化活性。圖2為比較本發(fā)明中的納米材料與傳統(tǒng)的葡萄糖氧化酶對(duì)葡萄糖親和力的大小。圖3為比較本發(fā)明中的納米金與傳統(tǒng)葡萄糖氧化酶對(duì)反應(yīng)溫度的要求。圖4為比較本發(fā)明中的納米金與傳統(tǒng)葡萄糖氧化酶對(duì)反應(yīng)pH的要求。圖5為比較本發(fā)明中的納米金與傳統(tǒng)葡萄糖氧化酶的穩(wěn)定性。
具體實(shí)施例方式
下面用實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。1、納米金的制備試劑包括氯金酸購自Sigma公司，分析純的檸檬酸三鈉購自國藥化學(xué)試劑有限公司。制備過程包括以下幾個(gè)步驟(1)取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為HAuCl4溶液1. 7ml和48. 3ml的超純(MilliQ)水倒入蒸餾 瓶?jī)?nèi)，設(shè)置加熱溫度開始加熱，并將轉(zhuǎn)速調(diào)至200r/min ；其中，加熱溫度為120-130°C，目的 是將氯金酸溶液加熱。(2)在完全沸騰后，將轉(zhuǎn)速調(diào)至400r/min，并加入5ml的11. 6mg/ml的檸檬酸三 鈉；在高溫下能將氯金酸還原而生成納米金，在加入檸檬酸三鈉后可以觀察到溶液顏色從 無色變黑_褐色-紫色，最后為紫紅色。(3)加熱20分鐘后，停止加熱，繼續(xù)攪拌半個(gè)小時(shí)，冷卻至室溫，防止粒徑不均一。(4)靜置12小時(shí)后，用0. 22um濾膜過濾除去反應(yīng)中的一些雜質(zhì)，得到粒徑比較均 一的濃度為17nM、粒徑為13nm的納米金。其中值得注意的是，HAuCl4溶液與超純水、檸檬酸三鈉的比例是固定的。三者之間 特定的比例用于制備特定粒徑、特定濃度的納米金。合成的納米金的粒徑經(jīng)過AFM或者TEM 表征。其中，不同粒徑納米金的催化活性如圖1所示。其中，納米金的粒徑優(yōu)選為 10nm_20nmo2、檢測(cè)葡萄糖試劑包括葡萄糖氧化酶、辣根過氧化物酶及顯色物質(zhì)2，2_聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻 唑-6-磺酸)ABTS均購自Sigma公司，分析純的葡萄糖購自國藥化學(xué)試劑有限公司。
檢測(cè)葡萄糖的過程包括如下幾個(gè)步驟(1)將 17nM 納米金 15ul 與 0. 2M 葡萄糖 30ul 在 37°C反應(yīng) 30min ；(2)在上述溶液中加入l(T2mg/ml辣根過氧化物酶5ul及顯色物質(zhì)ABTS(0. 1M， pH5. 0)；(3) IOmin后觀察顯色，測(cè)410nm處的吸光值。此檢測(cè)過程簡(jiǎn)單易行，重復(fù)性強(qiáng)。本發(fā)明的納米金與傳統(tǒng)的葡萄糖氧化酶對(duì)葡萄 糖親和力的大小的比較如圖2所示。其中，步驟(1)是納米金將葡萄糖催化產(chǎn)生葡萄糖酸和過氧化氫。用納米金代替 傳統(tǒng)的檢測(cè)體系中的生物酶，在反應(yīng)條件和穩(wěn)定性上都具有很大的優(yōu)勢(shì)。其中，步驟(2)是在有過氧化氫的存在下，辣根過氧化物酶將還原態(tài)的顯色物質(zhì) 氧化而顯色，在410nm處有吸光值。3、納米金的反應(yīng)條件的探究試劑包括EDTA、三乙胺、羥胺、鹽酸、三氯化鐵、三氯乙酸均購自國藥化學(xué)試劑有限公司。將上述試劑配制成如下溶液溶液一5福 EDTA+0. ΙδΜ 三乙胺溶液二3M NH2OH溶液三1MHC1+0. IM FeC13+0. 25M CCl3COOH反應(yīng)溫度的探究將17nM納米金15ul和2*10_3mg/ml葡萄糖氧化酶5ul分別與0. 2M葡萄糖30ul 混合后分別放置于調(diào)節(jié)至不同溫度(0°C-7(TC)的水浴鍋，反應(yīng)30min后，進(jìn)行顯色，探究 不同反應(yīng)溫度對(duì)此反應(yīng)的影響。由此實(shí)施例結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葡萄糖氧化酶在不同溫度下的活性呈現(xiàn)“鐘罩型”特征，即 溫度過高或過低，其活性都受到影響，溫度過低時(shí)活性受到抑制，溫度過高時(shí)葡萄糖氧化酶 又將失活，其最適反應(yīng)溫度為37°C。而對(duì)于納米金，隨著溫度的升高，其催化活性越高，在 葡萄糖氧化酶失活時(shí)，納米金仍具有很高的活性，說明納米金對(duì)反應(yīng)溫度沒有特殊要求，在 0-70°C都催化葡萄糖氧化，其中溫度優(yōu)選為55-70°C。反應(yīng)pH的探究將Iml納米金(13nm、17nM)濃縮后除去上清，加入不同pH(2. 0-9. 0)的緩沖液 PBS (稀釋10倍至濃度為IOOmM) IOOul，再加入IM葡萄糖40ul，反應(yīng)30min后，檢測(cè)產(chǎn)生的葡 萄糖酸，即加入250ul溶液一和25ul溶液二，反應(yīng)15min，再加入125ul溶液三，反應(yīng)5min， 測(cè)505nm處的吸收。葡萄糖氧化酶(10ul，lmg/ml) +不同pH的緩沖液(稀釋10倍至濃度為IOOmM) (90ul)，再加入IM葡萄糖40ul，反應(yīng)30min后，檢測(cè)產(chǎn)生的葡萄糖酸，即加入250ul溶液一 和25ul溶液二，反應(yīng)15min，再加入125ul溶液三，反應(yīng)5min，測(cè)505nm處的吸收。由此實(shí)施例結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葡萄糖氧化酶在不同pH下的活性也呈現(xiàn)“鐘罩型”特征，即PH過高或過低，其活性都受到影響，其最適反應(yīng)pH為4. 0-6. O。而對(duì)于納米金，在不同的反 應(yīng)PH條件下都能正常進(jìn)行反應(yīng)，在葡萄糖氧化酶不能起催化作用時(shí)，納米金仍具有很高的 活性，說明納米金對(duì)反應(yīng)PH沒有特殊要求，能在較寬的反應(yīng)pH條件(2. 0-9. 0)下正常氧化葡萄糖，其中優(yōu)選PH2-4或pH7-9。4、納米金的穩(wěn)定性及保存將納米金和傳統(tǒng)的葡萄糖氧化酶分別置于4°C和室溫下放置12小時(shí)和放置24小時(shí)后，檢測(cè)葡萄糖氧化酶和納米金的氧化活性，即(1)與葡萄糖反應(yīng)30min ； (2)在上述溶液 中加入辣根過氧化物酶及顯色物質(zhì)；(3) IOmin后觀察顯色，測(cè)410nm處的吸光值。從此實(shí)施例的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葡萄糖氧化酶在4°C下保存，基本能維持活性，但是在室 溫下放置12小時(shí)后，活性喪失一半，24小時(shí)后，基本已經(jīng)沒有活性，而納米金能在4°C保存， 也能在室溫下保存，24h后仍能維持活性。納米材料在保存上占有優(yōu)勢(shì)。由以上實(shí)施例的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葡萄糖氧化酶在反應(yīng)溫度、反應(yīng)PH和保存上均受到很 大的制約，而由于納米材料的一些特殊性質(zhì)，使得本說明中的納米金的葡萄糖氧化酶活性 對(duì)反應(yīng)溫度和反應(yīng)PH沒有什么特殊的要求，由于納米材料的穩(wěn)定性，使得納米金能在室溫 下保存，并且仍能保持很高的活性，克服了傳統(tǒng)的生物酶的種種劣勢(shì)，同時(shí)有具有較高的葡 萄糖氧化酶活性，基本與葡萄糖氧化酶相當(dāng)。本發(fā)明中提供的納米金與昂貴的生物酶相比，制備方便、經(jīng)濟(jì)可行，且納米金作為 葡萄糖氧化酶的應(yīng)用的檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單，保存方便。以上所述的，是根據(jù)本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非用以限定本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的 上述實(shí)施例還可以做出各種變化。即凡是依據(jù)本發(fā)明申請(qǐng)的權(quán)利要求書及說明書內(nèi)容所作 的簡(jiǎn)單、等效變化與修飾，皆落入本發(fā)明的權(quán)利要求保護(hù)范圍。本發(fā)明未詳盡描述的技術(shù)內(nèi) 容為本領(lǐng)域技術(shù)人員的公知常識(shí)。
權(quán)利要求
納米金作為葡萄糖氧化酶的應(yīng)用，其特征在于，將粒徑為10nm-20nm的納米金與葡萄糖反應(yīng)，加入過氧化物酶及顯色物質(zhì)，以檢測(cè)葡萄糖。
2.如權(quán)利要求1所述的納米金作為葡萄糖氧化酶的應(yīng)用，其特征在于，所述納米金的 粒徑為13nm。
3.如權(quán)利要求1或2所述的納米金作為葡萄糖氧化酶的應(yīng)用，其特征在于，所述納米金 的溶度為17nM。
4.如權(quán)利要求3所述的納米金作為葡萄糖氧化酶的應(yīng)用，其特征在于，所述的納米金 的制備方法包括取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為HAuC14溶液1. 7ml和48. 3ml的超純水混合并加熱攪拌；在完全沸騰后，加入5ml的11. 6mg/ml的檸檬酸三鈉；加熱20 30分鐘后停止，并繼續(xù)攪拌，冷卻；靜置后過濾得到納米金顆粒。
5.如權(quán)利要求1所述的納米金作為葡萄糖氧化酶的應(yīng)用，其特征在于，所述納米金與 葡萄糖反應(yīng)的溫度為0°C -70°C。
6.如權(quán)利要求5所述的納米金作為葡萄糖氧化酶的應(yīng)用，其特征在于，所述反應(yīng)的溫 度優(yōu)選為55°C -70°C。
7.如權(quán)利要求1所述的納米金作為葡萄糖氧化酶的應(yīng)用，其特征在于，所述納米金與 葡萄糖反應(yīng)的酸堿度為PH2. 0-9. 0。
8.如權(quán)利要求7所述的納米金作為葡萄糖氧化酶的應(yīng)用，其特征在于，所述反應(yīng)的酸 堿度優(yōu)選為PH2-4或pH7-9。
9.如權(quán)利要求1所述的納米金作為葡萄糖氧化酶的應(yīng)用，其特征在于，所述過氧化物 酶是辣根過氧化物酶。
全文摘要
本發(fā)明所要解決的問題在于克服傳統(tǒng)的葡萄糖氧化酶在反應(yīng)條件及保存上的種種劣勢(shì)。本發(fā)明提供納米金作為葡萄糖氧化酶的應(yīng)用，具體包括將納米金與葡萄糖反應(yīng)30min；在上述溶液中加入辣根過氧化物酶及顯色物質(zhì)；10min后觀察顯色，測(cè)410nm處的吸光值。本發(fā)明中提供的納米金與昂貴的葡萄糖氧化酶相比，制備方便、經(jīng)濟(jì)可行，對(duì)反應(yīng)溫度和反應(yīng)pH沒有特殊的要求，且與傳統(tǒng)的葡萄糖氧化酶相比，具有很高的穩(wěn)定性，能在室溫下保存。
文檔編號(hào)C12Q1/54GK101832997SQ20101015606
公開日2010年9月15日 申請(qǐng)日期2010年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月23日
發(fā)明者李江, 李迪, 樊春海, 蘇邵, 駱偉潔, 黃慶 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所